專利名稱：一種利用全血直接擴增核酸的方法
技術領域：
本發明屬于基因工程領域，涉及一種利用全血直接擴增核酸的方法。
背景技術：
PCR是一種利用DNA聚合酶將極微量的標本百億倍甚至千億倍擴大的現代技術，其起始模板通常是基因組DNA。基因組DNA主要來源于血液，需要對其進行提取，除了商品化試劑盒外，還有很多其他的提取方法，如酚/氯仿抽提法、碘化鉀法、直接煮沸法、高鹽沉淀法吳清敏，劉巧紅，滕云，等.外周血提取DNA方法的比較.中華檢驗醫學雜志，2004， 27 (7): 445-446等等。這些方法雖然有效，但是操作步驟繁瑣，容易造成污染，而且基本上都需要用到恒溫水浴鍋、低溫高速離心機等裝置，對儀器設備和試劑的要求都比較多。如果不經過DNA提取而直接進行PCR，則可以大大節約實驗時間和成本，同時也避免了因多步操作可能造成的樣本間交叉污染。已有文獻報道采用全血直接進行DNA擴增。如McCusker J.等人對一定量的全血標本95。C預處理15分鐘，以降低血液中的PCR抑制成份對擴增的影響McCusker J, Dawson MT， Noone D，et al. Improved method for direct PCR amplification form whole blood. Nucleic AcidsResearch, 1992， 20(24): 6747-6755；Mercier B在全血擴增前利用3個循環的預變性程序來去除血液中的PCR抑制成分Mercier， B.， Gaucher, C, Feugeas, O., et al. Direct PCRfrom whole blood without DNA extraction. Nucleic Acids Research, 1990， 18(19):5908-5912等等。這些方法雖然以全血為起始模板直接擴增DNA，但操作不夠簡便，條件難以控制，重復性不好，不能形成商品化試劑盒，不利于推廣使用，且相關研究未見后續進一步報道。 '發明目的
本發明的目的是提供一種利用全血直接擴增核酸的方法。
本發明的目的是通過下列技術措施實現的
一種利用全血樣本為起始材料直接進行核酸擴增的方法，包括取全血樣本為起始材料，加入核酸擴增反應試劑，加入擴增目的基因所需引物，直接進行核酸擴增反應，測定擴增產物，其中擴增核酸反應試劑中的緩沖液的pH值在8.5-10.0之間，鎂離子濃
度在1.5-3.0 mmol/L之間。
所述的方法，其中緩沖液的pH值為8.8-9.9，鎂離子濃度為1.5-2.5 mmol/L。 所述的方法，其中直接是指不經過提取血液樣本中的基因組DNA而進行核酸擴增反應。
所述的方法，其中全血是指液體血液或干血。
液體血液可以是加入抗凝劑的血液或不加抗凝劑的血液。干血可以是保存在固體載 體上的干血，如濾紙血、布料血等。
所述的方法，其中核酸擴增反應是聚合酶鏈式反應(PCR)、滾環擴增技術(RCA)、 鏈替代擴增(SDA)、連接酶鏈式反應(LCR)或依賴核酸序列的擴增(NASBA)。
所述的方法，其中緩沖液是指濃度為10-100mmol/L的三(羥甲基)氨基甲垸一鹽 酸。緩沖液可用鹽酸、苛性鈉調節酸堿度。
液體全血樣本直接加到擴增用反應管的底部，不對反應管進行任何攪動。
本發明的有益效果
由于通常采用PCR技術擴增核酸，這里以PCR擴增為例介紹擴增效果。跟普通基 因擴增反應一樣，即在一只或多只PCR專用試管中，加入PCR擴增用試劑，除緩沖液 和擴增模板不同外，其余成分與普通PCR試劑完全相同。即要加入擴增引物，脫氧核 糖核酸，Taq聚合酶，0.5-5微升血液或小的含有干血的濾紙片。PCR緩沖液的pH值在 8.5-10.0之間，鎂離子濃度在1.5-3.0 mmol/L之間，提供鎂離子的物質可以是氯化鎂或 醋酸鎂。在普通PCR擴增儀器上完成循環擴增反應。可以進行多對引物的同時擴增， 即多重PCR反應。反應結束后，可以采用凝膠電泳法、芯片電泳法等分離方法測定擴 增產物。在本發明中，采用不同pH的PCR緩沖液進行擴增反應，結果表明，使用pH8.5 以上(pH 8.5-10.0)的PCR緩沖液能得特異性的PCR產物。
