專利名稱：：紅樹林根際固氮菌(dzy-n33)及其應用的制作方法
技術領域：
：本申請專利屬于生物
技術領域：
，特別是涉及一種對紅樹林植物具有良好促生效果紅樹林根際固氮菌及其制備生物固氮菌肥的應用。
背景技術：
：紅樹林是重要的海洋近岸濕地生態系統。對海洋環境保護和生態平衡有重要作用，是海洋生產力的重要組成部分。在自然海洋沿岸生態系統中，維持其高生產力的營養元素的來源，是研究的重要課題。紅樹林為自然分布于熱帶、亞熱帶海岸潮間帶的木本植物群落，覆蓋大約60-75%熱帶和亞熱帶海岸，對維護海灣河口的生態平衡起重要作用，是海洋生產力的重要組成部分(Holguineta1.，2001)，被認為是具有較高生產力的生態系統。該生態系統具有較高的有機質水平(全球每年凋落物為100TgC),為毗連的沿岸水域和相關的生物群落生境提供有機物(Holguinetal.,2001;LugomelaandBergman，2002)。然而紅樹林生態系統的無機營養較貧乏，尤其是無機氮水平較低(Holguinetal.，1992;Vazquezetal.，2000)，固氮生物的生物固氮被證明是紅樹林生態系統無機氮的主要來源(HicksandSylvester,1985;Kyamzietal2003)。生物固氮作為紅樹林生態系統和生源元素生物地球化學循環的重要環節，對紅樹林生態系統及生態環境產生極大的影響。由于人類的過度開發、圍海造地和都市化等行為，使全球的紅樹林正以^^人的速度減少，據聯合國糧農組織保守的數據估算，紅樹林正以每年平均減少1-2%的速度消失，其速度甚至超過了珊瑚礁和熱帶森林的消失速度。在發展中國家中，消失的速度更快，而紅樹林的90%以上位于發展中國家。美國紅樹林行動項目組負責人Aheredo(1999)認為，熱帶亞熱帶國家曾在3/4的海岸線上分布有紅樹林，現在僅剩下不到一半，而且大部分紅樹林為嚴重退化的生態系統。科學家預言，如果任其發展，在未來的近100年內，人類將徹底失去紅樹林(Duke,2007)。近年來，紅樹林生態系統的維護和紅樹林植株的保育等研究成為熱門研究領域，也有多個國際組織和團體發起的旨在保護紅樹林的國際會議。《中國21世紀議程》(1994)優先項目計劃中把紅樹林恢復與重建技術納入了議事日程。ITTO組織，2002-2006年的計劃目標亦把紅樹林生態系統恢復列為首要資助目標之一(廖寶文，2005)。可見紅樹林濕地生態系統的恢復工作亟需我們大力開展，但無論理論的研究還是實際恢復工作的開展都面臨較大困難。紅樹林的恢復建設工作一直比較緩慢，這主要是由于紅樹林造林成活率極低(廖寶文，1999)。墨西哥和印度等國家的科學家利用植物生長促生菌(PGPB，plantgrowth-promotingbacteria)對紅樹林進行促生，取得了一定階段性進展，但發現的適合紅樹林促生的菌種仍為少數，此類菌種依舊缺少且多數被保密收藏。目前中國林業科學研究院熱帶林業研究所正與墨西哥西北生物研究中心合作，引進相關菌種對我國主要紅樹植物進行接種測試和相關菌劑研究，以期解決我國灘涂地段紅樹林造林成活率極低的棘手問題。然而，引進菌種在我們國家紅樹林中的成活率小，并且也存在外種入侵所會產生的各種隱患。
發明內容-本發明的目的是提供了從海洋紅樹林生態系統中篩選出的，具有高固氮活性，對紅樹有促生作用的紅樹林根際固氮菌新種；本發明的另一目的是提出所述的紅樹林根際固氮菌在制備生物固氮菌肥的應用。本發明所提出的紅樹林根際固氮菌，是對海洋紅樹林生態系統的沉積物、根際土，進行選擇性培養和富集培養，運用常規的微生物分離、純化方法，得到的一個新的固氮菌。為根瘤菌(朋ZzoM/附sp.)DZY-N33株系，該菌種已于2007年4月13日保存在中國典型培養物保藏中心(CCTCC,地址中國武漢市武漢大學)，保藏編號M207045。研究結果表明，該菌種具有較高的生物固氮活性，其固氮活性為20-64nmolC2H2/hmg鮮重。從本發明菌株的純培養物提取基因組DNA，運用固氮基因特定的引物PolF/PolR(參考Polyetal.,2001)和細菌16SrDNA全序列通用引物16SF/16SR(參考Weisenburgetal.,1998)進行PCR擴增，均擴增到理想的目的條帶，證明該菌株具有固氮基因(圖2)。通過測序分析得到固氮基因"^/序列(其序列如SEQ2所示)和16SrDNA序列(其序列如SEQ1所示)，通過GenBank中的BLAST軟件將m:/H序列和16SrDNA序列與GenBank數據庫中的序列進行比對，在數據庫中沒有找到完全相似的序列，表明這2條基因序列為首次發現的新基因序列。向基因庫成功遞交新基因序列得到登錄號為EF422074和EF207562。