專利名稱：制備單克隆抗體的方法
技術領域：
本發明涉及制備單克隆抗體的方法。本發明尤其涉及比常規方法更快速制備和篩選單克隆抗體的高通量方法。
25年前，Kohler和Milstein描述了用B淋巴細胞和骨髓瘤細胞融合制備單克隆抗體的方法(Kohler和Milstein，1975年)。從那以后，單克隆抗體在幫助人類了解生理、生化和遺傳方面起著重要的作用。單克隆抗體是常用的檢測、定位特異性生物分子的靈敏方法。單克隆抗體可以作用于任何細胞分子，從而使該分子能被區別、定位和純化。在一些實例中，單克隆抗體也可以幫助確定與其結合的分子的功能。
七十年代中期雜交瘤技術的發展使人們認識到單克隆抗體在診斷和治療中的作用。單克隆抗體已經成為眾多臨床診斷試劑中的主要組分。此外，許多已被認證的藥物中含有單克隆抗體，并且許多正在研發的藥物也是單克隆抗體。通過最小化其不良反應促進了單克隆抗體在臨床上的使用。然而，盡管單克隆抗體在醫療和分子生物學領域得到廣泛應用，但是自Kohler和Milstein在七十年代提出單克隆抗體學說以來，制備和篩選單克隆抗體的進展卻很緩慢。制備針對某一抗原的單克隆抗體的方法需要用某一抗原對小鼠或者大鼠進行免疫，促使成熟B細胞活化和增值，進而產生抗原特異性抗體，這一免疫過程需要幾周時間。體細胞融合前對小鼠進行免疫并定期測定血清免疫球蛋白滴度。融合后，通過免疫方法篩選雜交瘤上清，以確定針對某一抗原的高特異性單克隆抗體。使用這種方法制備單克隆抗體需要的時間通常在3到9個月。
RIMMS(重復，多位點免疫策略)技術的發展使體細胞融合在免疫起始后8到14天即發生(Kilpatrick等人，1997)。由此獲得的雜交瘤上清可以通過標準的免疫測定方法進行篩選，這使分離針對某一抗原的單克隆抗體變得非常迅速。然而，即使使用RIMMS，制備和篩選大量針對不同抗原的單克隆抗體也需要消耗相當長的時間和資源。隨著越來越多新蛋白的發現，有必要建立更快速更高效的制備、篩選針對這些蛋白的單克隆抗體的方法，以便對其進一步表征。
發明概述因此，本發明提供了一種制備單克隆抗體的方法，該發明包括下述步驟a)將至少一種候選抗原導入動物；b)從所述動物收集抗體產生細胞，并使這些細胞成為單細胞懸液；c)從所述單細胞懸液制備永生化細胞系；d)用其上展示有候選抗原的蛋白質芯片篩選所述永生化細胞系的上清液；和e)選擇與所述候選抗原結合的抗體作為所述單克隆抗體。
本發明的方法相對于目前制備單克隆抗體的方法具有相當大的優勢。如同已討論的，在當前制備單克隆抗體的方法中，每一種抗原的免疫和分離都需要復雜的操作。相比之下，本發明的方法中，動物體內可以導入多種抗原，從而可以同時制備針對多種抗原的單克隆抗體，這使制備單克隆抗體的速度和效率大大提高。本發明中的蛋白質芯片可以結合導入動物體內的抗原，蛋白質芯片的應用加速了單克隆抗體的篩選和檢測過程。此外，蛋白質芯片相對于其他常規篩選方法(例如酶聯免疫吸附試驗)具有更高的靈敏度，使一些常規方法無法檢測的雜交瘤分泌蛋白易于檢測，從而使檢測效率提高。此外，本發明中使用的蛋白質芯片使針對抗原的上清液被篩選多次，并且只需使用常規篩選(例如ELISA)方法所需抗原量的一部分既可。例如，針對某一抗原的每種上清液能被同時一式兩份、三份或四份篩選。
本發明方法中的步驟a)中的動物可以是任何非人類的哺乳動物。優選的動物是小鼠、大鼠、兔、倉鼠或者豚鼠。優選的是小鼠。
步驟a)中的候選抗原優選的是純化的候選抗原。純化的候選抗原或者純化候選抗原的混合物都可以導入動物。純化的候選抗原是指同質的抗原制劑，不含有任何其他組分。純化候選抗原的混合物是指用于免疫的抗原中含有一種以上的純化抗原，但是該抗原混合物中不含有可能引起抗體產生的其他組分。例如，使用常規的操作在動物體內導入均勻的組織，使動物對多種抗原免疫，但是這樣的免疫并不表示是由此處所述純化的候選抗原引起的免疫，因為該抗原已被細胞碎片污染。
任何數量的純化候選抗原可以導入動物。優選的是將1到50種純化抗原導入動物。優選的是一種以上的純化候選抗原導入動物。例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50種或50種以上純化候選抗原可以導入動物體內。抗原可以以混合的方式同時導入動物體內，也可以分別依次導入。不同抗原的導入可以有幾天的間隔。優選的不同抗原的導入時間間隔是短于48小時，優選短于24小時。優選的導入方法涉及將抗原注射入動物。
術語“候選抗原”是指當其導入動物體內時可以引起免疫應答的物質。因此候選抗原包括蛋白物質和非蛋白物質。
蛋白物質包括蛋白質及其衍生物，例如糖蛋白、脂蛋白、核蛋白和多肽。這些蛋白質的片段也包括在上述“抗原”中。優選的這些片段包括抗原決定簇。非蛋白質抗原包括多糖、脂多糖和核酸。尤其，術語“抗原”包括核酸分子，該核酸分子能誘導針對其編碼的蛋白質的免疫應答。這些非蛋白質片段也包括在術語“抗原”中。術語“抗原”進一步包括和載體相連的能引起免疫反應蛋白質或者非蛋白質，例如脂類、半抗原和載體相連后能夠使前兩者具有抗原性。本發明的抗原可以是天然物質，也可以通過本領域的方法合成。
純化抗原用于免疫時，優選抗原是蛋白質或者核酸分子。純化抗原是蛋白質物質時，可以單獨或者以融合蛋白的方式導入。尤其本發明的抗原也可以是表達于重組病毒表面的融合蛋白，該重組病毒可注射入動物。Lindley等人在2000年已描述，使用編碼蛋白質抗原的核酸序列構建重組病毒。
一種以上抗原用于免疫時，可以使用任何純化抗原組合。可以只給動物注射蛋白質抗原或者非蛋白質抗原，也可以是兩者的混合物。根據本發明的一個實施方案，所用的純化抗原都是蛋白質成分。純化抗原可以是來源于相同蛋白或者不同蛋白的片段。純化抗原可以是來源于cDNA文庫的重組病毒體，每種重組病毒體在其表面表達一種cDNA編碼的蛋白質。
