專利名稱：Prkcbp2基因第一號外顯子多態性的制作方法
技術領域：
本發明涉及PRKCBP2基因第一號外顯子的單核苷酸多態性。本發明還涉及分析PRKCBP2基因第一號外顯子的等位基因突變的方法。
背景技術：
PRKCBP2，即蛋白激酶C結合蛋白2(Protein Kinase C Binding Protein 2)，又名少突細胞系轉錄因子2(Oligodendrocyte lineage transcription factor 2，Olig2 or Oligo2)，是一種基本的“螺旋-環形-螺旋”(Helix-Loop-Helix，HLH)轉錄因子。已經有研究者指出，該轉錄因子在神經上皮中少突細胞前體形成的區域特異性表達，以及在少突細胞前體內也有特異性表達。從而，解決了先前神經膠質細胞腫瘤無法用細胞形態學或者其它傳統標記方法標記的問題，這種轉錄因子可能被用作少突細胞腫瘤的理想標記，用于檢測或者診斷腦部腫瘤。(Proc.Nat.Acad.Sci.9810851-10856，2001)。
在本申請之前，還沒有PRKCBP2基因第一號外顯子多態性的相關報道。

發明內容
本發明的目的就是提供PRKCBP2基因第一號外顯子的多態性及其檢測方法。
在本發明的第一方面，提供了一種檢測人PRKCBP2基因第一號外顯子的單核苷酸多態性的方法，它包括步驟(a)確定在人PRKCBP2基因第一號外顯子的SEQ ID NO1所示序列的第270位的核苷酸；(b)檢測在所述位置是否存在單核苷酸多態性。
在一優選例中，所述的單核苷酸多態性是在第270位存在C。
在本發明的第二方面，提供了一種分離核酸，它具有SEQ ID NO1所示的序列，且第270位為C。
在本發明的第三方面，提供了一種等位基因特異性的核酸引物，其長度為15-50bp，且特異性地雜交并擴增出含人PRKCBP2基因第一號外顯子的SEQ ID NO1所示序列中第270位單核苷酸多態性的擴增產物。
在本發明的第四方面，提供了一種等位基因特異性的寡核苷酸探針，其長度為15-50bp，且特異性地雜交并檢測含人PRKCBP2基因第一號外顯子的SEQ IDNO1所示序列中第270位單核苷酸多態性。
一種試劑盒包括(1)特異性擴增人PRKCBP2基因第一號外顯子的引物對，(2)檢測擴增產物與正常的PRKCBP2基因第一號外顯子相比是否存在變化所需的試劑，所述的SEQ ID NO1所示序列中第270位單核苷酸多態性。
另一種診斷試劑盒包括本發明上述的引物和/或本發明上述的寡核苷酸探針。
具體實施例方式
本發明人通過廣泛而深入的研究，已經發現了PRKCBP2基因第一號外顯子所編碼的蛋白序列中第65位Tyr(Y)->His(H)多態(即mRNA上270位T->C多態性)，在此基礎上完成了本發明。
根據對正常人PRKCBP2基因測序結果，發現了該SNP。經分析發現，該SNP導致第65位氨基酸由Tyr(Y)->His(H)。由于這是不同性質氨基酸的置換，因此，會導致PRKCBP2基因第一號外顯子所編碼的蛋白活性發生改變。
PRKCBP2基因第一號外顯子的cDNA序列列于SEQ ID NO1，其中開放閱讀框為第78-464位，其所編碼的氨基酸序列列于SEQ ID NO2。PRKCBP2基因第一號外顯子的基因組序列可以從GenBank中獲得。
本領域的技術人員知道，有大量的分析技術可用于檢測PRKCBP2基因第一號外顯子中所述位點是否存在單核苷酸多態性。這些技術包括(但并不限于)DNA測序、雜交測序；酶促錯配切割、異源雙鏈分析、點雜交、寡核苷酸陣列(DNA芯片)、Mini-sequencing、Taqman技術、分子信標等，變性高效液相色譜法(DHPLC)。
另一方面，本發明的檢測方法被用于評估個體患PRKCBP2基因第一號外顯子相關疾病的易感性。
用于本發明的測試樣品沒有特別限制，對于檢測SNP而言，可以是從血液、組織等樣品中抽提出的DNA或mRNA。對于檢測PRKCBP2基因第一號外顯子活性而言，可以任何含有PRKCBP2基因第一號外顯子的樣品，如血液等。
用于本發明方法或檢測試劑盒的引物和探針，根據PRKCBP2基因第一號外顯子的cDNA序列(SEQ ID NO1的序列)或基因組序列進行設計，并可用常規的合成技術進行合成即可。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1基因的抽提和測序用常規酚氯仿法從人的血液中提取DNA，濃度校正至20ng/ul后，用于常規PCR擴增。引物是有義引物5’-ctcctctcct ggaagttttc g-3’(SEQ ID NO3)反義引物5’-catccatggc gatgttga-3’(SEQ ID NO4)擴增出的465bp的產物，純化后進行DNA測序。
實施例2SNP的獲得對PRKCBP2基因進行直接測序。將測定的各樣本序列進行比較，從而得出序列的差異，獲得SNP。
實施例3檢測試劑盒制備一檢測PRKCBP2基因相關疾病易感性的檢測試劑盒，其中，含有下列可擴增出270位SNP的引物對有義引物5’-ctcctctcct ggaagttttc g-3’(SEQ ID NO3)反義引物5’-catccatggc gatgttga-3’(SEQ ID NO4)對擴增產物與正常對照用變性高效液相色譜儀(DHPLC)進行色譜分析，可輕易地檢測出270位的T->C型SNP。
