一種CpG寡核苷酸及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及癌癥基因診斷和基因治療領域，尤其涉及一種CpG寡核苷酸及其應 用。
【背景技術】
[0002] 現有技術中已經研宄并闡明白血病等癌癥發病的原理和病因。癌癥發病有以下步 驟：1，致病基因 V-erbB突變/擴增；2,其調芐基因缺失/失活；3,癌變基因 TS擴增。骨髓 等組織干細胞從只有致病基因突變/擴增的癌前干細胞，發展為擁有致病基因和癌變基因 雙擴增的癌干細胞；4,癌干細胞表面多個生長因子受體與其微環境中多種生長因子間的互 動，推動癌干細胞集落向癌瘤發展；5,在轉化生長因子及其受體等因素介導下發生癌瘤細 胞侵潤和轉移，并形成新部位的癌瘤。

【發明內容】

[0003] 本發明的目的在于提供一種CpG寡核苷酸，強化反基因 V-erbB寡核苷酸的治療作 用，從而治療高危MDS和原位癌。
[0004] 本發明提供的CpG寡核苷酸，
[0005] 其序列如下：
[0006] 5 'GGC CGC CGC GAC CCC GCC 3'
[0007] 反基因 V-erbB寡核苷酸則有如下序列：
[0008] 5' ATG GCA GAG CTG GCA AAC 3'。
[0009] 進一步地，應用含有上述序列的CpG寡核苷酸，經硫代修飾后單獨或聯合反基因 V-erbB寡核苷酸制備成各種藥用劑型，用于白血病和腫瘤的治療。
[0010] 與現有技術相比較，本發明的有益效果在于：本發明的CpG寡核苷酸強化反基因 V-erbB寡核苷酸的治療作用。
【附圖說明】
[0011] 圖1為本發明的使用適應癥MDS疾病發展演進圖。
【具體實施方式】
[0012] 本發明實施例的CpG寡核苷酸，強化反基因 V-erbB寡核苷酸的治療作用，從而治 療高危MDS和原位癌；
[0013] 其序列如下：
[0014] 5 'GGC CGC CGC GAC CCC GCC 3'
[0015] 反基因 V-erbB寡核苷酸則有如下序列：
[0016] 5, ATG GCA GAG CTG GCA AAC 3，。
[0017] 本發明實施例，應用含有上述序列的CpG寡核苷酸，經硫代修飾后單獨或聯合反 基因 V-erbB寡核苷酸制備成各種藥用劑型，用于白血病和腫瘤的治療。
[0018] 實施例1 :本發明的CpG寡核苷酸在大鼠 MDS基因治療中的應用。
[0019] 請參閱表3所示，聯合應用兩種寡核苷酸治療MDS，顯效時間明顯縮短，從單用反 基因寡核苷酸治療后2-3月縮短為7-10天。甚至可治愈紅白血病。
[0020] 圖1為本發明使用適應癥MDS疾病發展演進圖：本圖顯示MDS-RA發展白血病的過 程。難治性貧血（RA)可單獨用反基因 V-erbB寡核苷酸治療，而高危MDS則必須聯合CpG寡 核苷酸治療，急性白血病（AL)則用本研宄發明的晚期癌治療策略作治療。早期RA，則應用 本研宄另一項發明的V-erbB PCR基因診斷試劑盒作癌前基因診斷，而后用反基因 V-erbB 寡核苷酸治療。其它腫瘤的早期診斷和治療原則上適用上述模式。
[0021] 一、動物模型：
[0022] 應用二甲基苯蒽（DMBA)誘發Wistar大鼠 MDS。所用劑量為35mg/kg，每周1次， 共計3次，3-4個月后發生MDS或白血病，少數發生肉瘤。并證明它與人類MDS和白血病有 相同的C-erbB重排/擴增以及N-ras點突變。大鼠 MDS包括RA、RAEB和RAEBT三個亞型。 難治性貧血（RA)可發展為原始和早幼粒細胞增多的RA，即RAEB和轉化中的RAEB，即RAEBT 和白血病（AL)。主要依據大鼠股骨骨髓原始和早幼粒細胞百分比來判斷。采用大鼠 MDS進 行基因治療研宄，其突出優點是大鼠可以在活體情況下作治療前后多次骨髓穿刺而不必殺 死動物。這是小鼠模型作不到的。
[0023] 二、給藥方法：
[0024] 1.尾靜脈注射：用3 %巴比妥鈉注射液0. 3-0. 5ml腹腔注射，將MDS大鼠麻醉以便 作尾靜脈注射。使用前用無菌生理鹽水溶解上述寡核苷酸粉針劑備用。劑量（D)為0. 56mg/ kg/天（IxD)或0· 28mg/kg/天（0· 5xD)。連續給藥3天為一個療程。2-3個月后作骨髓穿 刺，檢查骨髓象變化并觀察療效。觀察和診斷指標參照人類MDS診斷和分類標準進行。
[0025] 2. 口服給藥：根據MDS大鼠日平均飲水量，將反基因 V-erbB寡核苷酸溶解于自來 水中供其飲用，并照常喂養。劑量為〇.56mg/kg/天，連續飲用3天為一個療程。觀察和判 斷療效標準同上。
[0026] 三、結果
[0027] 1、尾靜脈注射給藥治療
[0028] 以IxD和0. 5xD兩個劑量治療17只大鼠 MDS，并以8只大鼠 MDS為空白對照。發 現在2-3個月觀察期內，17只治療鼠骨髓原始和早幼粒細胞％均有下降（表1)，原始和早 幼粒細胞從平均9. 6%下降到3. 6% (P < 0. 01)。其中94. 1% (16/17)骨髓象恢復正常或 接近正常（表2)。治療觀察期動物體重平均增加98克，且生育能力完好。空白對照組8只 MDS中，3只從RA發展為RAEB，4只死于內臟出血，未見MDS逆轉為正常者。