在GenBank數據庫中選取了部分與測定序列相似性較高的代表性基因序列，通過CIustalW軟件和Mega軟件以Neibor-joining方法構建系統進化樹(見圖1)，進行系統發育分析。從系統發育樹(圖1)可以看出和該種同源性較高(95%-97%)的序列多為根瘤菌屬(i/^o&'ww)的16SrDNA。因此可以初步判定該菌為根瘤菌屬。和該菌相近的各菌株均未定名，所以該菌株是該屬的一個新種，建議命名為禾艮瘤菌(iW加6/M/Msp.)DZY-N33。用含有本根瘤菌(iWzo6/w附sp.)DZY-N33的菌劑處理兩種紅樹，木欖(^wgw'eragv附"orWza)和紅海欖(WWzopAoras/^(Ma),結果如表1所示。_表1/fa'zo6/wwsp.DZY-N33對木欖和紅海欖肝處理45天后的影響_<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>注表中值均為10組平行樣平均值。生物量中重量指濕重；剩下重量均指干重。從表2中我們可以看出該菌對于木欖和紅海欖有著良好的促生作用。光合色素含量平均值明均明顯高于對照組。總葉綠素含量平均值高于木欖對照組117.13%,高于紅海欖對照組41.45%。胡蘿卜素含量也分別比木欖和紅海欖對照組高145.0%和44.12%。對于葉面積的生長促進作用也比較明顯，分別促進木欖和紅海欖葉面積155.32%和76.60%。而對于不同樹種的地上和地下的促進則不相同，對于木欖促進地下部分效果好些，對于紅海欖促進地上部分效果好些。說明該菌株適應能力廣、抗逆性強，可以和紅樹植物產生聯合共生關系，可用于自然紅樹林生態系統菌肥的生產工程菌,提高紅樹林生態系統的生產力。上述實驗也證明，用含有該菌的菌劑接種紅海欖和木欖等紅樹植物可以明顯促進植株生長，因此，該菌可以作為制備促進紅樹林植物生長的生物固氮菌肥的應用。圖1是根瘤菌(iWzoWwmsp.)DZY-N33在16SrDNA無根進化樹中的位置；圖2為是根瘤菌(A/z/zo6/Mwsp.)DZY-N33的的電泳圖，圖中，1:基因組DNA，2:16SrDNA，3:擴增到的固氮基因myH，Ml:入DNA/EcoRI+HindIII，M2:DL2000。具體實施例方式一、材料與方法1、材料1.1土樣采集樣品采自海南省三亞市紅沙河沿岸紅樹林區木欖(5ragw/eragvwwoA^)根際沉積物，樣品采集后裝入滅菌的封口聚乙烯袋中，帶回實驗室低溫保存。1.2培養基Ashby液體培養基甘露醇10.0g，KH2P04H200.2g，MgS047H200.2g,NaCl0.2g，CaS04O.lg,CaCO35.0g，去離子水lOOOmL，pH7.0。Ashby固體培養基Ashby液體培養基+2.2%瓊脂。改良D(3bereiner無氮液體培養基蔗糖10g，蘋果酸5.0g,K2HP04H20O.lg，KH2P04.H200,4g，MgS04'7H2O0.2g，NaC10.1g，Na2M004.H200.002g，FeCl30.01g，去離子水1000ml,pH7.0。LB培養基酵母提取物5g，胰蛋白胨10g，NaCllOg，瓊脂1-2%，去離子水1000ml,pH7.0。2、方法2.1菌種分離將樣品混勻后取約lg于200mlAshby、DObereiner或者Ashby+D6bereiner無氮液體培養基(Ashby培養基與D6berdner培養基以1:1比例混合)中，30'C恒溫48h進行加富培養。然后將菌液分別稀釋至l(T4、l(T5、10-6三個稀釋度，各稀釋度的菌懸液以涂布法接種于Ashby固體培養基上，30°C48h培養后選擇典型的單一菌落進一步純化。2.2菌種純化將分離出的菌落，用接種針挑取典型的單一菌落，經涂片染色，在光學顯微鏡下觀察菌體形態，如所分離的菌落不純，應做系列稀釋后再次用平板涂布法分離，直至獲得純種。將純化后的菌株接種于無氮Ashby固體培養基和LB全培養基甘油保存。2.3液體培養中固氮酶活力測定采用乙炔還原法測定固氮活性(參考Capone1993),將斜面保存的純菌株接種于10ml液體改良D6bereiner培養基內，于30'C搖床振蕩培養72h，分別取1ml于滅菌的5ml小瓶中，蓋上橡皮塞。用注射器從容器中抽走5%空氣，然后加入相同體積的乙炔氣體。每個樣品設3個重復，1個空白對照，對照容器中不加入乙炔氣體。所有樣品于30'C孵育12h,用SQ-204氣相色譜檢測乙烯的生成量。乙炔還原法(ARA)表明該菌可以利用N2作為氮源，且具有較高的生物固氮活性，純培養條件下平均固氮活性為20-64nmolC2H2/hmg鮮重。2.4DNA的提取與純化方法參考東秀珠《常見細菌系統鑒定手冊》P409。