專利名稱：用于提高植物含油量的方法
技術領域：
本發明涉及通過表達優選來自釀酒酵母(saccharomyces cerevisiae)的酵母甘油-3-磷酸脫氫酶(G3PDH)來提高植物(優選植物種子)的含油量的方法。本發明還涉及用于在植物優選植物種子中表達酵母G3PDH的表達構建體、表達酵母G3PDH的轉基因植物、以及所述轉基因植物用于生產食品、飼料、種子、藥物或精細化學藥品，特別是用于生產油的用途。
背景技術：
在傳統和現代植物育種，特別是植物生物技術中極其感興趣的是提高植物特別是植物種子的含油量。由于營養或工業應用增加了植物油的消耗，因此增加或修飾植物油的可能性日益成為當前研究的主題(例如Tpfer等人，1995，Science，268681-686)。其目的尤其在于提高種子油的脂肪酸含量。
同樣特別有意義的是可以由植物油獲得的脂肪酸。例如，它們可以用作增塑劑、潤滑劑、表面活性劑、化妝品等的基質，而且在食品和飼料工業中可以用作有價值的基質。由此，例如，特別感興趣的是提供具有中等鏈長脂肪酸的菜籽油，因為它們是表面活性劑生產中特別需要的。
通過重組方法對植物代謝途徑定向修飾能夠以有利方式修飾植物代謝，而這在使用傳統育種方法時只有在經過復雜的過程后才能夠實現或根本無法實現。由此，不常見脂肪酸，例如特定的多不飽和脂肪酸，只在某些植物中合成或在植物中根本不合成，因此只能通過在轉基因植物中表達相關酶來進行生產(例如Millar等人，2000，Trends Plant Sci，595-101)。
三酰甘油酯和其它脂質從脂肪酸合成。脂肪酸生物合成和三酰甘油酯生物合成由于區室化的原因可以看成是分開的生物合成途徑，但是從終產物的角度則可以看成是單一的生物合成途徑。脂質合成可以分成兩部分機制，一部分可以稱為“原核機制”，而另一部分可以稱為“真核機制”(Browse等人，1986，Biochemical J，23525-31；Ohlrogge和Browse，1995，Plant Cell，7957-970)。原核機制定位于質體內，包括游離脂肪酸的生物合成及將它們輸出至細胞質，在此處它們以脂肪酸酰基-CoA酯的形式進入真核機制，并由甘油-3-磷酸(G3P)酯化形成磷脂酸(PA)。PA是中性和極性脂質的合成起點。中性脂質在內質網上通過Kennedy途徑合成(Voelker，1996，Genetic Engineering(遺傳工程)，Setlow編，18111-113；Shankline和Cahoon，1998，Annu Rev Plant Physiol Plant MolBiol，49611-649；Frentzen，1998，Lipids，100161-166)。除了三酰甘油酯的生物合成，G3P在甘油合成中也發揮作用(例如出于滲透調節的目的和例如抵抗低溫協迫的目的)。
對合成至關重要的G3P由甘油-3-磷酸脫氫酶(G3PDH)還原磷酸二羥丙酮(DHAP)而合成，G3PDH也稱為磷酸二羥丙酮還原酶。通常，NADH擔當還原性共底物(EC 1.1.1.8)。另一類甘油-3-磷酸脫氫酶(EC 1.1.99.5)利用FAD作為共底物(cosubstrate)。這類酶催化DHAP轉變成G3P的反應。在真核細胞中，這兩類酶分布于不同的區室內，依賴NAD的位于細胞質中，而依賴FAD的位于線粒體中(對于釀酒酵母，參閱例如Larsson等人，1998，Yeast，14347-357)。EP-A 0 353 049描述了來自芽孢桿菌的不依賴NAD的G3PDH。在釀酒酵母中同樣鑒定了不依賴NAD的G3PDH(Miyata X、Nagahisa M，1969，Plant Cell Physiol，10(3)635-643)。
G3PDH是原核細胞和真核細胞中至關重要的酶，除了在脂質生物合成中發揮功能，其還是負責通過作用于NAD+/NADH比率來維持細胞氧化還原狀態的酶之一。在釀酒酵母中缺失GPD2基因(這種酵母中的兩種G3PDH同種型之一)導致厭氧條件下的生長減緩。另外，G3PDH似乎在酵母的應激反應中發揮作用，并主要針對滲透壓協迫起作用。在釀酒酵母中缺失GPD1基因引起對氯化鈉的超敏性。
現有技術中已經描述了昆蟲(黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)、Drosophila virilis)、植物(擬南芥(Arabidopsis thaliana)、披針葉萼距花(Cuphea lanceolata))、哺乳動物(人(Homo sapiens)、小家鼠(Musmusculus)、野豬(Sus scrofa)、褐家鼠(Rattus norvegicus))、魚(鮭(Salmo salar)、美洲胡瓜魚(Osmerus mordax))、鳥(Ovis aries)、兩棲動物(光滑爪蟾(Xenopus laevis))、線蟲(Caenorhabditis elegans)、藻類和細菌的G3PDH序列。