根據進一步的實施方案，本發明提供了多種純化抗原以核酸分子形式導入動物體內的方法，該核酸分子編碼可以誘導產生單克隆抗體的蛋白質。核酸分子可以是DNA分子、cDNA分子或者RNA分子。本發明在這一方面優選將cDNA導入動物體內。因此，有可能給動物體內注射某些核苷酸，這些核苷酸編碼身份不確定的蛋白質，如下所述，細胞芯片可以用來分離針對某一蛋白質的抗體，該抗體反過來又可以使蛋白質被純化。
純化抗原是核酸分子時，優選該核酸分子包括或者由DNA、cDNA或者RNA序列組成，這些核酸序列編碼一種可以誘導免疫應答的蛋白質。核酸分子可以是裸露的核酸分子，也可以以載體的形式存在。
載體可以是病毒載體，優選是一種反轉錄病毒、腺病毒、腺病毒相關病毒(AAV)、皰疹病毒、α-病毒或者其他任何合適的載體，這些載體被本領域的技術人員所熟知。核酸分子也可以以非病毒載體的形式存在，優選質粒載體。許多這樣的載體已被公眾所了解并在本領域報導(參考，例如FernandezJ.M.&Hoeffler J.P.基因表達系統。Using nature for the art of expression ed.學術雜志，San Diego，London，Boston，New York，Sydney，Tokyo，Toronto，1998).這些載體可以附加含有調節序列，例如在基因的5’和3’非翻譯區含有增強子、啟動子、核糖體結合位點和終止信號序列，這些序列可以保證編碼序列的正確轉錄和翻譯。
核酸分子也可以以聚陽離子濃縮DNA的形式存在，該DNA結合或者未結合滅活的腺病毒，例如參見Curiel(1992)Hum Gene 20 Ther3147-154，或者以配體結合DNA的形式存在，例如參見Wu(1989)JBiol Chem 26416985-16987。核酸分子可以以DNA覆蓋的膠乳珠形式存在。核酸分子也可以存在于脂質體中，例如WO95/13796，WO94/23697，WO91/14445和EP-524，968.SA 91(24)11581-11585。
抗原可以通過任何合適的方法導入動物體內。優選的導入方法包括注射。純化的抗原可以通過脾內注射、靜脈注射、腹膜內注射、皮內注射、皮下注射或者任何合適的途徑導入動物對其進行免疫。可以通過一種以上的方法在動物體內導入一種或者多種純化的抗原使之免疫。例如，一些抗原可以通過腹膜內注射導入動物體內，而另一些則可以通過皮下注射導入。注射的具體方法取決于被注射的抗原的特性。例如，注射核酸分子時可能需要使用手持的基因轉移槍(如US5149655中所述)來注射核酸分子。蛋白質抗原的劑量范圍優選在0.01到1000微克。
本發明的方法中優選包含附加的步驟，即在獲取抗體產生細胞之前對動物進行加強劑量的一些或所有抗原免疫。在第一次注射后的1到365天給予動物加強劑量的免疫。動物加強免疫的優選次數是1到20次。
優選本發明方法使用的免疫操作規程簡短，給動物導入一種以上抗原以避免某一種抗原在免疫應答中占據主導。優選地，動物接受一種以上抗原免疫，在第一次注射3天后對動物進行每種抗原的加強免疫或者一種以上抗原的合并加強免疫，在第5天再進行一次免疫，在第6天到第15天去除脾組織或者淋巴結。當希望免疫過程較長時，可在第一次注射21天后，對動物進行每種抗原的加強免疫或者多種抗原的同時加強免疫，在第26天去除脾組織和淋巴結。
動物的免疫可以使用或者不使用藥學載體。合適的載體通常是大的、代謝緩慢的大分子，例如蛋白質、多糖、脂類聚集物(例如油滴或者脂質體)和滅活的病毒顆粒。這些載體為本領域的技術人員所熟知。此外，這些載體可以起到免疫刺激劑(佐劑)的作用。除了藥學載體，對動物進行免疫可以使用或者不使用佐劑。
優選的增強組合物有效性的佐劑包括、但不僅限于以下所列佐劑(1)鋁鹽(礬)，例如氫氧化鋁、磷酸鋁和硫酸鋁等；(2)水包油乳劑(含或不含特異性免疫增強劑，例如胞壁酰肽(參見下述)或者細菌細胞壁成分)，例如(a)MF59TM(WO90/14837；Chapter 10in Vaccine designthe subunit and adjuvant approach，eds.Powell & Newman，Plenum Press)含有5％鯊烯、0.5％吐溫80和0.5％司盤85(可選擇性包括MTP-PE)，其在微液化器作用下形成亞微粒，(b)SAF，含有10％鯊烯、0.4％吐溫80、5％普朗尼克封閉的聚合物L121和t hr-MDP，其可以通過微液化成為亞微粒乳劑或者通過旋渦產生體積稍大的乳劑(大小為5)，(c)RibiTM佐劑系統(RAS)，(Ribi Immunochem，Hamilton，MT)含有2％鯊烯、0.2％吐溫80和一種或者多種細菌細胞壁成分，該細胞壁成分選自單磷脂A(MPL)、海藻糖(TDM)和細胞壁骨架(CWS)，優選的是MPL+CWS(DetoxTM)；(3)可以使用皂甙佐劑，例如QS21或者StimulonTM(CambridgeBioscience，Worcester，MA)，或者使用皂甙佐劑產生的顆粒，例如ISCOMs(免疫刺激復合物)，該ISCOMs可以不含另外的去污劑例如WO00/07621；(4)完全弗氏佐劑(CFA)和不完全弗氏佐劑(IFA)；(5)細胞因子，例如白介素(如IL-1，IL-2，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-12(WO99/44636)等)，干擾素(如γ-干擾素)，巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)，腫瘤壞死因子(TNF)等；(6)單磷酰酯A(MPL)或者3-O-脫酰基酶(3dMPL)例如GB-2220221，EP-A-0689454可選地當和肺炎球菌糖類共同使用時基本缺失明礬，例如WO00/56358；(7)3dMPL和QS21和/或者水包油乳劑的組合，例如EP-A-0835318，EP-A-0735898，EP-A-0761231；(8)寡核苷酸，其包括CpG基序(Roman等人Nat.Med，1997，3，20 849-854；Weiner等人，PNAS USA，1997，94，10833-10837；Davis等人，J.Immunol，1998，160，870-876；Chu等人，J.Exp.Med.