專利名稱：原肝干細胞和近肝干細胞的制作方法
技術領域：
本發明涉及人類肝干細胞，產生成熟肝臟細胞的多能細胞。這些細胞包括兩個干細胞群真正的原祖細胞，即生成近肝干細胞的管板干細胞，以及生成肝細胞和膽管細胞的近干細胞。本發明也涉及分離人類肝管板干細胞以及分離近肝干細胞和定向肝細胞祖細胞和定向膽管祖細胞的方法；包括本發明的細胞的組合物可用于細胞和基因治療以及用于建立生物人工器官。
背景技術：
1.人類肝的解剖學成熟肝的基本結構和功能單位是腺泡，其在橫截面上的組織形式象圍繞兩個獨特血管床的輪子周邊是3-7組肝門三聯體(protal triad)(每組各具有門靜脈、肝動脈和膽管)，而中心是中央靜脈。肝細胞組織為細胞板結構，兩側均毗鄰有孔內皮，形成一系列與肝門和中央脈管系統相鄰近的竇狀隙。最近的數據表明赫令氏管(Canals of Hering)，即一種位于肝門三聯體周圍的小管，在I帶各處產生細小的小管，它們延伸并切入肝板，形成類似于瓶刷的模式(Theise，N.1999Hepatology.301425-1433)。
稱之為狄氏隙(space of Disse)的狹窄空間沿著竇狀隙將內皮與肝細胞分隔開來。作為這種組織結構的結果是，肝細胞具有兩個基部結構域(各自面對一個竇狀隙)和一個頂部結構域(由毗鄰肝細胞的接觸區形成)。該基部結構域和血液接觸并參與血漿成分的吸收和分泌，而頂部結構域則形成膽汁小管，專營膽汁鹽的分泌，并且通過交聯的網絡與膽管相聯。血管從門靜脈和肝動脈流過竇狀隙到達終末肝靜脈和中央靜脈。
根據這種微循環模式，將腺泡分成三個帶1帶，門周區；2帶，腺泡中區；以及3帶，中心周圍區。增殖潛能、形態標準、(染色體)倍性以及多數肝臟特異性基因與帶狀分布相互關聯(Gebhardt，R等，1988.FEBS Lett.24189-93；Gumucio，J.J.1989，Vol.19.SpringerInternational，Madrid；Traber，P.等，1988.Gastroenterology.951130-43)。跨腺泡并且是沿著從肝門三聯體到中央靜脈血流方向上的血液成分(包括氧氣)濃度的梯度，負責這種成帶現象中一部分，例如糖酵解和糖異生的互逆區室化。然而，間隙銜接蛋白連接蛋白26的門周區成帶現象以及谷氨酰胺合成酶的中心周圍區成帶現象等(此處僅舉兩例)，對此類梯度是不敏感的，而代表了多數組織特異性基因，并且似乎是由微環境中對細胞或者除血流以外的變量而言所固有的因子決定的。
除了肝細胞、膽管上皮細胞(膽管細胞)和內皮細胞外，肝門和中央膽管之間的區域還含有其它細胞類型，例如貯脂細胞(Ito cell)和枯否細胞(Kupffer cell)。這些細胞在肝臟病理狀況下起著突出的作用，尤其是在炎癥和纖維癥中，但它們對正常器官主要穩態功能的直接貢獻明顯要小。
2.人類肝的發育肝臟是由尾前腸和橫隔(內臟間充質的一部分)形成的憩室匯聚發育的結果。肝細胞的形成很可能是通過成纖維細胞生長因子，起始于內胚層上皮細胞與生心中胚層相互作用之后。特化的肝細胞隨之增殖并以索狀方式穿入橫隔的間充質，形成肝臟原基。上皮-間充質的直接相互作用在肝臟的這些早期發育階段中是關鍵性的，并規定哪些細胞將分別成為肝細胞或膽管細胞以及有孔內皮細胞。間充質特異性基因hlx和jumonji的突變將阻斷肝臟發育，從而闡釋了該組織貢獻的重要性。在其發育早期，肝臟由成簇的近肝干細胞組成，其由缺乏基膜的連續內皮細胞和豐富的造血細胞包圍。在內皮細胞轉化成為非連續的有孔內皮細胞時，維管結構尤其是肝門維管結構隨著基膜的產生發育程度更高。肝門條間部可能為膽管發育提供引發機制，并且由于它環繞門靜脈、肝動脈和膽管，而形成了肝門三聯體。很可能是為了應答諸如C-CAM105、Agp110、E-鈣粘連蛋白和連接蛋白的組織形成分子在數量和分布上的變化，近肝干細胞迅速增殖并且形成實質肝板，同時伴有多數但并非所有造血細胞再定位于骨髓之中。最近的研究提示某些造血祖細胞存留于成年靜息的嚙齒類動物的肝臟中，并且已從成年人類和鼠的肝臟中都分離到造血干細胞(Crosbie，O.M.等1999.Hepatology.291193-8)。
大鼠肝臟在胚胎周期的大約第10天形成，稱之為“胚胎第10天”或E10，其中位于胚胎中腸區的內胚層的心臟間充質內陷(Zaret，K.1998.Current Opinion in Genetics & Development.8526-31)。胚胎中肝臟細胞的最早識別是利用編碼α-胎蛋白(AFP)的mRNA的原位雜交研究實現的(ZARET，K.1998.Current Opinion in Genetics &Development.8526-31；Zaret，K.1999 Developmental Biology(Orlando).2091-10)。在第9-10天，在所有測定的大鼠和小鼠肝臟中接近于產生心臟的間充質的胚胎中腸區觀察到AFP表達細胞。到E12時，肝臟肉眼可見，并且到E13時直徑大約為1mm。
與之并行的是，隨著第一個可識別的造血細胞在E15-E16(嚙齒類動物)以及第3到第4個月(人類)的出現而產生造血作用，并且紅細胞生成(紅細胞樣細胞或紅細胞的形成)的高峰發生在E18(嚙齒類動物)以及第5到第6個月(人類)。在紅細胞生成高峰時，紅細胞的數目在肝臟中占優勢地位，并且占肝臟中多于70％的細胞數目。妊娠期結束時在嚙齒類動物中是第21天，而在人類中是第9個月。在分娩的幾個鐘頭內，造血細胞的數目急劇下降，以至于到出生后周期的第2天(嚙齒類動物)以及一周或兩周內(人類)，絕大多數造血細胞消失遷往骨髓。無人知曉造血細胞遷移的原因。不過存在兩種主要的猜測。
第一種，造血祖細胞偏好相對厭氧的條件，并且隨著肝臟中氧氣水平因肺活動的升高，它們中的多數遷往骨髓(這里相對是厭氧的)。另外，存在孕激素的喪失也可能是遷移因素的猜測。出生后，肝臟中造血祖細胞的喪失與肝祖細胞數目的顯著下降以及成熟肝細胞和膽管細胞數目的并行上升有關。肝臟的完全成熟在出生后周期的2-3周(嚙齒類動物)以及數月內(人類)完成。此時殘余的肝祖細胞分布在赫令氏管區，而主要數目的肝祖細胞存在于各肝腺泡外周的肝門三聯體中(Thiese等，Crawford等)。
此后，肝腺泡的典型構造得以確立，其中各肝腺泡外周由6組肝門三聯體保衛，每組具有膽管、肝動脈和肝經脈，并且中心是與腔靜脈相連接的中央靜脈。肝臟細胞板象輪子的輻條一樣，自中心向外周延伸。按照慣例，將所述板分為三個區1區靠近肝門三聯體；2區在腺泡中；而3區靠近中央靜脈。肝臟中僅有的雙倍體細胞位于1區中；四倍體細胞位于2區；而四倍體、八倍體及多核細胞位于3區。該模式高度暗示了一種終止于細胞凋亡程序的成熟譜系(Sigal，S.H.，S.等1995.Differentiation.5935-42)。
3.肝臟疾病在美國，每年有大約250,000人因肝臟衰竭而住院。肝臟移植能夠有效地治療某些類型的肝臟衰竭，每年在美國進行大約4,100例移植。肝臟移植的限制因素之一是供體肝臟的可獲得性，特別考慮到用于器官移植的供體肝臟必須是源自經歷腦死亡而非心臟停滯的患者的限制。來自尸體供體的肝臟未曾成功過，盡管最近使用此類供體的努力已經支持了如果在死亡1小時之內獲得肝臟，則可以使用它們的可能性。
對多數肝臟疾病而言，將細胞移植到肝臟中是有吸引力的替代性療法。用于細胞移植的手術操作相對于全器官移植所需的手術操作是微不足道的，因而可用于具有多種手術風險的患者，例如老年或體弱者。使用人類肝臟細胞優于源自其它哺乳動物的肝臟細胞，因為潛在的病原(如果有的話)是人源的，可被患者更好地耐受，且在用前可容易地加以篩選。
進行肝臟細胞移植的嘗試中使用過未分級的成熟肝臟細胞，并已顯示出某些程度的功效(Fox，1.J.等，1998.New England Journal ofMedicine.3381422-1426)。然而，由于這些細胞在體內不生長，所以需要注射大量的細胞(2×1010)才能成功。而且，引入大量成熟的大肝臟細胞(平均細胞直徑30-50μm)由于在注射時傾向于形成巨大的聚集體而復雜化，導致潛在的致死性的栓子。另外，這些西北引起顯著的免疫注射反應，從而使患者需要免疫抑制性藥物才能維持其剩余的肝臟。最后，成熟的肝臟細胞還不能成功地低溫保藏，因而需要復雜的后勤來協調合適的肝臟組織的可獲得性、細胞懸液的制備以及用于臨床治療的細胞的即刻遞送。
4.全能干細胞干細胞是基于細胞的肝臟疾病的替代性療法。全能干細胞是能夠自我復制、多能，即能產生多種命運的子代細胞的原始細胞，其能夠廣泛地發育，產生能重建組織(一種或多種)的定向干細胞。多數關于干細胞的文獻來自于有關胚胎的文獻或者有關造血、表皮或腸組織的文獻。
最近，該定義得到了修正，以區別特定類型的干細胞。具有參與所有細胞類型，如生殖細胞的發育的潛能的那些干細胞被稱之為全能干細胞，包括受精卵和達8細胞階段(桑椹胚)的正常胚胎細胞。胚胎干細胞也稱為″ES″細胞，包括源于胚泡中全能的正常細胞的永久細胞群，最初報道于20世紀80年代早期。ES細胞系可在體外培養并保持全能性。當將ES細胞注射回到正常的胚泡中時，它們能夠繼續胚胎發育，并參與形成正常但嵌合的小鼠。盡管已用許多物種(小鼠、大鼠、豬等)建立了ES細胞系，但只有小鼠系統，通過將培養的修飾ES細胞與胚泡合并，然后將所述胚泡植入到假孕宿主中而被常規地用于產生具有新表型(敲除、轉基因)的動物。胚胎生殖(EG)細胞系，其表現出ES細胞的多種特征，可在體外直接地從原生殖細胞群中分離。與ES細胞一樣，當注射到胚泡中時，EG細胞促成嵌合體包括生殖細胞系的形成。