植物細胞具有至少兩種G3PDH同種型，一種細胞質同種型和一種質體同種型(Gee RW等人，1988，Plant Physiol，8698-103；Gee RW等人，1988，Plant Physiol，87379-383)。在植物中，甘油-3-磷酸脫氫酶的酶活性首先是在馬鈴薯塊莖中發現的(Santora GT等人，1979，ArchBiochem Biophys，196403-411)。另外，在其它植物諸如豌豆、玉米或大豆中檢測到定位于細胞質和質體中的G3PDH活性(Gee RW等人，1988，Plant Physiol，86(1)98-103)。另外，已經鑒定了來自藻類的G3PDH，諸如來自杜氏藻(Dunaliella tertiolecta)的兩種質體G3PDH同種型和一種細胞質G3PDH同種型(Gee R等人，1993，Plant Physiol，103(1)243-249；Gee R等人，1989，Plant Physiol，91(1)345-351)。對于來自披針葉萼距花的植物G3PDH，曾有人建議通過在植物中進行過表達來提高含油量或轉變脂肪酸模式(WO 95/06733)。然而，這些效果尚未證實。
已經描述了細菌G3PDH及其功能(Hsu和Fox，1970，J Bacteriol，103410-416；Bell，1974，J Bacterial，1171065-1076)。
WO 01/21820描述了用于提高壓力耐受性和改變貯藏油的脂肪酸組成進行的突變型大腸桿菌G3PDH異源表達。突變型大腸桿菌G3PDH(gpsA2FR)展示單一氨基酸替代，致使來自G3P的抑制作用降低。gpsA2FR突變體的異源表達產生了C16脂肪酸含量提高且由此C18脂肪酸含量降低的甘油酯。脂肪酸模式的修飾相對較小觀察到16:0脂肪酸提高2-5％，16:3脂肪酸提高1.5-3.5％，而18:2和18:3脂肪酸降低2-5％。總甘油酯含量保持不變。
還描述了來自酵母(子囊菌綱Ascomycetes)的G3PDH，所述酵母為例如a)粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)(Pidoux AL等人，1990，Nucleic Acids Res，18(23)7145；GenBank Acc.-NO.X56162；OhmiyaR等人，1995，Mol Microbiol，18(5)963-973；GenBank Acc.-NO.D50796、D50797)、b)Yarrowia lipolytica(GenBank Acc.-NO.AJ250328)、c)Zygosaccharomyces rouxii(Iwaki T等人，Yeast，2001，18(8)737-744；GenBank Acc.-NO.AB047394、AB047395、AB047397)、d)釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(Albertyn J等人，1994，Mol CellBiol，14(6)4135-4144；Albertyn J等人，1992，FEBS Lett，308(2)130-132；Merkel JR等人，1982，Anal Biochem，122(1)180-185；Wang HT等人，1994，J Bacteriol，176(22)7091-7095；Eriksson P等人，1995，Mol Microbiol，17(1)95-107；GenBankAcc.-NO.U04621、X76859、Z35169)、e)Emericella nidulans(GenBank Acc.-NO.AF228340)、或f)漢遜德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)(GenBank Acc.-NO.AF210060)。

發明內容
本發明的一個目的是提供用于提高植物含油量的候選方法。我們已經發現通過本發明可以實現這個目的。
本發明的第一方面包括提高植物生物體或其組織、器官、部分、細胞或繁殖材料的總含油量的方法，包括a)使酵母甘油-3-磷酸脫氫酶在所述植物生物體或其組織、器官、部分、細胞或繁殖材料中轉基因表達，和b)選擇植物生物體，其中所述植物生物體或其組織、器官、部分、細胞或繁殖材料的總含油量與起始生物體相比得到了提高。