在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
SEQUENCE LISTING<110>上海人類基因組研究中心<120>PRKCBP2基因第一號外顯子多態性<130>030115<160>4<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>465<212>DNA<213>Homo sapiens<220>
<221>CDS<222>(78)..(464)<223>
<400>1ctcctctcct ggaagttttc ggtccgaggg aaggaggac cctgcgaaag ctgcgacgac60tatcttcccc tggggcc atg gac tcg gac gcc agc ctg gtg tcc agc cac 110Met Asp Ser Asp Ala Ser Leg Val Ser Ser His1 5 10ccg tcg tcg cca gag ccc gat gac ctt ttt ctg acg gcc cgg agt aag158Pro Ser Ser Pro Glu Pro Asp Asp Leu Phe Leu Thr Ala Arg Ser Lys15 20 25ggc agc agc ggc agc gcc ttc act ggg ggc acc gtg tcc tcg tcc acc206Gly Ser Ser Gly Ser Ala Phe Thr Gly Gly Thr Val Ser Ser Ser Thr30 35 40tcg agt gac tgc ccg ccg gag ctg agc gcc gag ctg tac ggc gct atg254Ser Ser Asp Cys Pro Pro Glu Leu Ser Ala Glu Leu Tyr Gly Ala Met45 50 55ggc tct gcg ggc gcg tat cct ggg gac aag cta gga ggc agt ggc ttc302Gly Ser Ala Gly Ala Tyr Pro Gly Asp Lys Leu Gly Gly Ser Gly Phe60 65 70 75aag tca tcc tcg tcc agc acc tcg tcg tct acg tcg tcg gcg gct gcg350Lys Ser Ser Ser Ser Ser Thr Ser Ser Ser Thr Ser Ser Ala Ala Ala80 85 90tcg tcc acc aag aag gac aag aag caa atg aca gag ccg gag ctg cag398
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<221>misc_feature<223>引物<400>4catccatggc gatgttga 18
權利要求
1.一種檢測人PRKCBP2基因第一號外顯子的單核苷酸多態性的方法，其特征在于，它包括步驟(a)確定在人PRKCBP2基因第一號外顯子的SEQ ID NO1所示序列的第270位的核苷酸；(b)檢測在所述位置是否存在單核苷酸多態性。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的單核苷酸多態性是在第270位存在C。
3.一種分離核酸，其特征在于，它具有SEQ ID NO1所示的序列，且第270位為C。
4.一種等位基因特異性的核酸引物，其特征在于，其長度為15-50bp，且特異性地雜交并擴增出含人PRKCBP2基因第一號外顯子的SEQ ID NO1所示序列中第270位單核苷酸多態性的擴增產物。
5.一種等位基因特異性的寡核苷酸探針，其特征在于，其長度為15-50bp，且特異性地雜交并檢測含人PRKCBP2基因第一號外顯子的SEQ ID NO1所示序列中第270位單核苷酸多態性。
6.一種診斷試劑盒，其特征在于，它包括(1)特異性擴增人PRKCBP2基因第一號外顯子的引物對，(2)檢測擴增產物與正常的PRKCBP2基因第一號外顯子相比是否存在變化所需的試劑，所述的SEQ ID NO1所示序列中第270位單核苷酸多態性。
7.一種診斷試劑盒，其特征在于，它包括權利要求4所述的引物和/或權利要求5所述的寡核苷酸探針。
全文摘要
本發明涉及PRKCBP2基因第一號外顯子的單核苷酸多態性(SNP)。本發明提供了分析PRKCBP2基因第一號外顯子的SNP或其活性的方法。本發明的SNP是SEQ ID NO1所示序列的人PRKCBP2基因第一號外顯子的第270位的T－＞C多態性。該SNP導致編碼蛋白第65位發生Tyr(Y)－＞His(H)改變，從而改變了蛋白活性。
文檔編號C07H21/00GK1519331SQ0311502
公開日2004年8月11日 申請日期2003年1月22日 優先權日2003年1月22日
發明者黃薇, 施錦繡, 奚慧峰, 金力, 黃 薇 申請人:上海人類基因組研究中心