最近，大量公開的實驗報道了人類ES細胞培養物可用人類胚胎建立。已有提示這些人類ES細胞可注射到組織中，希望它們能夠重建受損的器官和組織。然而，如果將ES和EG細胞引入到免疫受損宿主中除子宮以外的任何部位，都將導致腫瘤發生，形成畸胎癌。所以將人類ES細胞接種到患者中是不現實的，并具有在患者中造成腫瘤的嚴重可能性。為了克服這種僵局，某些研究小組正尋求在限定的微環境條件下分化ES細胞，使之成為能夠安全地接種到患者中的定向干細胞。例如，在產生造血祖細胞方面已有某些程度的成功。不過，如果將培養物接種到患者中，仍然存在培養物中殘留的ES細胞可能構成腫瘤發生風險的顧慮。總之，在發育生物學將胚胎發生期間決定細胞命運的種種控制揭示出來以前，ES細胞仍將作為用于細胞或基因治療的臨床項目的幾乎沒有希望的實驗工具。細胞和基因治療的臨床項目的唯一現實的選擇是使用遺傳潛能限于有限數目的細胞類型的定向干細胞。
5.定向干細胞定向干細胞是將其遺傳潛能限于有限數目的細胞類型并具有廣泛的發育潛能的多能細胞。越來越多的證據(例如來自端粒酶領域的證據)表明定向干細胞嚴格地說來并不能自我復制，也就是說它們的子代比親代具有更小的發育潛能。定向干細胞產生定向祖細胞，即通過將其遺傳潛能限于單一命運而喪失多能性的子代細胞，例如其定向祖細胞被稱為定向肝細胞祖細胞的肝細胞。在肝譜系中，存在定向肝細胞祖細胞(產生肝細胞)和定向膽管祖細胞(產生膽管)。
干細胞向成人細胞的轉變以階梯式的進程進行，產生成熟譜系，其中細胞大小、形態、發育潛能和基因表達有賴于該譜系。衰老的比喻說法可用于定義該進程。“年輕”細胞具有早期基因表達和最大的發育潛能；譜系中的晚期細胞具有“晚期”基因表達，且通常發育受限或根本不發育。所述晚期細胞可看作是“老年”細胞，或者生物學術語中的凋亡細胞，其最終被拋棄。成熟譜系進程引起組織的自然周轉，并允許損傷后的再生。組織在成熟進程的動力學方面有所差異。腸的成熟譜系相當迅速，完整的一個循環在不到一周的時間內完成；而肝臟的成熟譜系緩慢發生，在大鼠肝臟中大約是1年。
由于此類細胞群在肝臟疾病的治療中可能具有效果，所以對從肝臟中分離和鑒定未成熟祖細胞有著強烈的臨床和商業興趣。在細胞和基因治療中使用肝祖細胞能夠克服上述與使用成熟肝臟細胞相關的缺點。所述細胞不大(7-15μM)，從而使得巨大栓子的形成最小化。并且，所述細胞具有廣泛的發育潛能，這意味著重建患者的肝臟組織需要更少的細胞。最后，祖細胞具有最小限度的可能引發免疫排斥的抗原標志，提供了可能需要很少或者無需免疫抑制藥物的希望。
6.肝祖細胞的分離已知從肝臟中分離肝臟祖細胞是極具挑戰性的任務，這是由于肝臟細胞缺乏陽性選擇標記。候選肝祖細胞唯一可用的抗體是針對肝祖細胞亞群(如果是從暴露于致癌劑侵害后的宿主中分離的則被稱之為卵形細胞)制備的單克隆抗體。然而，這些抗體與存在于造血細胞中的抗原發生交叉反應。
術語卵形細胞來自于致癌作用和腫瘤發生領域的無數研究。暴露于致癌物或其它致癌劑侵害的動物會發生成熟肝臟細胞的顯著喪失(被多種侵害殺死)，并且繼發地，具有卵形細胞核并攜帶有由肝細胞抗原及造血細胞抗原組成的標記的小細胞(直徑7-15μM)發生擴增(Grisham和Thorgeirrson，1998)。對卵形細胞的研究形成了這樣的假說，即它們是肝祖細胞，在致癌劑侵害的條件下被激發擴增，而且在合適的條件下可發展為腫瘤細胞。卵形細胞的表型以細微或者非細微的方式變化，這取決于致癌劑侵害。而且，已知它們在培養物中可容易地建立，無需特殊的飼養細胞或培養基條件(J.Grisham和S.Thorgeirrson，1998，Hepatic Stem Cells，InStem Cells，C Potten，editor，Academic Press，NY)。基于這些發現以及有關描述來自致癌劑處理的某些細胞系的特征的研究，人們了解到肝臟腫瘤是惡性轉化的祖細胞，而且卵形細胞是部分或者完全轉化的祖細胞(Zvibel I，Fiorino A，BrillS和Reid LM.Phenotypic characteriztaion of rat hepatoma cell lines andlineage-specific regulation of gene expression by differentiation agents.Differentiation 63215-223，1999)。
過去曾嘗試獲取肝祖細胞群，其被認為是用于肝臟的細胞和基因治療的最為通用的細胞群。美國專利No 5,576,207和5,789,246(Reid等)使用細胞表面標志和側向散射流式細胞儀提供了肝臟中限定的亞群。通過去除譜系的定向細胞，接著選擇未成熟肝祖細胞已經分離了大鼠肝臟細胞亞群，所述未成熟肝祖細胞是作為攜帶OC.3-陽性(卵形細胞抗原標志)、AFP-陽性、白蛋白-陽性和CK19陰性(細胞角蛋白19)細胞標志的非粒細胞檢測的。前述大鼠肝臟亞群顯示了在從嚙齒類肝臟中分離和鑒定富集的肝祖細胞中很重要的特定特征。
從而，存在著發展分離人類肝祖細胞的方法的需求，它可用于治療具有肝臟疾病或機能障礙的患者。本發明滿足這種需求，而且也提供了治療方法。
發明概述本發明涉及包括人類原肝干細胞的組合物，所述原肝干細胞是近肝干細胞、肝細胞祖細胞或膽管祖細胞的前身。本發明的人類原肝干細胞表達ep-CAM、AC133和白蛋白。
本發明的另一個實施方案是包括人類近肝干細胞的組合物，所述近肝干細胞是干細胞或膽管祖細胞的前身。本發明的人類近肝干細胞表達α-胎蛋白、白蛋白和細胞角蛋白19。
本發明的另一個實施方案是分離人類肝祖細胞的方法，包括鑒定表達ep-CAM和AC133的細胞。由本方法分離到的人類肝祖細胞優選表達白蛋白。在本發明優選的實施方案中，分離的人類肝祖細胞是干細胞，優選為原肝干細胞或近肝干細胞。
本發明的另一個實施方案是分離人類肝祖細胞的方法，包括在選擇人類原肝干細胞的條件下，用無血清培養基表面培養來源于人類肝組織的細胞混合物，所述培養基包括碳水化合物代謝調節劑、鐵載脂蛋白和膜產生因子，藉此形成含有人類原肝干細胞的集落。在本發明優選的實施方案中，分離的人類原肝干細胞表達ep-CAM、AC133和白蛋白，并且優選還表達細胞角蛋白8/18和細胞角蛋白19。
本發明的另一個實施方案是分離人類近肝干細胞的方法，包括在選擇人類肝干細胞的條件下，用無血清培養基表面培養來源于人類肝組織的細胞混合物，所述培養基包括碳水化合物代謝調節劑、鐵載脂蛋白和膜產生因子，藉此形成包括人類原肝干細胞的集落，并用發育因子培養來自該集落的細胞。在本發明優選的實施方案中，分離的人類近肝干細胞表達α-胎蛋白、白蛋白和細胞因子19。在本發明優選的實施方案中，發育因子由第二細胞提供，優選為飼養細胞，優選是STO飼養細胞、內皮細胞或基質細胞。
本發明的另一個實施方案是分離人類近肝干細胞的方法，包括在選擇人類肝干細胞的條件下，用無血清培養基培養來源于人類肝組織的細胞混合物，所述培養基包括碳水化合物代謝調節劑、鐵載脂蛋白和膜產生因子，藉此形成包括人類原肝干細胞的集落，并用發育因子培養來自該集落的細胞。在本發明優選的實施方案中，分離的人類近肝干細胞表達α-胎蛋白、白蛋白和細胞因子19。在本發明優選的實施方案中，發育因子由第二細胞提供，優選為飼養細胞，優選是STO飼養細胞、內皮細胞或基質細胞。
本發明的另一個實施方案是分離的原肝干細胞。而本發明的又一個實施方案是分離的人類近肝干細胞。
附圖的簡短說明

圖1顯示了塑膠培養基上塑膠培養富集的胎兒實質細胞第1天(上圖)和第5天(下圖)形成的集落。
圖2顯示了從第5天到第14天在塑膠培養基上形成的集落。
圖3顯示了塑膠培養基上的集落形態。
圖4顯示了塑膠上集落細胞白蛋白(第1排)、CK19(第2排)、ep-CAM(第3排)和NCAM(第4排)的染色。
圖5塑膠上培養的集落的CD146和CD133(頂部)以及AC133(底部)的染色。
圖6顯示了近干細胞在STO飼養層原代培養7天后的白蛋白(第1排)、α-胎蛋白(第2排)和CK19(第3排)染色。
圖7顯示了從塑膠培養物中取出并涂布到STO細胞飼養層上的集落細胞的發育。
圖8-11顯示了在STO飼養層上集落細胞的萌發。
圖12和13顯示了人類肝臟細胞中AFP表達細胞的富集。
圖14-18顯示了共表達白蛋白、CD133和EP-CAM的成人肝臟細胞亞群的分離。
圖19描繪了在塑膠上培養的來自3個肝的9個干細胞在3周內的生長曲線。生長測量起始于培養12天后。曲線表明細胞生長增倍時間為5.2天。
圖20描繪了新分離的胎兒肝臟細胞中及其隨后在塑膠基質上培養期間的白蛋白(ALB，上組)和α-胎蛋白(AFP，下組)表達的蛋白質印跡。