令人驚訝的是，已經發現酵母蛋白質Gpdlp(來自釀酒酵母的G3PDH；SEQ ID NO2)在擬南芥種子中的種子特異性異源表達導致三酰甘油酯(貯藏油)含量顯著提高。與野生型對照植株相比，含油量提高了大約22％，在一個轉基因品系中甚至提高了41％(見

圖1)。酵母甘油-3-磷酸脫氫酶的轉基因表達對轉化植株的生長和其它特性沒有不利影響。由于G3PDH在所有植物生物體中都是生物合成關鍵酶，因此，除了作為模式植物的擬南芥以外，依照本發明的方法原則上可以應用于所有植物物種。依照本發明的方法優選應用于天然已具有高油含量和/或用于油的工業生產的油料作物。
“植物生物體或其組織、器官、部分、細胞或繁殖材料”通常應理解為意指能夠進行光合作用的任何單細胞或多細胞生物體或其細胞、組織、部分或繁殖材料(諸如種子或果實)。出于本發明的目的，包括植物界的所有高等和低等植物屬和種。優選一年生和多年生的單子葉和雙子葉植物。還包括成熟植株、種子、枝條和幼苗，以及部分、繁殖材料(例如塊莖、種子或果實)和由它們衍生的培養物，例如細胞培養物或愈傷組織培養物。
出于本發明的目的，“植物”指植物界的所有高等和低等植物屬和種。該術語包括成熟植株、種子、枝條和幼苗，以及部分、繁殖材料、植物器官組織、由其衍生的原生質體、愈傷組織和其它培養物，例如細胞培養物，以及產生功能或結構單位的所有其它種類的植物細胞群。成熟植株指幼苗以后的任何發育階段的植株。幼苗指處于早期發育階段的幼小未成熟植株。
“植物”包括所有一年生和多年生的單子葉和雙子葉植物，并且包括例如，但不限于以下屬的植物南瓜屬(Cucurbita)、薔薇屬(Rosa)、葡萄屬(Vitis)、核桃屬(Juglans)、草莓屬(Fragaria)、百脈根屬(Lotus)、苜蓿屬(Medicago)、驢食豆屬(Onobrychis)、車軸草屬(Trifolium)、胡盧巴屬(Trigonella)、豇豆屬(Vigna)、柑桔屬(Citrus)、亞麻屬(Linum)、老鸛草屬(Geranium)、Manihot、胡蘿卜屬(Daucus)、擬南芥屬(Arabidopsis)、蕓苔屬(Brassica)、蘿卜屬(Raphanus)、歐白芥屬(Sinapis)、顛茄屬(Atropa)、辣椒屬(Capsicum)、曼陀羅屬(Datura)、天仙子屬(Hyoscyamus)、番茄屬(Lycopersicon)、煙草屬(Nicotiana)、茄屬(Solarium)、碧冬茄屬(Petunia)、毛地黃屬(Digitalis)、Majorana)、菊苣屬(Cichorium.)、向日葵屬(Helianthus)、萵苣屬(Lactuca)、雀麥屬(Bromus)、天門冬屬(Asparagus)、金魚草屬(Antirrhinum)、Heterocallis、Nemesis、天竺葵屬(Pelargonium)、黍屬(Panieum)、狼尾草屬(Pennisetum)、毛茛屬(Ranunculus)、千里光屬(Senecio)、Salpiglossis)、香瓜屬(Cucumis)、Browaalia)、大豆屬(Glycine)、豌豆屬(Pisum)、菜豆屬(Phaseolus)、黑麥草屬(Lolium)、稻屬(Oryza)、玉蜀黍屬(Zea)、燕麥屬(Avena)、大麥屬(Hordeum)、黑麥屬(Secale)、小麥屬(Triticum)、高粱屬(Sorghum)、云杉屬(Picea)和楊屬(Populus)。
優選的植物是來自以下科的植物莧科(Amaranthaceae)、紫菀科(Asteraceae)、蕓苔科(Brassicaceae)、石竹科(Caryophyllaceae)、藜科(Chenopodiaceae)、菊科(Compositae)、十字花科(Cruciferae)、葫蘆科(Cucurbitaceae)、唇形科(Labiatae)、豆科(Leguminosae)、Papilionoideae、百合科(Liliaceae)、亞麻科(Linaceae)、錦葵科(Malvaceae)、薔薇科(Rosaceae)、茜草科(Rubiaceae)、虎耳草科(Saxifragaceae)、玄參科(Scrophulariaceae)、茄科(Solanaceae)、梧桐科(Sterculiaceae)、Tetragoniaceae、山茶科(Theaceae)、傘形科(Umbelliferae)。
具體而言，優選的單子葉植物選自單子葉作物，諸如禾本科，諸如水稻、玉米、小麥或其它谷類諸如大麥、粟和高粱、黑麥、黑小麥或燕麥、和甘蔗、以及所有草類。