本發明一種利用液體全血和干血樣本為起始材料，不經過提取血液樣本中的基因組 DNA直接進行核酸擴增反應的方法，屬于一種改進常規核酸擴增反應緩沖液直接進行 核酸擴增的方法，具體來說是一種通過提高緩沖液的pH值，并且通過調節緩沖液的鎂 離子濃度來實現直接擴增。根據本發明，不經過核酸的分離和精制過程，從含有大量阻 礙核酸擴增物質的生物試料中高效率地放大目的核酸。本發明可以用于檢測樣本量微量 的全血樣本。


圖l以pH值不同的緩沖液進行全血PCR擴增所得擴增產物的電泳圖譜.圖A中的 泳道2、 3是以市售TaKaRa Taq PCR試劑盒中的緩沖液進行擴增(泳道1為338-bp的 DNA標記)；圖B為以不同pH值的緩沖液進行擴增的結果，各泳道的pH分別為pH7.6S (泳道l)， pH8.23(泳道2)， pH8.60(泳道3)， pH8.80(泳道4)， pH9.10(泳道5), pH 9.27 (泳道6)，pH9.41(泳道7)，pH9.58(泳道8)，pH9.91(泳道9)'pH 10.33 (泳道10)。 圖C為各pH值緩沖液所得擴增產物的相對產率。
圖2緩沖液中不同鎂離子濃度對擴增對影響。
圖3采用全血擴增緩沖液與Tetra—PCR法測定與糖尿病相關的單堿基多態性位點結 果圖。
具體實施例方式
以下通過實施例對本發明作進一步的闡述。
實施例l:不同pH值的PCR反應液對擴增效率的影響
1. 實驗材料新鮮血樣，分別用三種不同的抗凝劑(肝素鈉、EDTA—2K、檸檬酸 鈉)處理；基因組DNA，通過酚/氯仿抽提法提取；TaqDNA聚合酶、dNTPs (Promega, Madison ， USA );弓|物PI : 5，- CATCAGACTTTGACCGTA -3, ; P2 : 5'-AGAATTAGCAAGCTGCCA-3' (InvitrogenInc.， Shanghai, PAGE級)；瓊脂糖(OXOID Ltd., Hampshire, England);凝膠電泳加樣液和溴化乙錠(EB)均為生工生物公司產品。
儀器PCR擴增儀(PTC-225, MJ,美國)；電泳儀(PowerPac 1000， BIO-RAD， 美國)；芯片電泳儀(2100Bioanalyzer， Agilent,德國)；凝膠電泳成像儀(GeneGenius， SYNGENE，英國)；微量基因光譜測定儀(GeneSpecIII， NaKaInstrument,日本)。
2. 實驗方法在PCR反應液(50.0 中，加入l pl經抗凝固劑處理的人血液， 進行PCR。 PCR的引物為PI和P2， PCR擴增產物應該為338bp，為IL1B基因片段 的擴增產物。
擴增反應67mmol/LTris-HCl緩沖液(pH為7.68-10.33之間)，2 mmol/L MgCl2， 200 nmol/LdNTP混合物，0.05 U/|al Taq DNA聚合酶。加入引物(各1.0pmol/L)， 1 ^ 抗凝血。放入PCR儀中，96°C， 3min; (96°C， 30 sec; 58°C, 60 sec; 72°C， 1 min) 40個循環；72°C, 7min; 4'C保存。PCR結束后，用PCR結束后的反應液3^1，在2% 凝膠，0.5昭/ml ETBr， TAE (40mM Tris-acetate, lmM EDTA, pH8.0)液中進行電泳(100V 電泳5min)。
3. 實驗結果見圖l。圖1A中的泳道2、 3是以市售TaKaRaTaqPCR試劑盒中的緩沖液進行擴增的電泳結果(泳道1為338-bp的DNA標記)；圖1B為以不同pH值(pH 為7.68-10.33之間)的緩沖液進行PCR擴增的結果，各泳道的pH值分別為pH 7.68 (泳 道l)， pH8.23(泳道2)， pH8.60(泳道3), pH 8.80 (泳道4)， pH9.10(泳道5)， pH 9.27 (泳道6)， pH9.41(泳道7)， pH9.58(泳道8)， pH9.91(泳道9)， pH 10,33 (泳道10)。 圖C為各pH值緩沖液所得擴增產物的相對產率。由圖可知，采用常規的PCR緩沖液， 得不到全血PCR擴增產物，但當PCR緩沖液的pH值在8.80-9.91之間時，可以得到清 楚的擴增條帶，從圖C中的擴增產率可以得出緩沖液的最佳pH值為9.1-9.6之間。
實施例2:緩沖液中不同鎂離子濃度對擴增對影響。