左邊的組中顯示了基于FICOLL離心的兩種細胞級分(P和I)。沉淀在FICOLL中的細胞被命名為P，而分層在水相介質和FICOLL之間的細胞被命名為I。單個居中的斑點顯示了在塑膠上培養3周的純化的集落細胞(原肝干細胞)中白蛋白和AFP的表達。右邊的圖表顯示了沒有蛋白(空白)、有白蛋白(ALB)或胎蛋白(AFP)標準的對照泳道。各泳道中加樣10ug蛋白。
發明詳述1.定義在隨后的描述中，廣泛使用了大量術語以描述本發明。為了對說明書和權利要求書，包括此類術語所給出的范圍，提供清楚和一致的理解，提供如下定義。
CD“分化簇”或“共同決定簇”，在本文中用來指被單克隆抗體識別的細胞表面分子。某些CD的表達對特定譜系或成熟路徑的細胞具有特異性，而其它CD的表達則隨著同一細胞的激活、位置或分化的狀態而變化。
細胞治療在本文中，術語“細胞治療”是指將用作自體或同種異體材料的已知細胞群在體內或離體轉移，并移植到患者特定的靶細胞或其附近。細胞可在任何合適的培養基、載體或稀釋劑中，或者在包括有微載體、珠子、微粒體、微球體、囊泡等的任何類型的藥物遞送系統中移植。它們也可用在生物反應器中，在那里它們提供關鍵的功能，并且生物反應器作為輔助裝置用于肝臟機能障礙的患者。
定向祖細胞產生只有一種命運的子代細胞的高度增殖細胞。“膽管定向祖細胞”產生膽管，并且可通過細胞角蛋白19而不是AFB的表達來從抗原上識別。“肝細胞定向祖細胞”產生肝細胞，并且可通過AFP和白蛋白而不是細胞角蛋白19的表達來從抗原上識別。定向過程在分子水平上還不了解。而僅憑經驗認識到當細胞的命運較之于其祖先縮窄時，就發生了定向過程。
基因治療在本文中，術語“基因治療”是指將已知遺傳物質在體內或離體轉移到患者特定的靶細胞中，從而改變了基因型，在大多數情況下，還改變那些靶細胞的表型，用于實現預防或改變特定疾病狀態的最終目的。這可包括離體修飾靶細胞并將細胞引入到患者中。可選地，以肝祖細胞為靶的載體可以在體內運輸外源遺傳物質和轉染祖細胞。此外，遺傳工程化的祖細胞可用于生物反應器以治療患者或作為生物制品的來源。正如本定義所陳述的那樣，根本的前提是這些治療性的基因操作設計的最終目的是用于預防、治療或改變明顯的或隱性的病理狀態。在多數情況下，基因操作的最終治療目的是改變特定靶細胞群的表型。
肝細胞肝臟細胞亞群，包括肝細胞和膽管細胞。
肝祖細胞干細胞亞群，這些細胞最終產生包括肝細胞和膽管細胞的成熟實質細胞。肝祖細胞包括如下兩個亞群(a)肝干細胞和(b)定向祖細胞。
肝干細胞肝祖細胞亞群，包括“原肝干細胞”和“近肝干細胞”。前身如本文所用，術語“前身”是指產生第二類細胞的第一類細胞。前身可直接產生第二類細胞。前身也可通過一個或多個其它中間細胞類型產生第二類細胞。
原肝干細胞在本文中，術語“原肝干細胞”是指產生近肝干細胞的肝干細胞。
近肝干細胞在本文中，術語“近肝干細胞”是指產生肝細胞和膽管上皮細胞的肝干細胞。
肝臟細胞在本文中，術語“肝臟細胞”是指存在于正常肝臟中的所有類型的細胞，不管其來源或命運如何。
干細胞在本文中，術語“干細胞”是指能夠產生具有不止一種命運的子代細胞的高度增殖細胞，也就是它們是多能的。全能干細胞，例如胚胎干細胞(ES細胞)或哺乳動物胚胎達8細胞階段的胚胎細胞，具有自我更新(自我維持)的能力，其中的干細胞產生與其自身完全相同的子代細胞。相比之下，定向干細胞，例如造血、神經元、皮膚或肝干細胞，是多能的并且具有廣泛的發育能力，但具有可疑的自我更新能力。對于全能干細胞，其有些子代細胞與親代完全相同，而有些則“定向”于特定命運(一種或數種)，將其遺傳潛能局限得比親代少。對于定向干細胞，有些子代細胞保留了多能性，而有些則喪失了，而定向于單一的特定命運。
當術語“一種”、“一”或“一個”用于該公開文本中時，它們的是指“至少一種”或者“一個或多個”，除非另行指出。
2.肝譜系的診斷標志α-胎蛋白(AFP)和白蛋白均為胞漿蛋白質，當作為蛋白測定時，是特別可靠的肝譜系標志。編碼這些蛋白變體形式的信使RNA在造血祖細胞中表達但不翻譯；例如，AFP mRNA的變體形式與肝細胞中的不同，外顯子1的編碼序列被選擇性外顯子1或兩外顯子替換(Kubota，Storm和Reid，已遞交，也在專利申請中)。因此，這兩種蛋白質的表達是從肝臟的其它細胞類型中鑒定肝亞群的基礎。在發育中的肝臟內，AFP和白蛋白的存在被當作肝祖細胞的強陽性指示劑。在肝臟發育的最早期，這些細胞能夠產生進入膽管和肝細胞兩種譜系的后代。如果這些子代細胞定向于膽管譜系，則AFP的表達終止。不過，AFP的表達繼續存在于肝細胞譜系中，直到圍產期期間它被抑制為止，使得白蛋白的表達成為成年肝細胞的主要特征之一。
3.人類肝臟祖細胞的加工肝臟細胞的分離通常包括將組織酶促和機械解離為單細胞懸液，接著是密度梯度離心、離心式淘洗、差異性酶促消化(即肝衛星細胞)分級，和/或進行細胞培養選擇(在Freshney，″Culture of Aimal Cells，AMANUAL of Basic Technique″1983，ALAN R LISS，Inc.NY中有綜述)。肝臟組織可從胎兒、新生兒和嬰兒(出生到1歲左右)、兒童(1歲至青春期)或成人(青春期后)處獲得。優選使用密度梯度離心分級和分離不同的細胞群(如成肝細胞)。
4.近肝干細胞及其它祖細胞的培養近肝干細胞和定向肝祖細胞需要胚胎肝臟基質飼養細胞和補充有已知激素和生長因子的無血清培養基[1-6]。如果將胚胎肝臟基質飼養細胞替換為STO飼養細胞，并與補充有胰島素、轉鐵蛋白/Fe和優選的皮質醇激素的成分確定的無血清培養基混合，就會發生近肝干細胞、定向祖細胞以及雙倍體成年肝臟細胞關鍵標志的集落擴增和增長維持[7]。假設這些條件支持不同種范圍的來自胎兒組織的祖細胞，甚至支持雙倍體成年細胞的集落形成[7]，則需要不同的條件選擇原肝干細胞。
5.原肝干細胞的分離本發明涉及從人類肝臟組織中分離原肝干細胞的方法，包括將來自肝臟組織的細胞懸液，優選富集了實質細胞的細胞懸液施加到塑膠表面并將細胞置于消除成熟肝臟細胞、近肝干細胞和定向祖細胞的嚴格培養條件下。嚴格培養條件包括使用無血清培養基，補充有碳水化合物代謝調節劑、鐵源、膜產生因子，優選補充有抗氧化劑。
優選的碳水化合物代謝調節劑是胰島素。優選的鐵源是轉鐵蛋白。優選的膜產生因子是包括一種或多種脂肪的組合物，最優選是游離脂肪酸。優選的抗氧化劑是硒。無血清培養基優選還補充有皮質醇。肝臟組織優選獲自于胎兒、新生兒、嬰兒、兒童、青少年或成人，最優選來自胎兒。
原肝干細胞通過在塑膠表面上以低細胞密度(例如1000-2000細胞/cm2)培養肝臟來源的細胞懸液來分離。嚴格培養條件使來自人類肝臟的原肝干細胞出現，它是近肝干細胞的前身。這些來自人類肝臟的原肝干細胞共表達Ep-CAM、AC133、CK8/18、CK19和白蛋白，并且它們的亞群表達N-CAM、CAM 5.2和c-kit。
本領域技術人員將會意識到本發明可用于分離來自其它組織類型的原代細胞。
6.近肝干細胞的分離人類近肝干細胞產生肝細胞或膽管上皮，或者它們的組合。人類近肝干細胞共表達Ep-CAM、CK8/18、細胞角蛋白19、α-胎蛋白，且亞群表達AC133。人類近肝干細胞可通過多種方法分離，包括(i)免疫選擇共表達EP-CAM的細胞，(ii)用發育誘導因子培養肝臟來源的細胞懸液，優選富集了實質細胞的細胞懸液，或者(iii)用發育誘導因子培養人類原肝干細胞。所述發育誘導因子優選由第二細胞提供。優選的第二細胞包括STO飼養細胞、胚胎肝臟基質細胞或內皮細胞。
7.通過免疫選擇分離肝祖細胞本發明也涉及基于肝祖細胞特異性的免疫選擇性細胞表面標志而從肝臟來源的細胞懸液中分離肝祖細胞的方法。肝祖細胞可根據本發明選擇表達ep-CAM的細胞而得到分離，并且優選選擇還表達AC133的那些細胞。本發明免疫選擇的肝祖細胞優選還表達白蛋白，并且最優選還表達細胞角蛋白19。優選地，免疫選擇的肝祖細胞是干細胞。
在本發明的一個實施方案中，分離的肝祖細胞是原肝干細胞。在本發明的另一個實施方案中，分離的肝祖細胞是近肝干細胞。
8.肝祖細胞的生產本發明也涉及由肝原肝干細胞生產近肝干細胞和定向祖細胞的方法，包括直接將原肝干細胞涂布到STO飼養層上和HDM中，或者通過將來自培養塑膠上的菌落中的原肝干細胞轉移到STO飼養層上，而使近肝干細胞從原肝干細胞菌落中顯現出來。
近肝干細胞和定向祖細胞也可以通過在未涂敷的表面上培養而從原肝干細胞中產生，包括在皮氏培養皿(優選是不帶電荷的聚苯乙烯表面)、組織培養塑膠(優選是暴露于電離氣的聚苯乙烯表面，從而該聚苯乙烯朝細胞連接的一側被極化，帶有優勢的陰性(或陽性)電荷取向)、微載體(優選是細胞能夠結合到上面的培養珠)、紡織品(優選尼龍、棉線、聚酯)、合成支架(優選由聚丙交酯、聚(丙烯延胡索酸酯)、聚(鄰酯)或其它合成材料制成)或者海綿(優選天然或合成海綿)上培養。