本發明極其特別優選用于雙子葉植物生物體。具體而言，優選的雙子葉植物選自雙子葉作物，諸如-紫菀科(Asteraceae)，諸如向日葵、萬壽菊或金盞花等，-菊科(Compositae)，尤其是萵苣屬(Lactuca)，非常特別的是物種萵苣(L.sativa)等，-十字花科(Cruciferae)，特別是蕓苔屬(Brassica)，非常特別的是物種歐洲油菜(B.napus)、蕓苔(B.campestris)、卷心菜(B.oleracea cv Tastie)、花椰菜(B.oleracea cv Snowball Y)和椰菜(B.oleracea cv Emperor)和其它甘藍；和擬南芥屬(Arabidopsis)，非常特別的是物種擬南芥(A.thaliana)和水芹或canola等，-葫蘆科(Cucurbitaceae)，諸如甜瓜、南瓜或夏南瓜等，-豆科(Leguminosae)，特別是大豆屬(Glycine)，非常特別的是物種大豆(G.max)、黃豆、和紫花苜蓿、豌豆、豆類或花生等，-茜草科(Rubiaceae)，優選Lamiidae亞類，諸如小果咖啡(Coffea arabica)或大果咖啡(Coffea liberica)(咖啡樹)等，-茄科(Solanaceae)，特別是番茄屬(Lycopersicon)，非常特別的是物種番茄(L.esculentum)，茄屬(Solanum)，非常特別的是物種馬鈴薯(S.tuberosum)和茄(S.melongena)和辣椒屬(Capsicum)，非常特別的是物種辣椒(C.annuum)和煙草或紅辣椒等，-梧桐科(Sterculiaceae)，優選Dilleniidae亞類，諸如可可樹(Theobromacacao)等，-山茶科(Theaceae)，優選Diileniidae亞類，諸如茶(Camellia sinensis)或Thea sinensis(茶樹)等，-傘形科(Umbelliferae)，特別是胡蘿卜屬(Daucus)(非常特別的是物種胡蘿卜(D.carota))，和Apium屬(非常特別的是物種旱芹(A.graveolensdulce))等，以及亞麻籽、棉花、大麻、亞麻、黃瓜、菠菜、胡蘿卜、甜菜和各種樹、堅果和葡萄物種，特別是香蕉和獼猴桃。
本發明還包括觀賞植物、實用或觀賞樹、花、切花、灌木或草皮。可以作為非限制性實例提及的植物是被子植物，苔蘚植物諸如毛茛科(Hepaticae)(liver flowers)和Musci(蘚類)；蕨類植物諸如蕨類、木賊和石松；裸子植物諸如松柏類、蘇鐵屬、銀杏和買麻藤亞綱(Gnetatae)，薔薇科(Rosaceae)諸如玫瑰、杜鵑花科(Ericaceae)諸如北美杜鵑和杜鵑、大戟科(Euphorbiaceae)諸如猩猩木和巴豆、石竹科(Caryophyllaceae)諸如石竹、茄科(Solanaceae)諸如矮牽牛、苦苣苔科(Gesneriaceae)諸如非洲紫羅蘭、鳳仙花科(Balsaminaceae)諸如鳳仙花、蘭科(Orchidaceae)諸如蘭、鳶尾科(Iridaceae)諸如唐菖蒲、鳶尾、小蒼蘭和番紅花、菊科(Compositae)諸如金盞花、牻牛兒苗科(Geraniaceae)諸如天竺葵、百合科(Liliaceae)諸如龍血樹(dracena)、桑科(Moraeeae)諸如榕、天南星科(Araceae)諸如cheeseplant等等。
另外，出于本發明的目的，植物生物體還包括具有光合作用活性的生物體，諸如藻類、藍細菌和蘚類。優選的藻類是綠藻諸如紅球藻屬(Haematococcus)、三角褐指藻(Phaeodactylum tricornatum)、團藻屬(Volvox)或杜氏藻屬(Dunaliella)的藻類。特別優選集胞藻屬(Synechocystis)。
最優選的是油料作物。油料作物應理解為天然含油量已較高的和/或可用于油的工業生產的植物。這些植物可以具有高含油量和/或具有工業價值的特定脂肪酸組成。優選的植物是脂質含量為至少1％(以重量計)的那些植物。油料作物包括例如琉璃苣(Borago officinalis)；蕓苔屬物種諸如蕓苔(B.campestris)、歐洲油菜(B.napus)、蕪菁(B.rapa)；大麻(Cannabis sativa)；紅花(Carthamus tinctorius)；椰子(Cocos nucifera)；海甘藍(Crambe abyssinica)；萼距花屬物種(萼距花屬物種產生中等鏈長脂肪酸，其特別是可用于工業應用)；油棕(Elaeis guinensis)；美洲油棕(Elaeis oleifera)；大豆(Glycine max)；陸地棉(即美洲棉，Gossypiumhirsutum)；海島棉(Gossypium barbadense)；草棉(Gossypiumherbaceum)；向日葵(Helianthus annuus)；亞麻或亞麻籽(Linumusitatissimum)；月見草(Oenothera biennis)；油橄欖(Olea europaea)；稻(Oryza sativa)；蓖麻(Ricinus communis)；胡麻(Sesamum indicum)；小麥屬Triticum物種；玉蜀黍(Zea mays)和各種堅果物種，諸如胡桃或杏。