[0029] 表1基因治療前后MDS大鼠骨髓形態觀察
[0030]
[0032] *這只大鼠觀察期間死于炎癥；**這只大鼠發生肉瘤并轉移到骨髓，A-4大鼠基因 治療后原始+早幼粒細胞百分比沒達到正常水平。
[0033] 2、口服給藥治療
[0034] 以1XD、0. 5XD和0. 25XD三種劑量分別對14只大鼠 MDS進行治療。在相同的 觀察期內，僅IxD劑量組8只MDS有效，其余2個劑量組均無效，請結合圖1所示。
[0035] 3、復方韋爾柏反基因寡核苷酸治療：
[0036] 以上2種治療均以單方韋爾柏（V-erbB)反基因寡核苷酸進行治療。為了探討免 疫刺激劑即CpG寡核苷酸在治療中的作用，我們將上述兩種寡核苷酸聯合應用，對3只大鼠 進行治療，其結果見表3。從表3可見，聯合應用治療MDS，顯效時間明顯縮短。復方對MDS 和AEL有效，但對AML無效。
[0037] 表2 33只大鼠 MDS基因治療方案和結果
[0038]
[0039] *A組治療后8-12個月未見MDS復發或發展為白血病。
[0040] 表3復方韋爾柏注射液治療結果
[0041]
[0043] G =粒系E =紅系RAEB :原始細胞增多型RA(難治性貧血）
[0044] AEL :急性紅白血病、AML急性髓細胞白血病。AEL可發展為AML
[0045] 實施例2 :本發明的CpG寡核苷酸在高發區食管癌早期基因治療中的應用：
[0046] -、病例：河北省磁縣食管癌高發區食管上皮非典型增生患者41例原位癌5例。 均為普查時可疑患者在內規鏡下咬取組織經食管碘染后病理確診。
[0047] 二、治療方法：非典型增生患者采用反基因 V-erbB寡核苷酸（ODN)治療（第一方 案），原位癌用反基因 V-erbB寡核苷酸（ODN)聯合CpG寡核苷酸治療（第二方案）。
[0048] 寡核苷酸的配制：每支EP管內裝有ODN粉末10單位，-20C冷凍保存。使用之前 用1毫升無菌生理鹽水溶解備用。
[0049] 使用方法：于內規鏡下向病變部位噴灑0. 3毫升，隔日1次，連續三次為一個療程。 治療之后2小時內禁食禁飲。1-2個月后內規鏡下復查，取用藥后病變部位上皮組織少許， 進行病理檢查和療效判斷。治療后5年復查，對每位患者行食管內規鏡及病理檢查。療效 判斷標準：病理學上將食管上皮分為正常，單純性增生，非典型增生（包括輕度，中度和重 度增生3種），原位癌和侵潤癌。患者用藥后由中度或重度增生逆轉為輕度增生后正常者為 有效，保持不變者為無效。從中度重度增生轉為原位癌者為癌性進展。
[0050] 三、治療效果：41例食管非典型增生患者，應用第一方案治療，33例有效，有效率 80. 5%，8例無效，其中癌性進展1例。與此同時應用第二方案治療5例原位癌，3例有效， 轉為重度增生，輕度增生，輕度食管炎各一例。1-2個月后第一次隨訪，非典型增生患者僅 兩例復發。表明一個療程治療，多數患者療效鞏固。治療后5年復查結果，41例非典型增 生患者返回醫院接受復查19例。經過治療重中度增生患者由原來15例減為3例，有效率 80% (12/15)，與治療后1-2個月復查結果相同；無重度增生者。19例中已有16例趨于正 常。因其治療已過5年，故而認定為疫愈，疫愈率84. 2%。原位癌治療4例2例有效。復查 中發現1例原來診斷有誤，應診斷為原位癌且療效明顯，現在診斷為輕度食管炎，說明其原 位癌已痊愈。因此，原位癌有效率為60%。
[0051] 以上所述僅為本發明的較佳實施例，對發明而言僅僅是說明性的，而非限制性的。 本專業技術人員理解，在發明權利要求所限定的精神和范圍內可對其進行許多改變，修改， 甚至等效，但都將落入本發明的保護范圍。
【主權項】
1. 一種CpG寡核苷酸的應用，其特征在于，其與反基因V-erbB寡核苷酸配合，強化后者 的治療作用，從而有效治療高危MDS和原位癌； 其序列如下： 5'GGCCGCCGCGACCCCGCC3' 反基因V-erbB寡核苷酸則有如下序列： 5'ATGGCAGAGCTGGCAAAC3'。2. 根據權利要求1所述的CpG寡核苷酸的應用，其特征在于，應用含有上述序列的CpG 寡核苷酸，經硫代修飾后單獨或聯合反基因V-erbB寡核苷酸制備成各種藥用劑型，用于白 血病和腫瘤的治療。
【專利摘要】本發明涉及一種CpG寡核苷酸及其應用，將其與反基因V-erbB寡核苷酸聯合應用，能強化后者的治療作用，從而有效治療高危MDS和原位癌。
【IPC分類】C12N15/117, A61P35/02, A61K31/7088, A61K48/00, A61P35/00
【公開號】CN104928296
【申請號】CN201510076090
【發明人】馮寶章
【申請人】馮寶章
【公開日】2015年9月23日
【申請日】2015年2月13日