近肝干細胞和定向祖細胞也可以通過在生物學表面上培養而從原肝干細胞中產生。生物學表面可以涂敷到或制備到上述范疇的表面上。從而，例如，人們可將胞外基質涂層涂敷到皮氏培養皿、微載體或紡織品上。本發明所用的生物學表面包括(i)胞外基質(由細胞產生的且位于外部及細胞之間的蛋白質和碳水化合物的復雜混合物，并且包括膠原、粘附蛋白、蛋白聚糖及其它蛋白)，(ii)胞外基質組分(個別純化的基質組分，單獨或者聯合使用以優化細胞的連接、生長和/或組織特異性功能的表達，包括纖連蛋白，層粘連蛋白，膠原(存在20多種膠原家族)，包括I型膠原、III型膠原、IV型膠原(這三種是現今細胞培養中最常用的)，細胞粘附分子或″CAM″，其中某些是鈣依賴性的，而某些不是，以及蛋白聚糖(由其上連接了一個或多個粘多糖鏈(葡糖醛酸或艾杜糖醛酸+氨基糖二聚體單元的聚合物)的核心蛋白組成的分子)的表達。包括硫酸軟骨素蛋白聚糖、硫酸皮膚蛋白多聚糖、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖、肝磷脂蛋白聚糖)，(iii)富集了胞外基質的組織提取物，包括Matrigel(可移植鼠胚胎細胞癌的尿素提取物，可涂敷到組I給出的任何表面上)、ECM(使用稀堿、稀去污劑、高鹽抽提、尿素等的培養細胞的提取物，并留下富集了胞外基質組分的浸出物涂敷表面(組I中任一種))、羊膜基質(用稀堿、稀去污劑、高鹽抽提、尿素等提取羊膜，并留下羊膜中存在的基質組分)以及生物基質(用高鹽(如＞3M NaCl)和核酸酶提取組織，以留下所有的組織膠原及任何結合的組分例如粘附蛋白)，(iv)血清涂層(如用血清涂敷皮氏培養皿或組織培養皿，則要添加粘附蛋白，特別是纖粘連蛋白，以高水平存在于血清之中)，和(v)多聚賴氨酸或多聚亮氨酸(具有這些正電荷氨基酸的涂層被用來優勢地連接上皮細胞)。
近肝干細胞和定向祖細胞也可以通過在Atala和Robert P.Lanza編輯，Methods of Tissue Engineering.Academic Press，New York 2002中所述的條件下培養而從原肝干細胞中產生，在此并入作為參考。本發明生產的肝祖細胞包括原肝干細胞和近肝干細胞、肝細胞定向祖細胞以及膽管定向祖細胞。
9.治療方法本發明分離的祖細胞可用于肝臟指向的細胞和/或基因治療，或作為生產病毒(如丙型肝炎)的宿主細胞來產生疫苗。并且，本發明的祖細胞可自肝臟生檢(如穿孔活組織切片檢查)離體擴增，并且擴增的細胞可用于自體或同種異體細胞或基因治療，或者用于種植到生物反應器中以建立生物人工肝臟，其可用于臨床或用于學術研究。這將消除侵入性大外科手術切除患者肝臟的必要。
祖細胞一旦在培養物中建立，就可利用多種不同基因遞送載體系統中的任一種來進行基因轉移。本發明的祖細胞的生長特征允許在離體基因轉移中使用某些基因遞送載體(即逆轉錄病毒載體)，這就要求細胞增殖，以用于有效的基因插入和表達。
基因治療的替代途徑是設計祖細胞的特異性靶向載體，然后直接地注射給患者，使該載體與目的基因偶聯，該載體就會靶向并修飾內源祖細胞群。
本發明的祖細胞可用于自體或同種異體肝臟指向的細胞或基因治療。顯然，使用自體肝祖細胞將消除有關移植細胞排斥的重大顧慮。本發明的祖細胞對于同種異體細胞轉移尤其具有吸引力，因為它們的抗原特性意味著最小化的免疫排斥現象。
一旦分離純化并培養了自體或同種異體祖細胞，它們就能夠被遺傳修飾或保持完整，在體外擴增，然后植回到宿主中。如果遺傳修飾是有益的，那么在遺傳修飾后和移植前，那些遺傳修飾的細胞就可以擴增和/或基于顯性選擇性標記的摻入和表達予以選擇。移植可返回到肝區室或者異位或異位移植部位。對于移植到肝區室，可使用肝門靜脈輸注或脾內注射。脾內注射是可選擇的給藥路徑，是因為經由脾內注射移植的肝祖細胞移往肝區室。
另外的醫學操作可能有助于移植的肝祖細胞肝嫁接的功效。動物模型已證明在部分肝切除術中，給藥血管生成因子及其它生長因子可有助于移植的肝細胞的嫁接和生存能力。替代途徑是將遺傳修飾的祖細胞移植到異位。
迄今為止，存在著與肝細胞治療途徑相關的問題，包括細胞來源、不能低溫保藏細胞、栓子形成以及免疫排斥等。當前肝細胞治療途徑的問題可能是歸因于所用的供體細胞主要為成人肝臟細胞并且分離和再注射后生命短的事實。另外，使用成人細胞導致強烈的免疫排斥。本發明的祖細胞提供了極大的功效，這是因為它們引發免疫排斥現象的能力有限，它們能夠低溫保藏，從而提供了對其組織分類的時機(從而使供體細胞與受體匹配)并且提供了“離架”(off-the shelf)產品，還因為它們具有廣泛的再生潛能。
有關基因治療，現行的努力是使用“靶向可注射載體”，這是發展中的最流行的臨床治療路徑。這些途徑由于免疫學問題和載體的瞬時表達而具有有限的功效。證明有價值的唯一基因治療路徑是離體基因治療，并且該路徑幾乎是專一性地在造血祖細胞中進行。我們預言使用祖細胞的離體基因治療(或使用在某種程度上靶向那些祖細胞的可注射載體)將證明更為有效，因為載體可被離體引入到純化的祖細胞、體內選擇和再引入的修飾細胞中。祖細胞的優勢在于它們巨大的擴增潛能，它們最小程度地(如果有的話)誘發免疫學反應，或者它們對與受體的免疫學表型類型相同或匹配的組織的能力，以及它們分化產生肝細胞和膽管細胞的能力。
10.其它用途人類肝原肝干細胞和近肝干細胞的用途眾多并且多樣。它們包括1)研究人類細胞；2)生產疫苗或抗病毒劑；3)毒物學研究；4)藥物研發；5)蛋白質生產(利用細胞作為宿主，生產多種人類特異性因子)；6)肝臟細胞治療；7)肝臟基因治療；和8)可用于科研、毒物學和抗微生物研究、蛋白質生產、或臨床上作為肝臟輔助系統的生物人工肝臟。考慮到原肝干細胞和近肝干細胞分化為肝細胞和膽管細胞的能力，本發明的細胞可用于肝或膽命運，取決于它們所置于的微環境。
人類肝祖細胞(所有四類)的可獲得性將使得能夠對人類細胞進行更為深入的研究，將促進成功形式的肝臟細胞及基因治療的發展，并且應當能夠發展人類生物人工肝臟用于科研和作為臨床輔助裝置。目前，有限的健康人類組織的供應排除了肝臟細胞治療和人類生物人工肝臟的臨床項目。所述祖細胞群應當具有足夠的擴增潛能來克服，至少極大地緩解這種有限的供應。而且，相對于成熟肝臟細胞，這些細胞及其中間后代在冷熱情況下均表現出對局部缺血的偏好性存活，說明不能用于肝臟移植或用于生產健康成熟肝臟細胞的肝臟是祖細胞的來源。
本發明將通過如下非限制性的實施例舉例說明。
實施例1由胎兒組織制備肝細胞懸液肝臟組織通過選擇性終止妊娠從18-22周妊娠齡的胎兒中獲得。肝臟組織樣品在補充有180％胎牛血清的RPMI 1640中過夜運送。
在細胞緩沖液(補充有牛血清白蛋白(BSA級分V，0.1％，Sigma，St.Louis，Mo.)、亞硒酸(300PM)和抗微生物劑混合物AAS(GibcoBRL/Invitrogen Corporation，Carlsbad，California)的RPMI)中初步洗滌后，組織體積的范圍從2到12mL。根據需要肝臟組織再細分為3mL或更少的級分，用于在25mL含IV型膠原酶和脫氧核糖核酸酶(Sigma，St Louis，Mo.；均為6mg/mL)的細胞緩沖液中消化。溫育于32℃頻繁攪動進行15-20分鐘，并產生均質的細胞聚集體懸液。然后使懸液穿過40的標準篩并于1200RPM旋轉5分鐘，之后重懸于Hanks緩沖鹽溶液的無鈣溶液中，補充有EGTA(0.2mM，Sigma)、Hepes(20mM，Boehringer Mannheim)、BSA(0.1％Sigma)、DNase(0.01％Sigma)，并稱之為HBSS mod。
酶促消化的懸液包括造血和肝亞群。酶促消化懸液的抗原特性示于表1，其中AFP表達細胞為原始細胞懸液的6-9％(圖12)，并具有相當比例的白蛋白表達細胞和顯著污染的造血細胞(見表1中CD45和血型糖蛋白A表達細胞的百分比)。如果低溫保藏原始細胞懸液，某些細胞例如紅細胞就會丟失，使得白蛋白和AFP表達細胞富集至15-20％(表1)。不過，最顯著的富集隨著膠原酶的部分酶促消化發生，產生實質細胞的聚集體，其隨后如下文所述通過反復低速離心從非實質(漂游)細胞中分離，并產生多于80％的白蛋白和AFP表達細胞的細胞懸液(表1)。
然后通過在HBSS mod中以30g(300RPM)反復低速離心5分鐘從實質細胞級分中分離造血細胞(主要是紅細胞和成紅細胞)和漂游非實質細胞。將沉淀重懸于40ml HBSS mod中并重新離心，直至顏色顯示最小程度的紅血細胞污染。正常地，如他人所報道的那樣，這需要4或5個循環的離心和重懸[14，15]。通過在新鮮膠原酶溶液中進行另一輪酶促消化使結塊最小化，然后通過50μm的尼龍網過濾，并將細胞返至無鈣緩沖液中。
將所得的細胞懸液洗滌兩次，隨后將5mL各含大約2×107個細胞的小份鋪層到50mL Falcon管中的5mL Ficoll Hypaque(AmershamPharmacia，Piscataway，NJ)上，并于3000RPM旋轉20分鐘。來自界面和沉淀的細胞分別重懸于涂板培養基(含補充物的RPMI)中，并且每種的一小份用錐蟲藍染色計數，并由血球計評估存活力。細胞存活力常規地高于95％。用于富集實質細胞的低速離心法除去了造血細胞成分，留下大約為80％AFP表達細胞的細胞懸液。由于它們表達AFP、白蛋白和CK19而不表達造血細胞標志，因此大多數AFP表達細胞是近肝干細胞(表1)。
表1.對新分離的胎兒肝臟細胞的流式細胞儀分析
OCS＝原始細胞懸液；C-OCS＝在專利緩沖液中低溫保藏的原始細胞懸液。細胞稍后融化，然后分析標志的表達。許多細胞特別是紅細胞(去核亞群)低溫保藏不存活。實質細胞制備物＝通過反復低速旋轉離心消除紅細胞和其它漂游非實質細胞之后；n.d.＝未作分析。