“總含油量”指所有油類的總和，優選三酰甘油酯的總和。
“油類”包括中性和/或極性脂質及其混合物。可以提及表1中所列的油類作為非限制性實例。
表1植物脂質的類別

中性脂質優選指三酰甘油酯。中性和極性脂質可以包含各種脂肪酸。可以提及表2中所列的脂肪酸作為非限制性實例。
表2各種脂肪酸(選擇)的概述1鏈長雙鍵數目*在植物中不天然存在


油類優選涉及種子油。
總含油量“提高”指植物或其部分、組織或器官、優選植物種子器官中的含油量提高。在本文中，在相同條件下，與未實施依照本發明的方法因而未修飾的起始植物相比，含油量提高至少5％、優選至少10％、特別優選至少15％、非常特別優選至少20％、最優選至少25％。本文中的條件指與植物的萌芽、栽培或生長有關的所有條件，諸如土壤條件、氣候條件、光照條件、施肥、灌溉、植株保護處理等等。
“酵母甘油-3-磷酸酯脫氫酶”(下文稱為“酵母G3PDH”)通常指能夠將磷酸二羥丙酮(DHAP)轉變成甘油-3-磷酸(G3P)-優選使用諸如NADH等共底物-且在酵母中天然表達的所有酶。
酵母指具有明顯細胞壁并形成假菌絲體(與霉菌不同)的單細胞真菌類。它們通過出芽和/或裂殖進行無性繁殖(分別是裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)和類酵母屬(Saccharomycodes))。
包括擬酵母，優選隱球酵母科(Cryptococcaceae)和擲孢酵母科(Sporobolomycetaceae)(包括隱球酵母屬(Cryptococcus)、球擬酵母屬(Torulopsis)、瓶形酵母屬(Pityrosporum)、酒香酵母屬(Brettanomyces)、假絲酵母屬(Candida)、克勒克酵母屬(Kloeckera)、三角酵母屬(Trigonopsis)、絲孢酵母屬(Trichosporon)、紅酵母屬(Rhodotorula以及擲孢酵母屬(Sporobolomyces)和布勒彈孢酵母屬(Bullera))；和真酵母(也進行有性繁殖的酵母；子囊)，優選內孢霉科(endomycetaceae)和酵母科(saccharomycetaceae)(包括酵母屬(Saccharomyces)、德巴利酵母屬(Debaromyces)、油脂酵母屬(Lipomyces)、漢遜酵母屬(Hansenula)、擬內孢霉屬(Endomycopsis)、畢赤酵母屬(Pichia)、有孢漢遜酵母屬(Hanseniaspora)。最優選的是物種釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)、多形漢遜酵母(Hansenulapolymorpha)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces lactis)、Zygosaccharomyces rouxii、Yarrowialipolitica、Emericella nidulans、構巢曲霉(Aspergillus nidulans)、漢遜德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)和漢遜有孢圓酵母(Torulasporahansenii)。
酵母G3PDH尤其指具有下列特征作為“必要特征”的多肽a)使用NADH作為共底物將磷酸二羥丙酮轉變成甘油-3-磷酸(EC1.1.1.8)，和b)包含至少一個選自下組的序列基序的肽序列i)GSGNWGT(A/T)IAK (SEQ ID NO22)ii)CG(V/A)LSGAN(L/I/V)AXE(V/I)A (SEQ ID NO26)iii)(L/V)FXRPYFXV (SEQ ID NO27)優選選自下組的序列基序iv)GSGNWGTTIAKV(V/I)AEN (SEQ ID NO29)v)NT(K/R)HQNVKYLP (SEQ ID NO30)vi)D(I/V)LVFN(I/V)PHQFL (SEQ ID NO31)vii)RA(I/V)SCLKGFE (SEQ ID NO32)viii)CGALSGANLA(P/T)EVA (SEQ ID NO33)ix)LFHRPYFHV(SEQ ID NO34)x)GLGEII(K/R)FG (SEQ ID NO35)肽序列特別優選包含至少2或3種、非常特別優選至少4或5種、最優選所有選自序列基序i)、ii)和iii)或者選自序列基序iv)、v)、vi)、vii)、viii)、ix)和x)的序列基序。(括號中的字母指可能出現于該位置的可選氨基酸；例如(V/I)指纈氨酸或異亮氨酸都可能位于該位置)。