實驗方法在PCR反應液(50.0pl)中，加入1 ^經抗凝固劑處理的人血液，進行四 重PCR反應，含有四對PCR引物第一對為5'- CAGGCAGGACAGCTTAAAAG -3'， 5，-ACTGTGGCAAAGTTGCTTTC-3'(擴增產物長度為109bp );第二對為5，-CATTCATCTTCCCTTTTGAAGG-3'， 5，-ATGCAAGTCACAGGAAATCT-3，(擴增產物 長度為201bp ); 第三對為 5，-GTCTGCCTCACCATAAAACG-3， ， 5，-ACCACTGCCAAAACTTTCAA-3，(擴增產物長度為301bp );第四對為5'-GAATATTCCCGCTCTCCGGA-3'， 5，-GCTGGTGCTCCATTCTTGAG-3'(擴增產物長 度為472bp)。
擴增反應67腿ol/L Tris-HCl緩沖液(pH9.1)， 1.5-5匪ol/L MgCl2， 200 pmol/L dNTP混合物，0.05 U/nl Promega—Taq DNA聚合酶。加入上述引物(各1.0nmol/L)， 1^1抗凝血。放入PCR儀中，96°C， 3min; (96°C， 30 sec; 58°C， 60 sec; 72。C， 1 min) 40個循環；72°C， 7min; 4'C保存。PCR結束后，用PCR結束后的反應液3|il，在2% 凝膠，0.5嗎/mlETBr， TAE (40mM Tris-acetate, ImM EDTA, pH8.0)液中進行電泳(100V 電泳5min)。
測定結果如圖2所示，表明鎂離子濃度在1.5-3.0之間可以得到較好的擴增結果。
實施例3:與糖尿病相關的單堿基多態性的測定 1.實驗材料
釆用新鮮血樣制備抗凝血和濾紙干血，同時提取基因組DNA; TaqDNA聚合酶和 dNTPs (P讓ega， Madison, USA);外引物PO-1: 5'-ttg tag cca aag aca ggttct g-3'; PO-2: 5'-gat ctt get tag ggt get ttg t-3';內弓l物PI-1: 5'-tgg ccc tct tct caa cct ata-3'; PI-2: 5'-atg taa
6ggttctgtgcaacgc-3' (Invitrogen Inc.， Shanghai, PAGE級)；其它材料同例1.
2. 實驗方法
本例采用全血擴增技術和Tetra—PCR技術(Ye, S.， Dhillon, S., Ke, X., Collins, A. R., Day, I. N., Nucleic Acids Res 2001， 29， E88-88.)相結合，在單管中測定PPARy基因的 C2821T位點的基因型。該技術同時采用四條引物在單管中進行PCR反應，兩條外引物 擴增461-bp的片段，兩條內引物的3'端分別與SNP位點的兩個基因型對應，野生型產 生長度為225-bp的片段，突變型產生長度為277-bp的片段，如果為雜合子，兩個片段 同時出現。
擴增反應67麵ol/LTris-HCl緩沖液(pH9.1)， 2mmoI/LMgCl2, 200 pmol/L dNTP 混合物，0.05 U/pl Promega—Taq DNA聚合酶。加入上述引物(各1.0 pmol/L)，分別加 入l )Lil抗凝血、200ng基因組DNA、 2.5mm2的濾紙干血。PCR循環96°C， 3 min; (96°C， 30sec; 58。C， 60sec; 72°C， 1 min) 35個循環;72°C, 7min; 4'C保存。PCR 結束后，釆用芯片電泳儀(200Bioanalyzer， Agilent,德國)電泳，根據圖譜確定基因 型。
3. 實驗結果如圖3所示，三種擴增起始材料基因組DNA、抗凝血、濾紙血均得 出了相同的結果。待測樣本為雜合子，凝膠電泳圖譜中有三條PCR產物的條帶， 一條 為外引物擴增產物(46i-bp)，在圖中標為"P"; —條與野生型對應的225-bp片段，在 圖中標記為"A"; —條與突變型對應的277-bp片段，在圖中標記為"G"。因此采用 本發明的高pH緩沖液可以有效地擴增出目的片段，不需要預先分離其中的DNA。〈110>華東醫學生物技術研究所