2.5my^基因的擴增采用固氮細菌的"i//基因通用引物PolF/PolR(參考Polyetal.,2001)進行PCR擴增PolF:5，-TGCGA(C/T)CC(G/C)AA(A/G)GC(C/G/T)GACTC-3'，PolR:5'-AT(G/C)GCCATCAT(C/T)TC(A/G)CCGGA-3'。經過多次實驗后建立了適宜的反應體系和反應條件。PCR反應體系包括PCR反應程序是:<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>取2^1PCR反應產物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，剩余的PCR產物直接交與Invitrogen生物技術有限公司用ABIPrism3730XLDNA分析系統測序。得到332bp的nifH序列。將序列直接遞交Genbank數據庫，序列號為EF422074。2.616SrDNA全序列的擴增DNA提取與純化見方法見東秀珠《常見細菌系統鑒定手冊》P4。9。采用細菌16SrDNA全序列通用引物16SF/16SR(Weisenburgetal.，1998),16SF:5，-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，16SR:5'-CGGTTACCTTGTTACGACTT-3'，進行PCR擴增。經過多次實驗后建立了適宜的反應體系和反應條件如下PCR反應體系包括PCR反應程序是:<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>取2^1PCR反應產物用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢觀纟，剩余的PCR產物直接交與Iiwitrogen生物技術有限公司用ABIPrism3730XLDNA分析系統測序。得到的16SrDNA序列。將序列直接遞交Genbank數據庫，序列號為EF207562。利用DNAMAN軟件對測序結果進行同源性比較，利用BLAST軟件將測定得到的基因序列與GenBank(www.ncbi.nlm.nih.gov)數據庫進行序列比對分析，獲取相近典型菌株的16SrDNA基因序列，然后利用BIOEDIT中的CIustalW對序列進行排列，利用Mega中的鄰接法(Neighbor-Joining)建立16SrDNA基因的系統發育樹，進行系統發育分析，其中的遺傳距離用Tamum-Nei公式計算，枝長代表了分歧程度，各枝上的數字是1000次bootstrap重抽樣分析的支持百分比。2.7菌株制劑有效性試驗將該菌(朋/zoW,sp.DZY-N33)接種于無氮的Ashby培養基中，直至濃度為108cell/ml，待用。采用2種紅樹植物木欖、紅海欖盆栽實驗。每種紅樹10個平行樣，外加對照。塑料盆放在露天條件下，用己準備好的菌液浸泡紅樹根部3-4h后，栽種入塑料盆。45d后測量各個指標。對比實驗指標為植物根、葉面積、植株重量、光合色素等。結果如表1所示。序列表〈110〉中國科學院南海海洋研究所<120>—種紅樹林根際固氮菌(DZY-N33)及其應用〈160〉2<210〉1<211〉1326〈212>DNA〈213>根瘤菌(Afe'加力i咖sp.)DZY-N33〈400>1GTGAGTGGCAGACGGGTGAGTAACGCGTGGGAATCTACCTTTTGGTACGGAATAGCTCCG60GGAAACTGGAATTAATACCGTATGTGTCCTTCGGGAGAAAGATTTATCGCCAAGAGATGA120GCCCGCGTTAGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGGCGACGATCTATAGCT180GGTCTGAGAGGATGATCAGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGG240CAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGCAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGAGTGA300TGAAGGTCTTAGGATTGTAAAGCTCTTTCGCCGGTGAAGATAATGACTGTAGCCGGTAAA360GAAGCCCCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGGGCTAGCGTTGTTC420GGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGTAGGCGGACGTTTAAGTCAGGGGTGAAATCCCAGA480