此外，除了上述序列基序i)至x)中的至少一種以外，酵母G3PDH可以任選包含選自下組的其它序列基序xi)H(E/Q)NVKYL (SEQ ID NO23)xii)(D/N)(I/V)(L/I)V(F/W)(V/N)(L/I/V)PHQF(V/L/I)(SEQ ID NO24)xiii)(A/G)(I/V)SC(L/I)KG (SEQ ID NO25)xiv)G(L/M)(L/G)E(M/I)(I/Q)(R/K/N)F(G/S/A)(SEQ ID NO28)最優選的是，酵母G3PDH指SEQ ID NO2所示酵母蛋白質Gpd1p和其功能等價物或以上的功能等價部分。
功能等價物尤其指SEQ ID NO2所示酵母蛋白質Gpd1p的天然或人工突變體和與上文定義的酵母G3PDH具有相同必要特征的來自其它酵母的同源多肽。突變包括一個或多個氨基酸殘基的替代、添加、缺失、倒位或插入。尤其優選SEQ ID NO4、5、7、9、11、12、14、16、38或40描述的多肽。
使用例如SEQ ID NO2所示酵母G3PDH序列或編碼前者的SEQ IDNO1所示核酸序列作為搜索序列或探針，通過搜索數據庫或篩選基因或cDNA文庫，可以容易地找到本發明范圍內有利采用的酵母G3PDH。
所述功能等價物與具有SEQ ID NO2的蛋白質優選至少60％、特別優選至少70％、特別優選至少80％、最優選至少90％同源。
兩種多肽之間的同源性應理解為意指氨基酸序列在整個序列長度上的同一性，它是借助程序算法GAP(Wisconsin Package Version 10.0，威斯康星大學，Genetics Computer Group(GCG)，麥迪遜，美國)并設置下列參數進行比較而計算得出的缺口加權8 長度加權2平均匹配2，912 平均錯配-2,003例如，在蛋白質水平上與序列SEQ ID NO2具有至少80％同源性的序列應理解為意指當使用上述程序算法和上述參數設置與序列SEQ IDNO2進行比較時具有至少80％同源性的序列。
功能等價物還包括由與核酸序列SEQ ID NO1具有至少60％、特別優選至少70％、特別優選至少80％、最優選至少90％同源性的核酸序列編碼的那些蛋白質。
兩種核酸序列之間的同源性應理解為意指兩種核酸序列在整個序列長度上的同一性，它是借助程序算法GAP(Wisconsin Package Version 10.0，威斯康星大學，Genetics Computer Group(GCG)，麥迪遜，美國)并設置下列參數進行比較而計算得出的缺口加權50 長度加權3平均匹配10 平均錯配0例如，在核酸水平上與序列SEQ ID NO1具有至少80％同源性的序列應理解為意指當使用上述程序算法和上述參數設置與序列SEQ ID NO1進行比較時具有至少80％同源性的序列。
功能等價物還包括由在標準條件下與SEQ ID NO1所示核酸序列雜交的核酸序列或與其互補的核酸序列或其部分編碼的且具有酵母G3PDH的必要特征的那些蛋白質。
“標準雜交條件”應作廣義理解，但是優選指嚴謹雜交條件。這些雜交條件描述于例如Sambrook J、F ritsch EF、Maniatis T等人，《MolecularCloning，A Laboratory Manual》(分子克隆，實驗室指南)，第2版，冷泉港實驗室出版社，1989，第9.31-9.57頁；或《Current Protocols inMolecular Biology》(分子生物學通用方案)，John Wiley & Sons，紐約，1989，第6.3.1-6.3.6頁。例如，洗滌步驟的條件可以選自高嚴謹條件的范圍(大約0.2X SSC，50℃，優選65℃)(20X SSC0.3M檸檬酸鈉、3M NaCl，pH7.0)。雜交過程中也可以采用變性劑，諸如甲酰胺或SDS。在存在50％甲酰胺時，優選在42℃進行雜交。
本發明還涉及能夠確保酵母G3PDH在植物生物體或所述植物生物體的組織、器官、部分、細胞或繁殖材料中進行轉基因表達的轉基因表達構建體。