實施例2由成人組織制備肝細胞懸液人類肝臟獲自于經授權的器官獲取機構。供體為遭遇腦死亡的13歲女子。肝臟利用全器官灌注技術消化。然后在Cobe 2991細胞洗滌器中使用2步Optiprep梯度(9-12.5％)將單細胞懸液分級分離以獲取存活細胞。然后從殘留的死亡細胞中通過將9％(帶1)和12.5％(帶2)的分級細胞分別地與25％Optiprep混合進一步在Cobe 2991中分級分離而分離肝臟細胞。根據正向和側向散射參數的流式細胞儀分析，帶1和帶2的細胞組成似乎相似。細胞被低溫保藏。
實施例3成年人類肝臟細胞的集落形成為通過集落形成評估肝臟干細胞的存在，將實施例2的細胞融化并以12,500個肝臟細胞/孔的密度涂布到6孔板的STO-5飼養層上，一式三份。所用的組織培養基為DMEM F12，含有青霉素/鏈霉素(50U/ml/50ug/ml)、牛血清白蛋白(0.2％w/v)、轉鐵蛋白(10ug/ml)、游離脂肪酸(7.6uEq/L)、煙酰胺(4.4mM)、硒(3×10(-8)M)、銅(1×10(-6)M)、2-巰基乙醇(5×10(-5)M)、L-谷氨酰胺(2mM)、胰島素(5ug/ml)、皮質醇(10(-7)M)，添加(+EGF)或不添加(-EGF)表皮生長因子。
細胞培養5天、固定、并通過光學顯微鏡觀察計數。在未分級分離細胞的任何孔中都未觀察到集落。這可能是由于死亡或即將死亡的細胞、或者在Optiprep梯度離心前的某些其它細胞制備物組分的抑制效應。不過，在帶1和帶2的細胞級分中均觀察到集落。在含有來自帶1的細胞的3個孔中觀察到總共8個集落(4個來自+EGF培養基，4個來自-EGF培養基)，而在來自帶2的3個孔中觀察到總共13個聚落(11個來自+EGF培養基，2個來自-EGF培養基)。計算的本實驗的總體集落形成細胞頻率為0.03％。
實施例4白蛋白、CD133和Ep-CAM在成人肝臟細胞亞群中的共表達細胞基本上如實施例2所述從供體肝臟中分離。利用抗-CD45單克隆抗體通過熒光激活細胞分選術(FACS)評估表達CD45細胞表面抗原或者說是白血球共同抗原(在白血細胞(白細胞)中廣泛表達的一種酪氨酸磷酯酶)的細胞的存在。大約17％的細胞是CD45-陽性的(圖14a)。利用抗-CD45單克隆抗體和超常磁MACS MicroBeads以及autoMACS(一種臺式自動化磁性細胞分選儀)通過磁性細胞分選排除CD45-陽性細胞。磁珠標記的抗體和儀器都由Miltenyi Biotec供應。CD45-陽性細胞也可以通過“淘選”、熒光激活細胞分選或其它陰性免疫選擇模式排除。排除后，殘留在肝臟細胞制備物中的CD45-陽性細胞降至大約1％(圖14B)。排除CD45-陽性細胞促進了對肝細胞和肝祖細胞以及干細胞上的抗原的進一步分析。它應當也會促進富集的這些細胞群的分離。
a.白蛋白排除CD45-陽性細胞后，分析肝臟細胞樣品人類血清白蛋白的表達。細胞用聚甲醛固定，通過用去0.2％Triton X-100污劑處理浸透、并通過依次與抗人白蛋白的鼠IgG1單克隆抗體、親和純化的由熒光染料A647標記的抗鼠免疫球蛋白G1(IgG1)的羊抗體溫育而染色。細胞的本底染色和自發熒光通過使用純化的對人類抗原無特異性結合活性的小鼠骨髓瘤蛋白(也是IgG1)代替抗白蛋白單克隆抗體確定。大約97.5％的細胞是白蛋白陽性的(圖15A)。陽染(紅色輪廓)的閾值通過與小鼠骨髓瘤蛋白對照(未顯示)相比較確定。
通過FACS測量正向光散射和側向光散射可用于描述細胞群的特征。正向和側向散射分別主要地是細胞大小和胞外結構復雜性的函數。如圖15B所示，來自成人肝臟的白蛋白陽性細胞群構成了具有相對高的正向(FSC)和側向散射(SSC)的主要的一類細胞。大小和形態學以及附加的生物化學和抗原標志(未顯示)的分析，證明這些細胞具有與成熟的小肝細胞(平均大約18-22微米的直徑)一致的性能。來自正常成人肝臟的最大肝細胞(大約＞30微米的直徑)明顯地不為我們的制備物所體現，這很可能是因為在收獲器官和灌注期間更易于死亡，和/或在分離操作期間更易于損傷。不過，圖15B也證明，除了成熟的小肝細胞，許多以較低的正向和側向散射為特征的細胞也表達白蛋白。制備物中的(大約2.5％)白蛋白陰性細胞幾乎無一例外地表現出極低的正向和側向散射(圖15C)。這些可能是死亡細胞或者及小的細胞，例如紅血細胞前身的晚期。
b.CD133抗原CD133(AC133)是120kD的細胞表面糖蛋白，其具有5個跨膜結構域。該蛋白與小鼠蛋白prominin相似或類似。人類CD133抗原最初是作為早期祖細胞亞群(包括干細胞)在血液形成(造血)細胞譜系中鑒定的。某些其它未成熟細胞表達CD133，包括發育中的人類胚胎上皮(第5周)、內皮細胞前身以及神經元祖細胞或干細胞。CD133的表達也在某些人類腫瘤及腫瘤來源的細胞系中報道，例如成視網膜細胞瘤和結腸癌細胞系CaCo-2。發現該蛋白喜好集中在質膜豐富之處例如微絨毛中。當見于上皮細胞中時，它優選位于頂部，但不是嗜堿側膜表面。以前的研究，尤其是免疫組織化學的研究，未能證明成人上皮組織中的CD133蛋白表達，盡管在許多人類組織，包括成人肝臟中存在可檢測的該蛋白的信使RNA。
我們利用熒光標記的單克隆抗體染色并通過FACS分析來在我們的排除CD45的成人肝臟細胞制備物中尋找表達CD133抗原的細胞。以在前的否定報道的觀點看，令人驚訝地，我們觀察到多數排除CD45的肝臟細胞(見圖14B)表現出CD133陽染。圖16A揭示在來自青少年(2歲)個體肝臟的制備物中有大約58％的CD133-陽性細胞。已在其它個體包括成人的細胞制備物中觀察到大量CD133-陽性細胞群的存在，包括具有小成熟肝細胞大小的細胞。根據側向光散射(圖16A)和正向光散射(未顯示)，CD133-陽性群(圖16A中上面的圖框)包括制備物中大概一半經鑒定為成熟(小)肝細胞的細胞。它也包括比成熟肝細胞更小且形態上截然不同的許多細胞，如通過光散射所判斷的那樣。
磁性細胞分選可用于陽性選擇表達CD133的肝臟細胞。圖16B表明在使用autoMACS設備(Miltenyi Biotec)進行一個循環的磁性分選之后，CD133-陽性細胞被富集至大約回收細胞的75％。使用更高量的抗體偶聯的MACS微珠以及分選條件的調整將允許以幾乎可定量的收率分離到更為高度富集的CD133-陽性細胞群。其它陽性免疫選擇的方法可用于富集CD133-陽性細胞。如通過側向散射(圖16B)和正向散射(未顯示)所判斷的那樣，富集的CD133-陽性細胞包括所有在排除CD45的肝臟細胞制備物中鑒定到的CD133亞群。
c.Ep-CAM上皮細胞粘附分子(Ep-CAM，也被稱之為GA733-2、CO17-1A、EGP40、KS1-4及KSA)是牽涉類似的鈣離子依賴性細胞-細胞粘附的糖蛋白。該蛋白在許多人類上皮組織中表達，并且在增殖的上皮細胞包括腫瘤細胞中似乎是上調的。C.J.de Boer及其同事報道在8周的人類胚胎肝臟中，多數肝細胞表達可檢測的Ep-CAM蛋白[de Boer CJ，van Krieken JH，Janssen-van Rhijn CM，Litvinov SV.(1999).″Expressionof Ep-CAM in normal，regenerating，metaplastic，and neoplasticliver，″joumal of pathology188201-6]。相比之下，他們在正常成人肝臟中未能檢測到肝細胞中的Ep-CAM表達，并且報道僅有膽管上皮細胞的該抗原染色是陽性的。最后，在因膽硬化誘導的肝臟再生和修復的情況下經鑒定為肝前體的細胞中，以及在某些肝臟腫瘤尤其是膽管細胞癌的細胞中檢測到該抗原。
我們通過FACS分析，在未分級分離的來自青少年和成人的人類肝臟細胞制備物中均一致地檢測到一小群Ep-CAM-陽性細胞。所述Ep-CAM-陽性群構成大約0.4到2.5％的細胞。如圖17所示，Ep-CAM-陽性細胞也能夠在排除＞95％的CD45-陽性細胞后的肝臟細胞群中觀察到。圖17B顯示了來自一種這樣的人類肝臟制備物的Ep-CAM-陽性細胞(如紅色輪廓線所示的門控圖中0.57％的區域，相比于圖17A中不對任何人類抗原染色的對照抗體的相同門控區中的0.15％；從而大約0.57-0.15＝0.42％的細胞為Ep-CAM-陽性)。雙標記分析(數據未顯示)證明排除了CD45的群中絕大多數的Ep-CAM-陽性細胞如預期的那樣，是CD45-陰性的。不過，我們的人類肝臟制備物中似乎有些(大概1％)CD45-陽性細胞也表達Ep-CAM(數據未顯示)。
d.Ep-CAM、CD133和白蛋白的共表達我們在成人肝臟中尋找了表達Ep-CAM和CD133兩者的肝臟細胞。細胞與針對CD133和Ep-CAM的分別直接偶聯于不同的熒光染料單克隆抗體溫育。如圖17C所示，該特定的排除CD45的成人肝臟細胞制備物中大約42％的細胞可檢測地被CD133染色。(這里比圖16A所示的實驗中稍微更低程度的CD133染色可能是由于來自不同供體的肝臟細胞制備物作為年齡或其它變量的結果的實際差異，或者由于未認識到的實驗技術的變化)。在群中Ep-CAM強烈染色的細胞(示于圖17B的紅色邊界之內)中，大約70％也被CD133陽染(圖17D)。從而，在該特定的肝臟制備物中，大約0.3％的全部CD45-陰性細胞共表達Ep-CAM和CD133。