GCTCAACTCTGGAACTGCCTTTGATACTGGATGTCTTGAGTATGGAAGAGGTAAGTGGAA540TTGCGAGTGTAGAGGTGAAATTCGTAGATATTCGCAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCT600TACTGGTCCATTACTGACGCTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACC660CTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGATAGCTAGCCGTCGGGTTGCATGCAATTCGGTGGC720GCAGTTAACGCATTAAGCTATCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGG780AATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGCAGA840ACCTTACCAGCCCTTGACATTTGGTGCTACCTCGAGAGATCGAGGGTTCCTTCGGGACGC900CAGGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCG960CAACGAGCGCAACCCCTCGCCCCTAGTTGCCAGCATTTGGTTGGGCACTCTAGGGGGACT1020GCCGGTGATAAGCCGAGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTACGGGC1080TGGGCTACACACGTGCTACAATGGTGGTGACAGTGGGCAGCAAGCGAGCGATCGCAAGCT1140AATCTCCAAAAGCCATCTCAGTTCGGATTGCACTCTGCAACTCGGGTGCATGAAGTTGGA1200ATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACAC1260CGCCCGTCACACCATGGGAGTTGGTTCTACCCGAAGGCGCTGCGCTAACCGCAAGGAGGC1320AGGCGA1326<210>2〈211>334〈212>腿〈213>根瘤菌(朋ho&'咖sp.)DZY-N33〈400>2CGCGAACAATTTAACTTCAATGCTCAGGACACGGTTCTGCACTTGGCCGCCCAGGAGGGG60TCGGTCGAGGACCTTGAGCTCGAGGACGTCCTGAAGATGGGCTACAAGGGCATCAAGTGT120GTTGAATCCGGCGGTCCGGAGCCGGGCGTTGGCTGTGCCGGTCGCGGCGTTATCACTTCG180ATCAACTTTCTCGAGGAAAACGGCGCCTATGACGATGTCGATTACGTCTCCTATGACGTT240CTCGGCGACGTTGTCTGCGGGGGCTTTGCAATGCCGATCCGCGAGAACAAGGCCCAGGAA300ATCTACATCGTCATGTCCGGCGAATGATGGCCAT33權利要求1.一種紅樹林根際固氮菌，該菌是從海洋紅樹林生態系統的沉積物、根際土中篩選分離出來的根瘤菌(Rhizobiumsp.)DZY-N33株系，含有如SEQ1所示的16SrDNA序列和固氮基因nifH，保藏于中國典型培養物保藏中心，其保藏號為CCTCCNOM207045。2.根據權利要求1所述的紅樹林根際固氮菌，其特征在于所述的固氮基因mjW含有如SEQ2所示序列。3.權利要求1所述的紅樹林根際固氮菌在制備促進紅樹林植物生長的生物固氮菌肥的應用。全文摘要本發明提供一種紅樹林根際固氮菌(DZY-N33)及其應用，所述菌株是對海洋紅樹林生態系統的沉積物、根際土，進行選擇性培養和富集培養，運用常規的微生物分離、純化方法，得到的一個新的固氮菌，為根瘤菌(Rhizobiumsp.)DZY-N33株系，該菌種已于2007年4月13日保存在中國典型培養物保藏中心(CCTCC，地址中國武漢市武漢大學)，保藏編號M207045。該菌種具有較高的生物固氮活性，用含有該菌的菌劑接種紅海欖和木欖等紅樹植物可以明顯促進植株生長，因此可以作為制備促進紅樹林植物生長的生物固氮菌肥的應用。文檔編號C12N15/31GK101298599SQ20081002895公開日2008年11月5日申請日期2008年6月23日優先權日2008年6月23日發明者孫翠慈,偲張,張燕英,楊志浩,王友紹,董俊德申請人:中國科學院南海海洋研究所