上文給出的定義適用于酵母G3PDH，特別優選由序列SEQ ID NO2描述的酵母G3PDH的轉基因表達。
在所述轉基因表達構建體中，編碼酵母G3PDH的核酸分子優選可操作連接至少一種確保在植物生物體或其組織、器官、部分、細胞或繁殖材料中進行表達的遺傳調控元件(例如啟動子)。
尤其優選轉基因表達盒，其中編碼甘油-3-磷酸脫氫酶的核酸序列為a)序列SEO ID NO1、3、6、8、10、13、15、37或39，或b)根據遺傳密碼的簡并性，由序列SEQ ID NO1、3、6、8、10、13、15、37或39衍生的序列，c)與序列SEQ ID NO1具有至少60％同一性的序列。
可操作連接應理解為意指例如啟動子與待表達的編碼酵母G3PDH的核酸序列(例如SEQ ID NO1所示序列)和，如果適當，諸如終止子等其它調控元件的順序排列，此排列使得每一種調控元件在重組表達核酸序列時都能夠發揮其功能。這個目的并非必然要求化學意義上的直接連接。諸如增強子序列等遺傳控制序列也能夠從遠距離位置或事實上從其它DNA分子對靶序列發揮它們的功能。優選的排列是將待重組表達的核酸序列置于擔當啟動子的序列的后面，使得兩種序列彼此共價相連。啟動子序列與待重組表達的核酸序列之間的距離優選少于200個堿基對，特別優選少于100個堿基對，非常特別優選少于50個堿基對。
可操作連接和轉基因表達盒都可以通過常規重組和克隆技術的手段來實現，這些技術描述于例如Maniatis T、Fritsch EF和Sambrook J，1989，《Molecular Cloning，A Laboratory Manual》(分子克隆，實驗室指南)，冷泉港實驗室，冷泉港，紐約；Silhavy TJ、Berman ML和Enquist LW，1984，《Experiments with Gene Fusion》(基因融合實驗)，冷泉港實驗室，冷泉港，紐約；Ausubel FM等人，1987，《Current Protocols inMolecular Biology》(分子生物學通用方案)，Greene Publishing Assoc.andWiley Interscience；和Gelvin等人，1990，《Plant Molecular BiologyManual》(植物分子生物學指南)。然而，還可以將例如具有限制酶特異性切割位點的擔當接頭的序列或信號肽序列等其它序列置于這兩種序列之間。此外，序列的插入可能導致融合蛋白的表達。優選的是，由與待表達核酸序列相連的啟動子組成的表達盒可以是載體整合形式，而且可以，例如通過轉化，插入植物基因組。
然而，轉基因表達盒應理解為也意指將編碼酵母G3PDH的核酸序列置于內源植物啟動子的后面從而使得后者可以引起酵母G3PDH表達的那些構建體。
優選導入轉基因表達盒的啟動子是在植物生物體或其組織、器官、部分、細胞或繁殖材料中可操作的那些啟動子。在植物生物體中可操作的啟動子應理解為意指能夠在植物或植物部分、植物細胞、植物組織或植物培養物中控制基因，特別是外來基因表達的任何啟動子。在本文中，表達可以是例如組成型、誘導型或發育依賴性的。
優選下列啟動子a)組成型啟動子“組成型”啟動子指確保在許多、優選所有組織中在植物發育的實質階段、優選植物發育的所有時間表達的那些啟動子(Benfey等人，1989，EMBO J，82195-2202)。尤其優選使用植物啟動子或源自植物病毒的啟動子。尤其優選CaMV(花椰菜花葉病毒)35S轉錄本啟動子(Franck等人，1980，Cell，21285-294；Odell等人，1985，Nature，313810-812；Shewmaker等人，1985，Virology，140281-288；Gardner等人，1986，Plant Mol Biol，6221-228)或CaMV 19S啟動子(US 5,352,650；WO 84/02913；Benfey等人，1989，EMBO J，82195-2202)。其它合適的組成型啟動子是二磷酸核酮糖羧化酶-加氧酶小亞基(SSU)啟動子(US4,962,028)、豆球蛋白B啟動子(GenBank編號X03677)、來自農桿菌的胭脂堿合酶啟動子、TR二元啟動子、來自農桿菌的OCS(章魚堿合酶)啟動子、泛素啟動子(Holtorf S等人，1995，Plant Mol Biol，29637-649)、泛素1啟動子(Christensen等人，1992，Plant Mol Biol，18675-689；Bruce等人，1989，Proc Natl Acad Sci USA，869692-9696)、Smas啟動子、肉桂醇脫氫酶啟動子(US 5,683,439)、液泡ATP酶亞基的啟動子、擬南芥腈水解酶-1基因的啟動子(GenBank編號U38846，第3862-5325或5342位核苷酸)或來自小麥的富含脯氨酸的蛋白質的啟動子(WO91/13991)，以及本領域技術人員知道的在植物中組成型表達的其它基因啟動子。特別優選CaMV 35S啟動子和擬南芥腈水解酶-1啟動子。