用于如圖17所示的實驗的細胞制備物與圖14和15所示的白蛋白表達分析中所用的完全相同。正如上文所指出的那樣，排除CD45的細胞群中大約97.5％的細胞白蛋白染色陽性，并且少數白蛋白陰性細胞表現出截然不同的低正向散射和側向散射模式。如圖17E所示，事實上所有(大約99.5％)發現共表達CD133和Ep-CAM的細胞表現出白蛋白陽性細胞所特有的正向散射和側向光散射；它們完全落在正向散射對側向散射繪圖的包含所有白蛋白陰性細胞的邊界區外側(見圖15C)。因此，出生后共表達Ep-CAM和CD133的人類肝臟細胞也表達人類血清白蛋白。
e.CD133和Ep-CAM表達細胞的共富集如圖16B所示，陽性免疫選擇例如磁性細胞分選允許從人類肝臟細胞制備物中富集CD133-陽性細胞。我們評估了起始群(已排除CD45)和CD133-富集制備物中細胞的Ep-CAM表達。圖17A顯示小于1.1％(故意牢固地門控)的起始群表達Ep-CAM。在富集CD133-陽性細胞后，所得的群(圖5B)含有至少4.5％的Ep-CAM-陽性細胞。這證實了CD133和Ep-CAM在成人肝臟細胞亞群中的共表達，并表明這些細胞可通過陽性免疫選擇富集。共表達這兩種表面抗原的細胞的正向和側向散射分析(如圖17的實驗那樣)再次表明幾乎100％的這些細胞一定也是白蛋白陽性的。
上文所述的成人肝臟細胞共表達白蛋白(肝細胞譜系的一種原型)和CD133或Ep-CAM，因此具有與本文所述的來自人類胎兒肝臟的某些肝干細胞相同的表型特點。而且，本文所述的成人肝臟細胞是比成熟肝細胞(甚至是直徑18-22微米的“小肝細胞”)尺寸小的肝臟細胞。與成人肝臟含有能夠在可操作地限定肝干細胞的條件下(即在具有STO飼養細胞的無血清培養基中)形成集落的細胞的發現綜合起來，白蛋白、Ep-CAM和CD133的共表達證明了此類干細胞在成人肝臟中的存在。本文所述的陽性免疫選擇方法可用于分離同時表達兩種表面標志Ep-CAM和CD133的細胞，以從人類肝臟，包括來源于兒童或成人的組織中獲得高度富集的肝干細胞群。
實施例5STO飼養層上的近肝干細胞原代培養物多數肝祖細胞，除了原肝干細胞以外，與胚胎肝臟基質飼養細胞共培養時不能長期存活；來自新生兒肝臟、成人肝臟或多種成人組織的飼養細胞都不成功(Sigal等，1994；Brill等，1995；Sigal等，1995；(BrillS，Zvibel I和Reid LM.Expansion conditions for early hepatic progenitorcells from embryonal and neonatal rat livers.Digestive Diseases andSciences 44364-371，1999)。胚胎肝臟基質飼養細胞可被STO細胞代替，STO細胞為胚胎基質細胞系，用作為胚胎干細胞的常規飼養細胞，并被發現支持新鮮分離的正常嚙齒類肝干細胞和雙倍體成年大鼠肝臟細胞的克隆擴增(Kubota和Reid，2000)。發現這些條件對來自人類胎兒肝臟的所有祖細胞也是必需的，除了有和無飼養細胞都將擴增的原肝干細胞以外(Moss等，已投稿)。也證明STO飼養細胞對來自新生兒和成人肝臟的肝祖細胞是成功的(Ludlow等，準備中)。該胚胎基質飼養細胞所供應的以及祖細胞所必需的因子尚未知曉。
將最初來自ATCC的STO飼養細胞由75cm燒瓶的貯備細胞在DMEM/F12(Gibco/Brl/Invitrogen Corporation，Carlsbad，California)中擴增，補充有10％胎牛血清FBS(Hyclone，Logan，UT)和1％DMSO(Sigma，St.Louis，Mo.)。在經3次傳代以提供9成融合性燒瓶后，細胞用10μg/mL絲裂霉素C(Sigma，St.Louis，Mo；以及Biomol，PlymouthMeeting，PA)處理2小時，以誘導細胞周期停滯，并用培養基洗滌兩次。細胞用胰蛋白酶消化，并重懸于低溫保藏培養基中(50％DMEM/F12，40％FBS，10％DMSO)，之后以1mL 5×106個細胞的小份冷凍并貯存于-80℃。飼養細胞通過將6×104個融化細胞/cm2種植到由0.1％白明膠(Sigma，St.Louis，Mo.)預涂敷的培養板上制備。在此將[16]中描述的詳細方案并入作為參考。
轉到STO細胞上的細胞在無血清激素成分確定的培養基(HDM)中培養，包括RPMI 1640(GIBCO/BRL/InVitrogen Corporation，Carlsbad，California)，補充有0.2％牛血清白蛋白(級分V，無脂肪酸，Sigma，St.Louis)、胰島素(5μg/ml)、轉鐵蛋白/Fe(10μg/ml)、硒(3×10-8M)、2巰基乙醇(5×10-5M)、游離脂肪酸復合混合物(7.6μEq；[16，17])、皮質醇(10-7M)、谷氨酰胺(2mM)、煙酰胺(4mM)和AAS(青霉素1000μg/mL、鏈霉素100μg/ml以及兩性霉素B 250ng/mL，Sigma)。優選地，既不使用細胞因子類肝生長因子(如表皮生長因子EGF、肝是指西部生長因子HGF)，也不使用胰島素樣生長因子(IGFI和IGFII)。
將實施例1中分散的富集的實質細胞的原代培養物涂板到STO飼養層上，產生表達白蛋白、AFP和CK19的近肝干細胞的穩定聚集體。典型的細胞白蛋白、AFP和CK19染色示于圖6a-6c中。這些細胞也是CK8/18陽性的。與實施例6中描述的培養在塑膠基質上的細胞不同，種植到STO飼養細胞上的近肝干細胞保留一致的形態并維持AFP的表達數周之久。由于這些條件支持近肝干細胞和更為分化的細胞包括二倍體成人肝臟細胞([7])，與STO飼養細胞共培養不能為真正的原始集落形成細胞提供合適的選擇。
實施例6原肝干細胞的選擇將實施例1中富集的實質細胞懸液以2000-5000細胞/cm2的密度涂布到組織培養塑膠上的無血清培養基中，補充有脂肪、胰島素和轉鐵蛋白/Fe(HDM)。對于涂板后的頭12個小時，培養基中含10％FBS以促進細胞貼壁，之后的培養保持無血清。培養基更換以3天的間隔進行。
就在貼壁之后，存在于培養物中的占支配地位的細胞是近肝干細胞和定向祖細胞，為具有經典實質細胞形態的細胞聚集體，且表達白蛋白、AFP和/或CK19；近肝干細胞將展示白蛋白、AFP和CK19(圖2a)。數天后，近肝干細胞和定向祖細胞停止表達AFP，取而代之的是分散在皿中的具有肌成纖維細胞外表的孤立的運動細胞類型。除了近肝干細胞，培養物中存在若干其它細胞類型，有些是孤立的，有些形成廣泛融合的單層，而其它的形成不連續的圓形細胞組。在這些類型的細胞中，白蛋白陽染僅在近肝干細胞、定向祖細胞中、以及在環狀緊密聚集的集落即原肝干細胞(它隨著近肝干細胞和定向祖細胞的逐漸衰亡而共同在培養物中出現)中觀察到。
集落形成表現了可預測的事件順序。最初的集落波在培養的頭幾天內出現，并且似乎是由事先存在的細胞的聚集引起的(圖1b)。不過，在5-7天后，新的集落形成波自散布在整個培養皿中的孤立細胞開始。這些集落首先作為4-8個小的黑色密堆積的細胞辨別，外周是薄層突出形成狹窄的連續邊緣(圖2a)。集落擴增為廣泛成組的緊密聚集的直徑8-10μM的圓形細胞(圖2b-2e)。這些晚期形成的集落的一般外觀與培養頭幾天形成的由更大的細胞組成的集落截然不同，并且不同于最初構成胎兒肝臟主要實質細胞的近肝干細胞的聚集體。
原肝干細胞在組織培養塑膠的HDM中生長良好，并且在培養數周后獲得長達1cm的直徑。選擇性地取出眾多集落，并通過胰蛋白酶消化分散，以產生平均每集落的細胞數目范圍從直徑3mm集落的1000個細胞到直徑1cm的巨大集落的15,000-20,000個細胞。
典型地，集落最外側的細胞轉變為扁平的表型，其變得從集落中分開，并形成孤立的大直徑細胞，分散在整個培養皿中(圖3a)。在其它集落中，周界的細胞假定是伸長的成纖維細胞外表，其最初緊密包繞在集落的周邊，很可能與間充質細胞緊密結合(圖3b)。這些細胞也遠離集落遷移成為單獨的梭狀細胞。這些分散的細胞保留高度增生性，并且通常成為培養物中占支配地位的細胞類型，形成遍布皿延伸的密堆積層。集落被該細胞層包圍，但不被其超過，盡管在各集落邊緣處兩種細胞類型變得散布的地方形成過渡區(圖3c)。
實施例7塑膠培養物中集落形成細胞的抗原特點用與肝器官發生相關的標志的免疫細胞化學染色研究了實施例6中培養的細胞的抗原特征。細胞培養用50/50(V/V)的甲醇和丙酮混合物于室溫下固定2分鐘。用PAP記號筆(Research Products InternationalCorp，Mt.Prospect，Illinois)在各皿的表面建立若干染色區，以允許相同培養物內的多種抗體組合。非特異性結合位點通過與10％山羊血清(GIBCO/BRL/IN Vitrogen，Carlsbad，California)的PBS溶液在室溫下溫育30分鐘而封閉。在用PBS沖洗兩次后，將第一單克隆抗體施加于各染色區(正常為各區域0.1-0.3mL)并溫育過夜。在于4℃溫育過夜后，細胞用PBS洗滌兩次，然后與偶聯于Alexa 488(1∶750)或Alexa594(1∶1250)(Molecular Probes，Eugene OR)的二抗溫育。在某些情況下，可獲得偶聯于FITC或PE的第一單克隆抗體，并且通過在完成標記方案后用該抗體與未偶聯的一抗溫育提供了雙標記的方法。