，1997，186，1623-1631；Lipford等人，Eur.J.Immunol，1997，27，2340-2344；Moldoveanu等人，Vaccine，1988，16，1216-1224，Krieg等人，Nature，1995，374，546-549；Klinman等人，PNAS USA，1996，93，2879-2883；Ballas等人，J.Immunol，1996，157，1840-1845；Cowdery等人，J.Immunol，1996，156，4570-4575；Halpern等人，Cell Immunol，1996，167，72-78；Yamamoto等人，Jpn.J.Cancer Res.，1988，79，866-873；Stacey等人，J.Immunol，1996，157，2116-2122；Messina等人，J.Immunol，1991，147，1759-1764；Yi等人，J.Immunol，1996，157，4918-4925；Yi等人，J.Immunol，1996，157，5394-5402；Yi等人，J.Immunol，1998，160，4755-4761；and Yi等人，J.Immunol，1998，160，5898-5906；國際專利號為WO96/02555，WO98/16247，WO98/18810，WO98/40100，WO98/55495 WO98/37919和WO98/52581等的專利中至少包括一個CG二核苷酸，并且在胞嘧啶處可以選擇性地用5-甲基胞嘧啶取代；(9)聚氧乙烯醚或者聚氧化乙烯酯等WO99/52549；(10)一種聚氧化乙烯去水山梨糖醇酯表面活性劑與辛苯昔醇組合(WO01/21207)；或者一種聚氧化乙烯烷基醚或酯表面活性劑連同至少一種附加的非離子型表面活性劑，例如一種辛苯昔醇(WO01/21152)；(11)一種皂甙和一種免疫刺激寡核苷酸(例如一種CpG寡核苷酸)(WO00/62800)；(12)一種免疫刺激劑和一種金屬鹽顆粒，例如WO00/23105；(13)一種皂甙和一種水包油乳劑，例如WO99/11241；(14)一種皂甙(例如QS2 1)+3dMPL+IL-12(可選擇性加一種甾醇)，例如WO98/57659；(15)其他用作免疫增強劑的物質可以提高組合物的有效性。其他可以使用的佐劑的例子包括Montanide ISA 50，Hunter′s TiterMax和Gerbu佐劑。
優選地，本發明中的抗體制備細胞包括B細胞、T細胞和干細胞。這些用于本發明的抗體制備細胞可以通過去除動物免疫系統的任何合適的細胞組分獲得。優選的抗體制備細胞通過去除脾、淋巴結、骨髓或其部分。根據本發明的步驟b)，通過合適的方法使上述組織成為單細胞懸液。優選地，從動物取得的脾組織、淋巴結或者骨髓通過機械碾磨或者蛋白酶消化的方法獲得單細胞懸液。紅細胞則通過低滲裂解從細胞懸液中去除。
本發明的方法的步驟c)中的永生化細胞系優選是雜交瘤細胞，由單細胞懸液中的細胞和骨髓瘤細胞發生體細胞融合制備得到。單細胞懸液中的細胞和骨髓瘤細胞在融合劑作用下發生融合。所使用的骨髓瘤細胞包括SP2、NS1和NS0。優選的融合劑可以是PEG、病毒或者通過電融合的方法(Zimmermann等人，1990)。
單細胞懸液中的細胞和骨髓瘤細胞融合形成的雜交瘤細胞需要進一步培養。雜交瘤細胞在最初階段優選在一種選擇性培養基中培養，這種選擇性培養基如偶氮絲氨酸次黃嘌呤或者次黃嘌呤氨基蝶呤胸腺嘧啶脫氧核苷，然后轉移入一種非選擇性培養基中。優選雜交瘤細胞在選擇性培養基中培養7天，然后用非選擇性培養基培養3天。這可以保證在篩選之前細胞生長速率增加。雜交瘤制備的步驟優選采用自動化操作，這可以加速操作過程。本發明的實例展示了一種自動化制備雜交瘤的方法。
永生化細胞系也可以由一種永生化病毒感染單細胞懸液制備得到。優選的永生化病毒是Epstein-Bar病毒(參見Epstein Barr病毒操作手冊，Eds.Wilson and May，Humana Press；ISBN0896036901)。
本發明步驟d)包括篩選永生化細胞系的上清液，優選這種細胞系是一種雜交瘤細胞系，該上清液中含有和蛋白質芯片作用的抗體，蛋白質芯片中含有候選抗原，而候選抗原就是用來免疫動物的抗原。如此處所使用的，蛋白質芯片表面展示有候選抗原，這些抗原排列成矩陣形狀。當僅一種純化抗原導入動物體內時，該純化抗原可以錨定在蛋白質芯片上。當超過一種純化抗原導入動物體內時，每個純化的抗原可以分別處在蛋白質芯片的不同位置上，優選處于預先已經確定的位置上。蛋白質芯片的每個位置可以有一個不同的抗原。或者，相同的抗原包被在每一排或者每一列上，使每一列或者每一排上具有不同的抗原。在某些情況，使用一種以上抗原免疫一種動物時，也可能有必要使每一種抗原在不同的芯片上。一片蛋白質芯片可以含有多種抗原，例如含有1到1000種純化抗原，這些抗原包被在預先確定了位置的芯片上。
該領域任何已知的蛋白質芯片都可以應用于本發明中。例如該蛋白質芯片可以是錨定有純化抗原或抗源的玻璃片。當只有一種抗原需要檢測時，該玻璃片可以用氨基酸硅烷(Ansorge，Faulstich)覆蓋，繼而在玻璃片上滴加含有抗原的溶液，然后干燥。覆蓋有氨基酸硅烷的玻璃片可以從Telechem和Pierce獲得用于包被純化抗源。該玻璃片優選覆蓋有(6-aminohexil)氨基硅烷。
其他種類的應用于本發明的蛋白質芯片包括3D凝膠墊(Arkenov等人，2000)和微孔芯片。根據本發明，各種目前技術還沒有成熟、將來研制成功的蛋白質芯片將有充分的理由適用于本發明中，這些為本領域的技術人員所熟知。