<120> —種利用全血直接擴增核酸的方法
〈160〉 14
〈210〉 1 〈211〉 18 <212〉 ■ 〈213>人工引物 〈400〉 1
catcagactt tgaccgta 18
<210> 2 <211〉 18 〈212〉 DNA <213>人工引物 <400> 2
agaattagca agctgcca 18
〈210> 3 〈211〉 20 〈212〉 DNA 〈213>人工引物 〈400〉 3
caggcaggac agcttaaaag 20
〈210> 4 〈211〉 20 <212>腿 <213>人工引物 〈400〉 4
actgtggcaa agttgctttc 20
〈210〉 5 〈211〉 22 〈212〉腿 〈213>人工引物 〈400〉 5
cattcatctt cccttttgaa gg 22
<210〉 6 <211〉 20〈212〉 DNA 〈213〉人工引物 〈400〉 6
atgcaagtca caggaaatct 20
〈210〉 7 〈211〉 20
<212> DNA ' 〈213〉人工引物 〈400〉 7
gtctgcctca ccataaaacg 20
〈210〉 8 〈211> 20 〈212〉腿 <213>人工引物 〈400〉 8
accactgcca aaactttcaa 20
〈210> 9 <211> 20 〈212〉 DNA 〈213〉人工引物 〈400〉 9
gaatattccc gctctccgga 20
〈210> 10 〈211〉 20 〈212〉 DNA 〈213>人工引物 〈400〉 10
gctggtgctc cattcttgag 20
<210> 11 〈211> 22 〈212〉 DNA 〈213〉人工引物 〈400〉 11
ttgtagccaa agacaggttc tg 22
<210> 12 〈211〉 22 <212〉 DNA <213>人工引物
9〈400> 12
gatcttgctt agggtgcttt gt 22
〈210〉 13<211〉 21<212〉腿〈213〉人工引物〈400〉 13
tggccctctt ctcaacctat a 21
<210> 14〈211〉 21<212>脆〈213〉人工引物<400> 14
atgtaaggtt ctgtgcaacg c 2權利要求
1、一種利用全血樣本為起始材料直接進行核酸擴增的方法，包括取全血樣本為起始材料，加入核酸擴增反應試劑，加入擴增目的基因所需引物，直接進行核酸擴增反應，測定擴增產物，其特征在于擴增核酸反應試劑中的緩沖液的pH值在8.5-10.0之間，鎂離子濃度在1.5-3.0mmol/L之間。
2、 根據權利要求1所述的方法，其特征在于緩沖液的pH值為8.8-9.9,鎂離子 濃度為1.5-2.5 mmol/L。
3、 根據權利要求1所述的方法，其特征在于直接是指不經過提取血液樣本中的基 因組DNA而進行核酸擴增反應。
4、 根據權利要求1所述的方法，其特征在于全血是指液體血液或干血。
5、 根據權利要求4所述的方法，其特征在于液體血液是指加入抗凝劑的血液或不 加抗凝劑的血液。
6、 根據權利要求1所述的方法，其特征在于核酸擴增反應是聚合酶鏈式反應、滾 環擴增技術、鏈替代擴增、連接酶鏈式反應或依賴核酸序列的擴增。
7、 根據權利要求1所述的方法，其特征在于緩沖液是指濃度為10-100mmol/L的三 (羥甲基)氨基甲烷-鹽酸。
全文摘要
本發明屬于基因工程領域，公開了一種利用全血直接擴增核酸的方法。該方法包括取全血樣本為起始材料，加入核酸擴增反應試劑，加入擴增目的基因所需引物，直接進行核酸擴增反應，測定擴增產物，其特征在于擴增核酸反應試劑中的緩沖液的pH值在8.5-10.0之間，鎂離子濃度在1.5-3.0mmol/L之間。根據本發明，不經過核酸的分離和精制過程，從含有大量阻礙核酸擴增物質的生物試料中高效率地放大目的核酸。本發明可以用于檢測樣本量微量的全血樣本。
文檔編號C12N15/10GK101492670SQ200810018710
公開日2009年7月29日 申請日期2008年1月21日 優先權日2008年1月21日 公開號200810018710.發明者周國華 申請人:華東醫學生物技術研究所