抗原特性總結于表2之中。集落對于許多以前與肝細胞類型有關的標志是陽性染色的，包括白蛋白(圖4a)、CK19(圖4b)、epCAM(圖4c)、NCAM(CD56，圖4d)，但不是PECAM(CD31；數據未顯示)。在若干集落中看到c-kit染色，一般位于集落邊緣狹窄的部分(圖5a)。并且，集落對于推斷的干細胞標志CD133(AC133，圖5c)是陽性的。有意思的是，集落邊緣過渡區的細胞對于最近描述的內皮標志CD146(M-CAM，圖5c)是陽染的，并且在鄰近集落時，仍保持該蛋白陽性，有可能標識著緊密結合的間充質細胞類型，有可能是內皮祖細胞。作為集落出現的原肝干細胞是AFP陰性的，表明原肝干細胞是近肝干細胞的前身，后者依次是肝細胞祖細胞和膽管祖細胞的前身。
表2.培養細胞的表型
實施例8集落細胞由塑膠基質向STO飼養細胞的傳代在從塑膠基質上選擇性傳代后，利用STO飼養細評估原肝干細胞的命運。培養1-2周后，通過在雙目鏡放大倍數下將實施例6中塑膠基質上的集落抽到100uL移液管中從塑膠基質上物理挑取。將多達50個集落收集在HBSS mod中，然后在膠原酶溶液中消化長達20分鐘，伴有攪拌以將細胞分散到懸液中。
從塑膠傳代到STO飼養層以后的集落形成效率很低，對以500或50個細胞/cm2的密度傳代的細胞，范圍在0.5和1％之間。傳代的集落形成細胞的最初貼壁因涂板培養基中EGF(20ng/mL)的存在而提高。低的集落形成效率可能部分地是由于需要將細胞置于漫長(長達20分鐘)的膠原酶消化以獲得單細胞懸液的緣故。
在傳代到STO飼養細胞上之后，原祖細胞融入到STO細胞層，并在培養4-5天之后作為密堆積的小細胞集落重新出現(圖6a)。新集落在隨后的數周的時間內增大，產生牢固聚集的圓形組，通常在周邊稍稍增厚(圖6c)。在有些集落中，發生二次增殖期，其中細胞的冒出自集落邊緣的某點發生，并鹽STO層擴散，通常圍繞原始的集落(圖6c)。
形成在STO細胞上的集落的免疫細胞化學性能與上文所述的塑膠基質上集落形成細胞的那些特性相同。這包括白蛋白、CK19、CK18和CD133陽染。由于最初集落是在塑膠上培養的，諸如CD146和NCAM的標志在形成在STO細胞的集落的外圍表達最為清晰。當集落被由原代集落增殖的細胞圍繞時，這種邊際表達模式變得甚至更為突出。這這在圖9的NCAM中清晰顯示，其中形成自傳代細胞的原始集落和二次增殖集落之間的界面以具有強陽性NCAM表達的細胞帶為標志。該模式也在見于泛細胞角蛋白標志CAM 5.2的表達，并且NCAM和CAM 5.2雙標記證明這兩種標志以高水平在邊際細胞的相同區域表達(圖9)。
最后，冒出的細胞類型的特征是有意義的，因為它們以截然不同的重排自集落中出現，包括并行排列的細胞，其擴大成具有清楚胞間空間的線性排列細胞的分枝模式(圖8)。當這些細胞擴大成圍繞原始細胞集落的廣泛的薄層時，它們在出現之際在外觀上似乎丟失了線性結構。不過，白蛋白染色揭示組織為成列細胞的模式維持在細胞量內(圖10a)，并且CD146共染色顯示該標記也以高水平在增殖的細胞組中表達(圖10b)。可能這些細胞中最重要的是在出現的細胞周邊AFP染色的出現(圖11)。這代表了本文所述的離體操作的第一點，其中AFP表達可與初始的集落形成細胞的子代聯系起來。這些數據表明實施例6中分離的原肝干細胞可用于生產肝定向祖細胞。
實施例9來自新生兒供體的肝臟中原肝干細胞和近肝干細胞的存在肝臟獲自于在妊娠大約28周后出生且存活僅1天的供體。心臟停止與收集并沖洗供體器官之間的溫和缺血周期在6和7小時之間。之后器官于冰上維持大約12小時。對整個器官(濕重大約100克)進行灌注并用Liberase消化，制備細胞懸液，基本上如同獲自于兒童或成人的肝臟那樣。利用Optiprep通過預備離心除去非存活細胞及許多紅血細胞。不過，難以確定最終制備物中存活的非紅細胞的實際產率和百分比。
部分回收細胞通過差速離心進一步排除紅血細胞，基本上如同胎兒肝臟細胞中所描述的那樣，然后在適于測定原肝干細胞的存在的條件下(即，涂板到組織培養塑膠基質的激素成分確定的無血清培養基中)種植到培養物中。其它的部分細胞無需進一步純化，在測定近肝干細胞的條件下(即，涂板到具有STO飼養細胞的化學成分確定的無血清培養基中)涂板。另外部分的細胞則種植到由I型膠原涂敷的組織培養塑膠的化學成分確定的無血清培養基中，含有或缺乏補充性的5ng/ml表皮生長因子(EGF)。
在合適的溫育期之后，在所有測試條件下觀察到肝集落的生長。在原肝干細胞和近肝干細胞各自的測定中，集落形態和生長速率類似于在相同條件下在由人類胎兒肝臟(通常在妊娠小于22周之后獲得)培養的細胞中觀察到的。通過免疫熒光染色測試了代表性集落的人類白蛋白表達，并且該標志都是陽性的。
具有明顯上皮(假定是肝上皮)形態的集落在EGF的存在下出現在膠原涂敷的板上。另外的具有不太好定義的形態的細胞也在這些培養物中迅速生長，但尚未被詳細表述特征。
假定是上皮細胞的集落也在不存在補充性EGF時出現在膠原涂敷的板上。這些集落中有些利用人工移液管裝置單個挑取，并轉移到96孔板的新鮮培養基中。來自某些集落的細胞在此類培養物中繼續增殖，并且作為細胞株傳代。看起來很可能這些代表可繁殖的肝前身(可能是干細胞)潛在的克隆株。進一步描述包括CD133、Ep-CAM、白蛋白、AFP和CK19在內的抗原的特征，將可確定這些推斷的肝干細胞系的相對分化狀態。
實施例10流式細胞儀分選和流式細胞儀分析(FACscans)胞質抗原(例如，白蛋白、AFP)的FACscans用由3％聚甲醛固定和浸透的細胞在用抗血清染色之前進行。細胞如所顯示的那樣免疫熒光染色，但使用由相關熒光探針直接標記的抗體(見表3和4)。流式細胞術在Cytomation″Moflow″流式細胞儀(Fort Collins，Colorado)(由Dr.Larry Arnold指導的FAC設備)上進行。屏極流體為未修飾的HBSS。MoFlow細胞儀能夠分析或分選40,000個細胞/秒，并行的參數達12個(6種“顏色”與正向散射和/或側向散射的組合)并且精確度大于99％。對于多數分選，使用4W氬激光和60mW功率以及100um噴嘴。在穿過530/30nm的FITC帶通過濾器后收集488nm激發的熒光發射。熒光通過對數放大測量。當熒光大于陰性對照細胞的95％時，則認為細胞是陽性的。中程放大倍數的的E-1檢測器值用于正向散射(FSC)，而中程檢測器以放大倍數1用于側向散射(SSC)。通過線性放大進行SSC門控，將參數分成256個任一的氮源。未染色的細胞、以及由無關抗體和相同的熒光探針、或者用相同抗體但不用熒光探針染色的細胞用作為陰性對照。在每個樣品中，測定30,000-50,000個細胞。具有比陰性對照更大的熒光的陽性細胞，被進一步評價粒度、大小和熒光程度。分選前后的細胞于4℃維持在HDM中，其中添加10％血清。
表3.單克隆抗體
表4.熒光探針
對于胞漿抗原(如白蛋白、AFP)的流式細胞儀分析，在由抗血清染色前，細胞用3％多聚甲醛固定并浸泡。對于使用雙標志的分析，將使用由截然不同的熒光探針并且波長不重疊的第二抗體。分析利用Becton Dickenson FACscan進行。僅被第二抗體染色的細胞用作為陰性對照。在各樣品中，測定30,000-50,000個細胞。比陰性對照具有更大熒光的陽性細胞被進一步評估粒度、大小和熒光程度。
實施例11在獲自于胚胎組織的肝細胞懸液中白蛋白和α-胎蛋白表達的測定在該實驗中，檢查了白蛋白和α-胎蛋白在近肝干細胞和原肝干細胞中的表達。最初確定了沉淀級分中富集肝母細胞(近肝干細胞)，而界面富集集落形成細胞(原肝干細胞)。
在新鮮分離的細胞以及培養10天后的細胞中，白蛋白表達在界面和沉淀細胞中都不相上下。不過，培養物中的表達消失。這可能是歸因于(白蛋白)更低的表達或者白蛋白陰性的非實質細胞的增殖。對培養物的觀察顯示兩者都促成了這種模式(圖20)。
AFP在新鮮分離的沉淀級分中強烈表達，而在界面細胞中微弱表達。這與觀察到的AFP不在集落細胞中表達是一致的。培養10天后，AFP在沉淀或界面細胞中不可檢測。培養物中的集落細胞表達白蛋白而非AFP。這可能是由于導致AFP在所有細胞中的表達抑制的條件(塑膠培養)所致。然而，界面細胞中的低AFP表達提示AFP在這些細胞中從不強烈表達(圖20)。并且，當集落細胞在支持沉淀細胞中延長的AFP表達的條件(STO共培養)下培養時，它們仍然是AFP表達陰性的。與白蛋白或α-胎蛋白結合的抗體之間沒有交叉反應性，而且在空泳道上未觀察到信號。
因此這些實驗的結果證明AFP在新鮮分離的沉淀級分中強烈表達，而在界面細胞中僅微弱表達。這與觀察到的AFP不在集落細胞中表達是一致的。
權利要求
1.一種含有人類原肝干細胞的組合物，其中所述原肝干細胞是近肝干細胞、肝細胞祖細胞或膽管祖細胞的前身。
2.如權利要求1所述的原肝干細胞，其中所述原肝干細胞表達Ep-CAM、AC 133和白蛋白。