術語“蛋白質芯片”也包括表達目的cDNAs的細胞構成的微陣列(Ziauddin等人，2001)，此處即指“細胞芯片”。在該技術中，哺乳動物細胞培養于玻璃片上，玻璃片的不同位置含有不同的cDNAs。在確定位置上生長的細胞攝取和表達cDNAs。當動物體內需要注射cDNA或cDNA文庫、重組病毒體或者cDNA文庫制備的病毒體時，細胞芯片尤其有用。在這些情況，cDNA序列編碼的蛋白質可能還沒有分離得到。給動物注射編碼蛋白的cDNAs序列或者表達cDNAs的重組病毒體，可能產生針對cDNAs表達蛋白的單克隆抗體。如果使用細胞芯片表達同樣的cDNAs，這些抗體將和細胞芯片結合，并可通過如下所述方法檢測這種結合。假如可以獲得編碼蛋白的核酸序列，本發明可以使一種單克隆抗體的檢測和分離變得可行。該單克隆抗體和核酸序列編碼的蛋白結合，可以用作蛋白質本身的純化。
篩選抗體或者篩選產生抗體的永生化細胞系，將永生化細胞系的上清液點樣于蛋白質芯片的確定位置。上清液的點樣優選自動化完成，例如使用一種Genemachines Ominigrid點樣儀。優選上清液點樣于表面覆蓋有甘油的蛋白質芯片，甘油可以起到簡化玻璃片上抗體干燥和固定的操作。例如可以使用0到99.9％濃度的甘油。然后清洗芯片以去除任何未結合的上清液。在這個階段，任何永生化細胞系產生的、隨后分泌到上清液中的單克隆抗體和芯片表面的抗原結合。
通過使用不同的洗脫條件，該方法可以粗略量化單克隆抗體和其配體的親和力。可以使用的洗脫液包括鹽酸胍或者濃度在10umol到8mol之間的尿素或者濃度在0.01％到100％(w/v)的乙二醇水溶液。洗脫也可以使用甘氨酸的水溶液或者非水溶液、濃度從0.01mol到飽和(優選200mM)，溶液的pH值在l到9之間，優選pH為3.2。pH值高的洗脫可以使用三乙胺的水溶液或者非水溶液、濃度在1umol到飽和，優選濃度為100mM，pH值在8到13之間，優選pH值為11.5。
本發明步驟e)包括和抗原結合的單克隆抗體的篩選。優選該步驟中包含有檢測步驟，例如加入一種標記物，該標記物和單克隆抗體結合用于指示單克隆抗體的存在。優選的標記物是酶或者熒光標記，后兩者使單克隆抗體便于檢測。例如，該標記物可以是標記的蛋白質A或者蛋白質G。蛋白質A和G可以用熒光標記如Cy3或者Cy5。蛋白質A或者蛋白質G也可以用酶標記，例如生物素，其存在能通過標記的鏈霉素或者抗生物素蛋白檢測。
優選的標記物是一種和第一抗體結合的抗體。優選該抗體用酶或者熒光標記。優選該抗體用熒光標記，因為這可以使用于DNA芯片檢測的設備適用于蛋白質檢測。
優選檢測結合抗原的單克隆抗體的方法進一步包括對單克隆抗體進行分型。優選檢測和對單克隆抗體進行分型的步驟包括在蛋白質芯片中加入同型特異的抗免疫球蛋白抗體，其中每種含有不同標記的抗免疫球蛋白抗體，以及檢測所述標記的存在。這種方法使單克隆抗體和其免疫球蛋白分型同時得到檢測。
本方法中使用許多不同的型特異性抗免疫球蛋白抗體，這些型特異性免疫球蛋白抗體是由動物免疫產生，都含有不同的標記。例如，一種動物例如小鼠注射了某種抗原，檢測并區分同型單克隆抗體的步驟包括加入用第一標記物標記的抗IgA抗體和/或者用第二標記物標記的抗IgD抗體和/或者用第三標記物標記的抗IgE抗體和/或者用第四標記物標記的抗IgG1抗體和/或者用第五標記物標記的抗IgG2a抗體和/或者用第六標記物標記的抗IgG2b抗體和/或者用第七標記物標記的抗IgG3抗體和/或者用第八標記物標記的抗IgG4抗體和/或者用第九標記物標記的抗IgM抗體。檢測并區分同型單克隆抗體的步驟也包括加入同型特異性抗免疫球蛋白抗體，該抗體和可能的亞型相結合。優選該同型特異性抗免疫球蛋白抗體包括標記有第一標記物的抗IgM抗體和標記有第二標記物的抗IgG抗體。優選標記是熒光標記。標記的檢測表明結合抗原的單克隆抗體的存在，該步驟優選自動化完成。標記是熒光標記時，標記的檢測以及單克隆抗體的存在可以通過使用掃描蛋白質芯片的設備完成。例如，蛋白質芯片的檢測可以由GenePix 4000B掃描儀(Axon Instruments，Inc.)或者Tecan LS200或LS400掃描儀操作。掃描可以在1到4的激光條件下進行操作，并且幾種濾光片聯合使用以檢測多種熒光標記。雖然多種熒光標記的檢測可以依次檢測，但是優選同時進行。
掃描圖片可以獲得并用適當的軟件例如GenePix Pro(AxonInstruments，Inc.)、Chipskipper(Schwager，Ansorge)或者TecanLS200、LS400進行分析。
為了保證單克隆抗體檢測的可靠性，篩選方法優選使用各種控制條件。例如，對于表面僅覆蓋有一種抗原的蛋白質芯片，不僅本發明制備的永生化細胞系上清液需要點樣于蛋白質芯片表面，而且陽性和陰性對照也需要點樣于芯片表面。
陽性對照可以用以前測定過的單克隆抗體，也可以使用通過商業途徑購買的多克隆抗體。或者，陽性對照可以由稀釋或未稀釋的、預先從免疫動物獲取的血清組成，該血清在加強劑量的抗原注射后獲得，也可以在處死動物收集B細胞時獲取。
陰性對照可以選用模擬上清液，并點樣于確定的位置。每種上清液篩選幾種抗原時需要選用其他的對照。獲得的信號僅針對一種抗原被認為是有力的含有單克隆抗體的上清液。
蛋白質芯片表面的陽性信號可以追蹤確定特異的永生化細胞系，按照本發明的步驟e)使該單克隆抗體能被分離。隨后可以對該分離得到的抗體進行進一步的特性確定。
對抗體進一步表征的方法包括進一步確證抗體的特異性。例如，本發明分離得到的一種單克隆抗體可以用來檢測另一種蛋白質芯片，該蛋白質芯片包被有眾多不同的蛋白質，從而確定單克隆抗體是否特異性地結合另一種抗原。上述用于蛋白質鑒定的掃描方法可以用來檢測其特異性。本發明制備的單克隆抗體的特異性和親和力可以通過改變蛋白質芯片表面的濃度或洗脫條件進行進一步確定。
進一步根據本發明第一方面的實施方案，提供了建立一種產生目的單克隆抗體的永生化細胞系的方法，該方法包括以下步驟a)將至少一種候選抗原導入動物；b)從所述動物獲取抗體制備細胞并使這些細胞成為單細胞懸液；c)從所述單細胞懸液制備永生化細胞系；d)用蛋白質芯片篩選所述永生化細胞系的上清液，所述蛋白質芯片表面展示有候選抗源。
e)篩選其上清液中含有與所述候選抗原結合抗體者作為永生化細胞系。
由該方法建立的永生化細胞系在特異性抗體制備方面有著廣泛的應用。
根據本發明第一方面的一個特殊實施方案，提供了一種制備多種單克隆抗體的高通量方法，每種制備得到的單抗和一種不同的候選抗原結合，該方法包括如下步驟a)將多種候選抗原導入動物；b)從該動物收集抗體制備細胞并使這些細胞成為單細胞懸液；c)從該單細胞懸液中建立永生化細胞系；d)用一種或多種蛋白質芯片篩選該永生化細胞系的上清液，這些蛋白質芯片的表面展示有候選抗原；e)選擇與所述候選抗原結合的抗體作為所述單克隆抗體。
如上所述，候選抗原優選是純化的候選抗原。動物體內導入候選抗原、收集抗體制備細胞、建立永生化細胞系和永生化細胞系上清液的篩選方法同樣如上所述。
以前本領域制備單克隆抗體的方法需要復雜的操作并且耗時很長。相比之下，該方法使同時制備和篩選多種抗體變得可行。使用蛋白質芯片進行抗體大量篩選的方法相對于常規方法具有非常高的效率和準確性，并且只需較少的候選抗原。
如上所述，優選地，該實例的步驟e)進一步包括單克隆抗體進行分型的方法。這使本發明相對于本領域以前的發明具有另一優點，因為后者不能對單克隆抗體同時進行檢測，也不能區分同型單克隆抗體。
根據本發明的第二方面，提供了一種通過本發明的方法制備的單克隆抗體。本發明也可以用于制備抗體庫，其特異性覆蓋整個生物體的蛋白質組。該抗體文庫構成本發明的另一方面。
根據本發明的第三方面，建立了一種永生化細胞系，優選雜交瘤細胞系，該雜交瘤細胞系根據本發明的第二方面可以制備單克隆抗體。本發明的該方面也包括建立永生化細胞系庫，優選雜交瘤細胞系文庫。本發明也可以用于構建雜交瘤細胞系文庫，例如，可以產生整個生物體蛋白質組的細胞系文庫。
根據本發明的第四方面，提供了制備大量單克隆抗體的方法，每種抗體結合一種不同的純化候選抗原。該方法包括在一種動物體內導入多種候選抗原。
優選每種候選抗原具有不同來源。根據該方法，每種抗原來源于不同的蛋白質、核酸等物質。本發明的這一方面不包括給動物注射同一蛋白質的不同片段進行抗體制備的方法。例如，如果抗原不是來源于同一蛋白的全片段，那么純化候選抗原可以都是蛋白質物質。
該方法相對于本領域以前的方法具有另一優點，即該方法使同時制備一種以上單克隆抗體變得可行，這些單克隆抗體分別結合不同的純化候選抗原。
可以使用任何技術給動物注射純化候選抗原。例如，本發明該方面的方法進一步包括收集抗體制備細胞如B細胞、T細胞和干細胞的步驟，這些細胞來源于免疫動物。獲取細胞的方法如去除動物脾、淋巴結或者骨髓，并使這些組織器官成為單細胞懸液。該方法進一步包括通過單細胞懸液和骨髓瘤細胞融合構建永生化細胞系，優選是雜交瘤細胞系。優選地，本發明該方面的方法包括這些步驟，也包括篩選永生化細胞系上清液的步驟，優選雜交瘤細胞系，這些上清液中的抗體和一種或多種蛋白質芯片表面的候選抗原結合；篩選和抗原結合的單克隆抗體，優選分離這些抗體和/或者產生這些抗體的永生化細胞系。建立永生化細胞系的正確操作以及隨后的上清液篩選和本發明第一方面描述的方法相類似。如上所述，尤其是檢測單克隆抗體的步驟包括同時檢測單克隆抗體和對其進行分型。
通過本發明這一方面的方法提供了一種制備單克隆抗體的方法。本發明的這一方面可以用來制備抗體庫，其包含，例如，和所有生物體蛋白質組有特異親和力的抗體。該抗體庫代表本發明的進一步成果。
本發明也構建了永生化細胞系，優選雜交瘤細胞系，所述細胞系如上所述能夠產生單克隆抗體。本發明也可以用來構建永生化細胞系文庫，例如優選構建雜交瘤細胞系庫，該細胞系庫能夠產生包含所有生物體的蛋白質組的抗體。
根據本發明的第五方面，可以產生抗獨特型抗體，該抗獨特型抗體根據本發明的第二方面可以結合單克隆抗體。因為抗獨特型抗體含有可變區域，該可變區域模擬原抗體所針對分子的結構。因此抗獨特型抗體具有取代原抗體所針對分子進行治療的作用。可以通過本發明第一或者第四方面的方法，使用依據本發明第二方面制備的單克隆抗體制備抗獨特性抗體作為純化的候選抗原。
因此，本發明的該方面提供了一種制備抗獨特型抗體的方法，所述抗獨特型抗體與根據本發明第二方面的單克隆抗體結合。該方法包括根據本發明的第二方面使用單克隆抗體作為純化的候選抗原，該純化的候選抗原用于本發明的第一方面或者第四方面中。本發明也包括通過該方法制備的抗獨特型抗體。
根據本發明的第六方面可以制備抗抗獨特型抗體，該抗體結合根據本發明第五方面制備的抗獨特型抗體。該抗抗獨特型抗體可以通過本發明第一或者第四方面的方法使用如上所述的抗獨特型抗體作為純化的候選抗原。因此本發明該方面提供了一種制備抗抗獨特型抗體的方法，該抗體結合根據本發明第五方面制備的抗獨特型抗體，該方法包括使用一種如上所述的抗獨特型抗體作為純化的候選抗原，該候選抗原用于本發明第一或第四方面的方法中。本發明的各個方面和實施方案將通過實施例更詳細進行描述。應當理解在不偏離本發明內容的前提下對細節可進行修改。
附圖簡述附

圖1掃描芯片的全圖，圖中綠色和紅色的點分別表示產生陽性IgG和IgM的上清液。芯片中特殊區域進行了放大以顯示細節，這些特殊的區域可以觀察到某些有效點。
附圖2比較芯片分析和ELISA篩選。第一張圖中是陰性樣品(Ia＜0.5)，而其他的則是陽性樣品。平均Ic表示3片芯片上的點的平均總強度。Ia相對于三片芯片總強度，平均每個點的比例(％)。
附圖3比較了ELISA(■)或者芯片分析方法(□)篩選結合B5抗原的培養上清液所測得的相對于總強度的比例(附圖3A)。本底值在圖3B中顯示。顯示了許多通過芯片分析和/或者ELISA方法測得的陽性上清液。