3.如權利要求2所述的原肝干細胞，其中所述原肝干細胞還表達細胞角蛋白8/18、細胞角蛋白19或者它們的組合。
4.如權利要求3所述的原肝干細胞，其中所述原肝干細胞還表達N-CAM、CAM5.2、c-kit、CD146或者它們的組合。
5.如權利要求1所述的原肝干細胞，其中所述原肝干細胞是近肝干細胞的前身。
6.如權利要求1所述的原肝干細胞，其中所述原肝干細胞是肝細胞祖細胞的前身。
7.如權利要求1所述的原肝干細胞，其中所述原肝干細胞是膽管祖細胞的前身。
8.如權利要求5所述的原肝干細胞，其中所述的近肝干細胞表達α-胎蛋白、白蛋白和細胞角蛋白19。
9.如權利要求8所述的原肝干細胞，其中所述的近肝干細胞還表達Ep-CAM、AC133、細胞角蛋白8/18或者它們的組合。
10.一種含有人類近肝干細胞的組合物，其中所述的近肝干細胞是肝細胞或膽管祖細胞的前身。
11.如權利要求10所述的近肝干細胞，其中所述的近肝干細胞表達α-胎蛋白、白蛋白和細胞角蛋白19。
12.如權利要求11所述的近肝干細胞，其中所述的近肝干細胞還表達Ep-CAM、AC133、細胞角蛋白8/18或者它們的組合。
13.一種分離來源于人類肝組織的人類肝祖細胞的方法，該方法包括鑒定表達Ep-CAM和AC133的細胞。
14.如權利要求13所述的方法，其中所述的祖細胞還表達白蛋白。
15.如權利要求14所述的方法，其中所述的祖細胞還表達細胞角蛋白19。
16.如權利要求14所述的方法，其中所述的祖細胞是干細胞。
17.如權利要求15所述的方法，其中所述的祖細胞是干細胞。
18.如權利要求13、14或15所述的方法，該方法還包括除去表達CD45的細胞。
19.如權利要求13、14或15所述的方法，其中所述的肝組織獲自于胎兒或新生兒。
20.如權利要求13、14或15所述的方法，其中所述的肝組織獲自于兒童或成人。
21.通過如權利要求19或20所述的方法分離的人類肝祖細胞，其中所述的肝祖細胞是原肝干細胞。
22.通過如權利要求19或20所述的方法分離的人類肝祖細胞，其中所述的肝祖細胞是還表達N-CAM、CAM5.2、c-kit、CD146或其組合的原肝干細胞。
23.通過如權利要求19或20所述的方法分離的人類肝祖細胞，其中肝所述的祖細胞是近肝干細胞。
24.通過如權利要求19或20所述的方法分離的人類肝祖細胞，其中所述的肝祖細胞是還表達α-胎蛋白、白蛋白和細胞角蛋白19的近肝干細胞。
25.一種分離來源于人類肝組織的人類肝祖細胞的方法，包括鑒定表達Ep-CAM的細胞。
26.如權利要求25所述的方法，該方法還包括除去表達CD45的細胞。
27.如權利要求25所述的方法，其中所述的祖細胞還表達白蛋白。
28.如權利要求25所述的方法，其中所述的肝組織獲自于成人。
29.如權利要求25或27所述的方法，其中所述的肝祖細胞是原肝干細胞。
30.如權利要求25或27所述的方法，其中所述的肝祖細胞是近肝干細胞。
31.如權利要求25或27所述的方法，其中所述的祖細胞還表達AC133。
32.通過如權利要求28所述的方法分離的人類肝干細胞，其中所述的肝干細胞是近肝干細胞。
33.通過如權利要求28所述的方法分離的人類肝干細胞，其中所述的肝干細胞是還表達AC133的近肝干細胞。
34.一種分離人類原肝干細胞的方法，該方法包括(a)提供來源于人類肝組織的細胞混合物；和(b)在選擇人類原肝干細胞的條件下，在含有無血清培養基的表面上培養所述細胞混合物，而形成包括人類原肝干細胞的集落，所述無血清培養基包括碳水化合物代謝調解劑、鐵載脂蛋白和膜產生因子。
35.如權利要求34所述的方法，其中所述的肝組織獲自于胎兒、新生兒、嬰兒、兒童或成人。
36.如權利要求34所述的方法，其中所述的細胞混合物來源于富集了實質細胞的人類肝組織。
37.如權利要求34所述的方法，其中所述的表面未被涂敷。
38.如權利要求37所述的方法，其中所述的未涂敷的表面是塑膠表面。
39.如權利要求38所述的方法，其中所述的塑膠表面是帶電荷的。
40.如權利要求39所述的方法，其中所述的帶電荷的塑膠表面是組織培養塑膠。
41.如權利要求34所述的方法，其中所述的碳水化合物代謝調解劑是胰島素。
42.如權利要求34所述的方法，其中所述的鐵載脂蛋白是轉鐵蛋白。
43.如權利要求34所述的方法，其中所述的膜產生因子是含有一種或多種脂類的組合物。
44.如權利要求43所述的方法，其中所述的脂類是游離脂肪酸。
45.如權利要求34所述的方法，其中所述的無血清培養基還包括皮質醇。
46.如權利要求34所述的方法，其中所述的無血清培養基還包括抗氧化劑。
47.如權利要求46所述的方法，其中所述的抗氧化劑是硒。
48.如權利要求34所述的方法，其中所述的原肝干細胞是近肝干細胞、肝細胞祖細胞或膽管祖細胞的前身。
49.通過如權利要求34所述的方法分離的人類原肝干細胞。
50.通過如權利要求34所述的方法分離的人類原肝干細胞，其中所述的原肝干細胞表達Ep-CAM、AC133和白蛋白。
51.通過如權利要求34所述的方法分離的人類原肝干細胞，其中所述的原肝干細胞表達Ep-CAM、AC133、白蛋白、細胞角蛋白8/18和細胞角蛋白19。
52.通過如權利要求34所述的方法分離的人類原肝干細胞，其中所述的原肝干細胞還表達(i)Ep-CAM、AC 133、白蛋白、細胞角蛋白8/18和細胞角蛋白19；以及(ii)N-CAM、CAM5.2、c-kit、CD146或者它們的組合。
53.通過如權利要求34所述的方法分離的人類原肝干細胞，其中所述的原肝干細胞是近肝干細胞的前身。
54.通過如權利要求34所述的方法分離的人類原肝干細胞，其中所述的原肝干細胞是子代肝干細胞的前身，其中所述的子代肝干細胞表達α-胎蛋白、白蛋白和細胞角蛋白19。
55.一種分離人類近肝干細胞的方法，該方法包括(a)提供來源于人類肝組織的細胞混合物；(b)在選擇人類原肝干細胞的條件下，在含有無血清培養基的塑膠表面上培養所述細胞混合物，而形成包括人類原肝干細胞的集落，所述無血清培養基包括碳水化合物代謝調解劑、鐵載脂蛋白和膜產生因子；和(c)在包括至少一種發育因子的培養基中培養來自所述集落的細胞，從而產生包括人類近肝干細胞的細胞。
56.一種分離人類近肝干細胞的方法，該方法包括(a)提供來源于人類肝組織的細胞混合物；(b)在選擇人類原肝干細胞的條件下，在含有無血清培養基中培養所述細胞混合物，而形成包括人類原肝干細胞的集落，所述無血清培養基包括碳水化合物代謝調解劑、鐵載脂蛋白和膜產生因子；和(c)在包括至少一種發育因子的培養基中培養來自所述集落的細胞，從而產生包括人類近肝干細胞的細胞。
57.如權利要求55-56所述的方法，其中所述的發育因子由第二細胞提供。
58.如權利要求57所述的方法，其中所述的第二細胞是飼養細胞。
59.如權利要求58所述的方法，其中所述的飼養細胞是STO飼養細胞。
60.如權利要求58所述的方法，其中所述的飼養細胞是內皮細胞。
61.如權利要求58所述的方法，其中所述的飼養細胞是基質細胞。
62.如權利要求61所述的方法，其中所述的基質細胞是胚胎細胞。
63.如權利要求62所述的方法，其中所述的胚胎細胞是胚肝基質細胞。
64.如權利要求55-56所述的方法，其中所述的近肝干細胞是肝細胞或膽管祖細胞的前身。
65.通過如權利要求55或56所述的方法分離的人類近肝干細胞。
66.通過如權利要求55或56所述的方法分離的人類近肝干細胞，其中所述的近肝干細胞表達α-胎蛋白、白蛋白和細胞角蛋白19。
67.如權利要求1-8任一項所述的組合物，其中所述的人類原肝干細胞含有外源核酸。
68.如權利要求10-11任一項所述的組合物，其中所述的人類近肝干細胞含有外源核酸。
69.一種治療肝機能障礙或疾病的方法，該方法包括向受試者給藥有效量的如權利要求1-8、49-54或67任一項所述的人類原肝干細胞。
70.一種治療肝機能障礙或疾病的方法，該方法包括向受試者給藥有效量的如權利要求10-11、65-66或68任一項所述的人類近肝干細胞。
71.分離的人類原肝干細胞。
72.分離的人類近肝干細胞。
全文摘要
肝祖細胞包括兩個類群的人類肝干細胞，即原肝干細胞和近肝干細胞，以及兩個類群的定向祖細胞，一群是膽管細胞，一群是肝細胞。人類原肝干細胞是肝臟細胞群中非常小的部分，產生近肝干細胞，后者構成大部分的肝。人類原肝干細胞生成膽管細胞及肝細胞定向祖細胞。原干細胞和近干細胞是人類肝中主要的干細胞。人類原肝干細胞可通過免疫選擇從人類肝中分離，或者通過在選擇人類原肝干細胞的條件下培養人類肝臟細胞分離。近肝干細胞可通過免疫選擇或通過在包括發育因子的條件下培養人類肝臟細胞分離。近肝干細胞也可以通過培養在包括發育因子的條件下培養包含原肝干細胞的集落分離。所得的組合物可用于治療肝紊亂和用于生產生物人工器官。
文檔編號C12N5/074GK1742082SQ03809989
公開日2006年3月1日 申請日期2003年3月14日 優先權日2002年3月15日
發明者洛拉·里德, 尼古拉斯·G·莫斯, 馬克·E·福斯, 約翰·W·拉德洛, 安德魯·T·布魯斯 申請人:北卡羅來納大學查伯山分校, 維思塔治療有限公司