附圖4比較了ELISA(■)或者芯片分析的方法(□)篩選結合B5抗原的培養上清液所測得的相對于總強度的比例(附圖4A)。本底值在圖4B中顯示。顯示了一種通過芯片分析和ELISA方法測得的陽性上清液。
附圖5比較了ELISA(■)或者芯片分析的方法(□)篩選結合Ket94/95抗原的培養上清液所測得的相對于總強度的比例(附圖5A)。本底值在圖5B中顯示。顯示了許多通過芯片分析和/或者ELISA方法測得的陽性上清液。
附圖6比較了ELISA(■)或者芯片分析的方法(□)篩選結合Ket94/95抗原的培養上清液所測得的相對于總強度的比例(附圖6A)。本底值在圖6B中顯示。通過ELISA或者芯片分析方法沒有測得陽性上清液。
實施例實施例1用10種蛋白抗原進行免疫免疫給出生8周的雌性Balb/c小鼠脾內注射10種蛋白質抗原，各10μg，這些抗原用100μl磷酸緩沖鹽(PBS)溶解。在隨后的第三天，在小鼠脾內再次注射各1μg的這10種蛋白質抗原，抗原仍然用100μ1PBS溶解。在第五天，給這些小鼠靜脈注射各0.1μg的這10種蛋白質抗原。在第八天，通過頸脫臼的方法處死小鼠并分離脾臟，把脾臟保存于DMEM培養基中(DMEMLife Technologies Inc.)融合所有的步驟在無菌的層流通風櫥中完成。通過兩塊磨沙顯微載波片的機械碾磨使脾臟成為單細胞懸液。用一種70μm的尼龍細胞濾器(BD Falcon)收集上清液到容積為50ml、條形碼編碼的圓錐形底試管中(BD Falcon)，轉移給自動化操作系統。
SP2骨髓瘤融合伴侶(ATCC)在融合前用HM20(DMEM，20％精制胎牛血清(Hyclone)、10mM的L-谷氨酰胺、50μm慶大霉素)培養5天。在融合當天轉移到HM20/HCF/2xOPI(含10％雜交瘤克隆因子(Origen)和2％OPI克隆補充劑(Sigma)的HM20)中，在37℃、5％CO2的條件培養至少1小時。
通過條形碼識別設備讀取條形碼，Genesis FreedomSystem(Tecan)的RoMa臂把50ml的Falcon試管裝入轉筒。轉筒通過工作臺裝入離心機。
試管在室溫條件(RT)、100g速度下離心10分鐘，然后從離心機中取出轉筒，再從轉筒中取出試管，通過條形碼加以區分。細胞在室溫條件用5ml紅細胞裂解液(Sigma)作用9分鐘。HM20加至50ml，然后再一次在室溫的條件離心10分鐘，自然停止。棄上清重懸細胞于預熱至37℃的DMEM中。每次離心和重懸步驟至少洗滌細胞兩次。50μl的細胞懸液用自動化設備吸至1.5ml的微量離心管中。通過血球計進行細胞計數。
同時，用相似的方式洗滌SP2細胞3次，取50μl細胞懸液移至1.5ml微型離心管中并通過血球計數器對細胞進行計數。SP2骨髓瘤細胞和脾細胞以1∶5的比例混合，在100g條件下離心10分鐘，自然停止。
完全棄去上清，將溶于50％HEPES的PEG1500預熱至37℃并通過自動化裝置加入，加入過程中試管置于Te-shake振動器(Tecan AG)上以450rpm的轉速振搖并且滴加的時間應超過1分鐘以保證充分的混合。細胞/PEG混合物在37℃溫孵1分鐘，溫孵過程輕輕攪拌。37℃條件下，邊攪拌邊加入1ml的DMEM，1分鐘以上加完。混合物在37℃條件溫孵1分鐘，溫孵過程輕輕攪拌。通過自動化裝置在37℃條件再次加入1ml DMEM，加入時間在1分鐘以上，邊加邊攪拌。然后在相似條件再孵育1分鐘。37℃條件下通過自動化裝置加入7ml HM20，加入的時間在3分鐘以上，邊加邊攪拌。然后試管在90g條件下旋轉5分鐘，通過制動的方式停止離心。吸棄上清液，重懸細胞于20ml的HM20/HCF/OPI/AH(HM20/HCF/OPI加10％偶氮絲氨酸次黃嘌呤(Sigma))中。
圓錐形試管再次置于自動化工作臺，通過自動化設備的液體移液臂的8個吸頭吸取融合后的細胞混懸液，然后將200μl的細胞混懸液加到96孔深孔板的每個孔中(Greiner Masterblock)。
通過自動化裝置將該深孔板轉移到位于Genesis工作臺上的TeMo96孔自動移液器處，把該96孔板的液體吸出置于無菌96孔組織培養板中。
融合后混合物通過自動設備加至20個96孔無菌板中(Nunc)，每孔100μl，該96孔無菌板固定于整合于機器人的自動化傳送盤。將該96孔無菌板置于集成的37℃孵箱中，該孵箱通過氣壓表的CO2含量是10％。培養板儲存于孵箱中含有的傳送盤。
細胞培養在融合后的第三天，將細胞從孵箱自動化轉移到工作臺，并通過自動化裝置再加入100μl HM20/HCF/OPI/AH。然后將培養板自動化放回孵箱。
在第七天，培養板再次從孵箱轉移到工作臺，棄去每孔200μl的上清液，重新加入150μl新鮮HM20/HCF。
在第11天，培養板自動化轉移到工作臺，收集每孔30μl的上清液并轉移到384孔培養板中，該384孔培養板通過傳送帶(Tecan Inc)位于工作臺上。
微陣列篩選滴加40μl含有1到5μg抗原的雙蒸水至氨基硅烷覆蓋的玻璃片上，并在其表面覆蓋一張22×60毫米的蓋玻片，在室溫條件濕潤環境下保存60分鐘，使蓋玻璃片表面均一包被純化抗原。
包被的玻璃片用PBS簡單清洗并用含5％牛奶的PBS和0.1％吐溫阻斷60分鐘，然后用PBS清洗10分鐘。在2000rpm速度下離心10秒干燥芯片。培養上清液通過Beckman Biomek FX自動化裝置統一置于384孔培養板中。培養上清液通過一種GeneMachines OmniGrid微陣列加樣器加載到三張同樣的抗原包被的玻璃片上，每張玻璃片上含9600個點，每個點的大小在120μm左右。
微陣列芯片在37℃條件、濕潤環境下孵育60分鐘，然后用含0.1％吐溫的PBS(PBST)清洗5分鐘，共5次。
40μl Cy3偶聯的羊抗小鼠IgG特異性抗體和Cy5偶聯的羊抗小鼠IgM特異性抗體按照1∶1000的比例用PBST稀釋并混合，然后均一地置于芯片上，用22×60mm的蓋玻片覆蓋，室溫條件在潮濕環境孵育30分鐘。然后芯片依次用PBST、PBS和雙蒸水洗兩次，每次10分鐘。該芯片在2000rpm條件下離心10秒干燥。
Hit-Picking在每象素10μm分辨率下，用GenePix4000B掃描儀(AxonInstruments)掃描芯片。Cy3和Cy5通道的PMT電壓分別是540v和610v。兩種激光射線都設定為100％強度。每種掃描的芯片賦予合適的柵格，并且所有的點用GenePixPro 3.0(Axon Instruments)分析。
所有的芯片用GenePixPro 3.0軟件分析，確定芯片上每個點在Cy3和Cy5通道的相對于校正強度(Ic)的信息。從這些數據我們得到了每個點相對于每個通道總校正強度的比例((Ic/Σ19600Ic)×100).]]>將每個點的每個通道的三個值平均求值，該平均校正強度用作數據集最后的分析。我們把大于0.5％的值當作“可能是陽性”的樣品，把超過1.5％的值作為“確定的陽性”樣品。
篩選后處理重懸陽性孔中得到的細胞并將20μl轉移到一塊96孔深孔板中，該96孔板預先加入了1.5ml的HM20/HCF，然后置于孵箱，在37℃、5％CO2條件下孵育48小時。
1.4ml的培養液轉移入另一深孔板中，然后將剩余的100μl培養液用來重懸細胞，將這些細胞轉移入凍存管，每管含90％胎牛血清/10％DMSO(Sigma)，再將凍存管置于-80℃保存2小時，最后放進液氮罐保存。然后將培養上清液用于所產生單克隆抗體的評價和進一步表征。
結果微陣列篩選的結果見圖1。該圖表示許多陽性單克隆抗體結合玻璃片上的候選抗原后被檢測到。綠色的點表示IgG單克隆抗體，該抗體結合候選抗原；而紅色的點表示IgM單克隆抗體，該抗體結合候選抗原。圖1表示本發明的方法能用來鑒定結合候選抗原的單克隆抗體，同時也能確定這些單克隆抗體的型別。
ELISA方法和蛋白質芯片方法進行比較時發現，如圖2所示(參見微陣列結果和ELISA結果比較)許多結合候選抗原的單克隆抗體可以通過蛋白質芯片方法測得，但是用ELISA方法卻無法鑒定。一種通過微陣列方法篩選是陰性(Ia0.234)的上清液用ELISA方法測定仍然是陰性。然而，有四種用微陣列篩選是陽性結果(Ia5.18，1.96，3.64，2.02)的上清液用ELISA(參見圖2)方法測定只有兩種是陽性結果。有必要指出在ELISA試驗中是陰性結果的上清液怎么會通過更精確更靈敏的微陣列方法測得陽性結果。
實施例2用9種抗原進行免疫免疫給小鼠體內注射9種劑量為25μg的抗原，其中包括25μg抗原B5和Ket94/95的融合體，每種抗原和10μg的CpG DNA混合并吸附于明礬佐劑(Pierce)。每種抗原的一半通過脾內注射導入，另外一半則通過皮下注射導入。
21天后給予小鼠10μg每種抗原、10μg的CpG DNA和明礬佐劑的混合物進行加強，每種抗原的一半通過脾內注射導入，另一半則通過皮下導入。
加強劑量的抗原注射后去除脾臟。
融合和細胞培養融合和細胞培養如實施例1所述。
針對抗原B5和Ket94/95的抗體的微陣列篩選滴加40μl含有5μg純化B5抗原的雙蒸水至氨基硅烷覆蓋的玻璃片上，并在其表面覆蓋一張22×60毫米的蓋玻片，在室溫條件濕潤環境下保存60分鐘，使蓋玻璃片表面均一包被有純化抗原。用同樣的方法制備一張表面包被有純化Ket94/95抗原的氨基硅烷玻璃片。
除了用含3％BSA的PBS代替含5％牛奶的PBS阻斷玻璃片以外，清洗、阻斷和干燥玻璃片的方法如實例1所述。
如實施例1所述培養的上清液統一置于384孔板中，然后用Microgrid610微陣列點樣儀點樣到包被有B5和Ket94/95的玻璃片上，每孔設3個重孔，每張芯片含大約16000個孔，每孔的大小在150um左右(ApogentDiscoveries)。
孵育微陣列芯片，并加入Cy3偶聯的羊抗小鼠IgG和Cy5偶聯的羊抗小鼠IgM特異性抗體，如實施例1所述。
Hit-Picking如實例1所述的方法掃描芯片，求得三個培養上清液(一式三份)的平均校正強度。
微陣列篩選和ELISA方法比較用ELISA方法檢測每種培養上清液進行比較實驗。每孔內含200ngB5或者Ket94/95抗原，加入每種培養上清液于孔中，培養上清液中和抗原結合的單克隆抗體通過常規ELISA試驗測定。
用ELISA需要一周的時間篩選5376種培養上清液，這5376種培養上清液產生5376種結果，每個樣品對應一個結果。相比之下，使用微陣列芯片可以在48小時以內篩選5376種培養上清液，并且每種上清液可以設3個孔，因此可以產生16128種結果，這表明微陣列篩選相對于ELISA方法更有效。
此外，微陣列篩選只需5μg的B5和Ket94/95抗原，每片芯片也只需5μg抗原。相比之下，每塊ELISA板需要96微克抗原，并且篩選每種抗原需要5塊ELISA板。因此通過ELISA方法的篩選比微陣列篩選費用更高且耗時更長。
每塊ELISA板的數據給出的是每種培養上清液相對于總強度的百分比。微陣列篩選得到上清液復孔的均值強度也可以和ELISA數據相比較。
當用ELISA方法篩選培養上清液中結合B5的抗體時，在超過5塊ELISA板中發現了53種陽性上清液。使用微陣列篩選方法篩選同樣的培養上清液時發現了48種陽性上清液，是用ELISA方法篩選的90.57％。微陣列篩選也鑒定了四種未能被ELISA所鑒定的新的陽性上清液。
當用ELISA方法篩選培養上清液中結合Ket94/95的單克隆抗體時，在一塊ELISA板上鑒定了15種陽性上清液。用微陣列篩選對同樣的上清液進行篩選發現了13種陽性上清液，為ELISA鑒定結果的88.66％。微陣列篩選也確定了8種新的未能被ELISA方法鑒定的陽性上清液。
從這些結果可以看出，微陣列篩選在鑒定結合特異抗原的單克隆抗體方面至少和ELISA同樣有效。事實上，微陣列篩選能鑒定不能通過ELISA方法測定的上清液表明其靈敏性高于ELISA。此外微陣列篩選還具有一個明顯的優點，即該篩選方法同時還可以確定鑒定的單克隆抗體是IgG型還是IgM型。
圖3A比較了用ELISA方法(■)測定含結合B5抗原的陽性樣品的上清液相對于總強度的百分比值和用B5包被的玻璃片(□)對相同培養上清液進行微陣列篩選所得到校正的百分比值。圖3B表示這些試驗中的本底水平。由圖中可見，和ELISA方法相比，用微陣列篩選法測得的陽性上清液具有更高的相對于總強度的比值。因此，微陣列篩選和ELISA方法測得的本底和陽性上清液有顯著性差異，這可以更容易更精確地測定陽性上清液。
圖4A比較了用ELISA方法(■)測定含結合B5抗原的陽性樣品的上清液相對于總強度的百分比值和用B5包被的玻璃片(□)對相同培養上清液進行微陣列篩選所得到校正的百分比值。圖4B表示這些試驗的本底水平，由圖中可知，在本底背景下微陣列篩選方法比ELISA方法更易于測定陽性樣品。
圖5A比較了用ELISA方法(■)測定含結合Ket94/95抗原的陽性樣品的上清液相對于總強度的百分比值和用Ket94/95包被的玻璃片(□)對相同培養上清液進行微陣列篩選所得到的校正的百分比值。如圖5B所示，在本底背景下使用微陣列篩選方法比ELISA方法更易于測定陽性樣品。
圖6A比較了用ELISA(■)和微陣列篩選方法(□)測定的不含陽性上清液的數據。如圖6B所示，兩種方法的數據歸因于本底值。
這些結果表示本發明的方法能同時鑒定針對一種以上抗原的單克隆抗體。本發明中的微陣列篩選比常規的抗體篩選方法(比如ELISA)更快速、廉價并且更精確。
參考文獻Kilpatrick et al(1997)Hybridoma 16381-389Kohler G，Milstein C(1975)Nature 7256485-7Lindley et al(2000)J Immunol Methods 234123-135Ziaudin J，SabatiniD(2001)Nature 411107-110Zimmermann U.(1990)J Immunol Methods Nov 6；134(1)43-50
權利要求
1.一種制備單克隆抗體的方法，該方法包括下述步驟a)將至少一種候選抗原導入動物；b)從所述動物收集抗體產生細胞，并使這些細胞成為單細胞懸液；c)從所述單細胞懸液制備永生化細胞系；d)用其上展示有候選抗原的蛋白質芯片篩選所述永生化細胞系的上清液；和e)選擇與所述候選抗原結合的抗體作為所述單克隆抗體。
2.權利要求1的方法，其中所述動物是小鼠、大鼠、豚鼠或兔。
3.權利要求1或2的方法，其中所述候選抗原是純化的候選抗原。
4.權利要求3的方法，其中將1到50種不同的純化的候選抗原導入動物。
5.權利要求4的方法，其中將0.001到1000微克的各種抗原導入動物。
6.權利要求1到5中任一項的方法，其包括給予動物加強劑量的一些或全部抗原的附加步驟，所述抗原在抗體產生細胞去除之前導入動物。
7.權利要求1到6中任一項的方法，其中抗體產生細胞是B細胞、T細胞或者干細胞。
8.權利要求1到7中任一項的方法，其中抗體產生細胞通過動物的脾組織、淋巴結或者骨髓的去除而收集。
9.權利要求1到8中任一項的方法，其中永生化細胞系是雜交瘤細胞系，所述雜交瘤細胞系通過單細胞懸液中的細胞和骨髓瘤細胞發生體細胞融合而制備。
10.權利要求1到9中任一項的方法，其中所述蛋白質芯片是平整的玻璃片、3D凝膠墊芯片、微孔芯片或者細胞芯片。
11.權利要求1到10中任一項的方法，其中檢測與抗原結合的單克隆抗體的步驟進一步包括對單克隆抗體進行分型。
12.權利要求11的方法，其中所述檢測和對單克隆抗體進行分型的步驟包括在所述蛋白質芯片中加入同型特異性抗免疫球蛋白抗體，其中每一具有不同同型特異性的抗免疫球蛋白抗體有不同的標記，和檢測所述標記的存在。
13.權利要求1到12中任一項的方法，其進一步包括用包含所述抗原的蛋白質芯片評估每種分離的單克隆抗體與抗原結合的特異性。
14.一種制備多種單克隆抗體的高通量方法，其中每種結合不同的候選抗原，包括以下步驟a)將多種候選抗原導入動物；b)從所述動物收集抗體產生細胞并使這些細胞形成單細胞懸液；c)從所述單細胞懸液制備永生化細胞系；d)用其上展示有候選抗原的一種或多種蛋白質芯片篩選所述永生化細胞系的上清液；和e)選擇與所述候選抗原結合的抗體作為所述單克隆抗體。
15.根據權利要求14的方法，其進一步包括權利要求1到13中任一項所述的任一步驟。
16.制備產生目的單克隆抗體的永生化細胞系的方法，所述方法包括下述步驟a)將至少一種候選抗原導入動物；b)從所述動物收集抗體產生細胞并使這些細胞形成單細胞懸液；c)從所述單細胞懸液制備永生化細胞系；d)用其上展示有候選抗原的蛋白質芯片篩選所述永生化細胞系的上清液；和e)選擇所產生的上清液含有與所述候選抗原結合抗體者作為所述永生化細胞系。
17.根據權利要求16的方法分離的永生化細胞系。
18.制備多種單克隆抗體的方法，每種抗體結合不同的純化的候選抗原，其包括將多種純化的候選抗原導入動物，每種純化的候選抗原具有不同來源。
19.根據權利要求18的方法，其進一步包括權利要求1到13中任一項所述的任一步驟。
20.根據權利要求1到16或18到19中任一項所述方法分離的單克隆抗體。
21.根據權利要求20的抗體，其是抗獨特型抗體。
22.根據權利要求21的抗體，其是抗-抗獨特型抗體。
23.產生權利要求20、21或22中所述單克隆抗體的永生化細胞系。
24.根據權利要求23的永生化細胞系，其是雜交瘤細胞系。
25.根據權利要求20、21或者22所述抗體的庫。
26.根據權利要求15、21或者22所述永生化細胞系的庫。
全文摘要
本發明涉及制備單克隆抗體的方法。本發明尤其涉及比常規方法更快速制備和篩選單克隆抗體的高通量方法。
文檔編號C12N15/06GK1659185SQ03813353
公開日2005年8月24日 申請日期2003年4月17日 優先權日2002年4月17日
發明者A·M·薩耶, F·德馬斯 申請人:歐洲分子生物學實驗室