b)組織特異性啟動子還優選對種子具有特異性的啟動子，諸如菜豆蛋白啟動子(US5,504,200；Bustos MM等人，1989，Plant Cell，1(9)839-853)、2S清蛋白基因的啟動子(Joseffson LG等人，1987，J Biol Chem，26212196-12201)、豆球蛋白啟動子(Shirsat A等人，1989，Mol Gen Genet，215(2)326-331)、USP(未知種子蛋白質)啟動子(Bumlein H等人，1991，Mol Gen Genet，225(3)459-467)、napin基因啟動子(US 5,608,152；Stalberg K等人，1996，L Planta，199515-519)、蔗糖結合蛋白的啟動子(WO 00/26388)或豆球蛋白B4啟動子(LeB4；Bumlein H等人，1991，Mol Gen Genet，225121-128；Bumlein等人，1992，Plant Journal，2(2)233-239；Fiedler U等人，1995，Biotechnology(紐約)，13(10)1090f)、擬南芥屬(Arabidopsis)油質蛋白啟動子(WO 98/45461)、和蕓苔屬(Brassica)Bce4啟動子(WO 91/13980)。
其它合適的種子特異性啟動子是編碼高分子量麥谷蛋白(HMWG)、麥醇溶蛋白、分支酶、ADP葡萄糖焦磷酸酶(AGP酶)或淀粉合酶的基因的那些啟動子。其它優選的啟動子是容許在諸如玉米、大麥、小麥、黑麥、水稻等單子葉植物中進行種子特異性表達的那些啟動子。可以有利的采用lpt2或lpt1基因的啟動子(WO 95/15389、WO 95/23230)或WO 99/16890中描述的啟動子(大麥醇溶蛋白基因、谷蛋白基因、oryzin基因、谷醇溶蛋白基因、麥醇溶蛋白基因、麥谷蛋白基因、玉米醇溶蛋白基因、casirin基因或secalin基因的啟動子)。
c)化學誘導型啟動子表達盒也可以包含化學誘導型啟動子(綜述Gatz等人，1997，AnnuRev Plant Physiol Plant Mol Biol，4889-108)，由此可以在特定時間點控制外源基因在植物中的表達。同樣可以使用這些啟動子，諸如PRP1啟動子(Ward等人，1993，Plant Mol Biol，22361-366)、水楊酸誘導型啟動子(WO 95/19443)、苯磺酰胺誘導型啟動子(EP 0 388 186)、四環素誘導型啟動子(Gatz等人，1992，Plant J，2397-404)、脫落酸誘導型啟動子(EP 0 335 528)或乙醇-環己酮誘導型啟動子(WO 93/21334)。同樣合適的是谷胱甘肽S轉移酶同種型II基因(GST-II-27)的啟動子，它可以由外源施用的安全劑，諸如N，N-二烯丙基-2，2-二氯乙酰胺激活(WO93/01294)，而且在單子葉植物和雙子葉植物的許多組織中都是可操作的。
特別優選組成型啟動子，極其特別優選種子特異性啟動子，尤其是napin啟動子和USP啟動子。
另外，可以將能夠在其它植物組織或其它生物體諸如大腸桿菌中進行表達的其它啟動子可操作地連接到待表達的核酸序列上。原則上，合適的植物啟動子是所有上文所述啟動子。
可以將依照本發明的轉基因表達盒或轉基因載體中存在的核酸序列可操作地連接啟動子以外的其它遺傳控制序列。術語遺傳控制序列應作廣義理解，指對依照本發明的表達盒的建立或功能有影響的所有那些序列。遺傳控制序列在原核或真核生物體中修飾例如轉錄和翻譯。依照本發明的轉基因表達盒優選在每個盒中在待重組表達的核酸序列的5′上游包含植物特異性啟動子，而且在3′下游包含終止子序列作為額外的遺傳控制序列，并且，如果是適當的，在每個盒中將其它常規調控元件可操作地連接到待重組表達的核酸序列上。
遺傳控制序列還包括能夠修飾表達控制特性的其它啟動子、啟動子元件或最低限度啟動子。由此，遺傳控制序列能夠例如引起組織特異性表達，該表達同時還依賴于某些協迫因素。現已描述了針對例如水協迫、脫落酸(Lam E和Chua NH，J Biol Chem，1991，266(26)17131-17135)和熱協迫(Schoffl F等人，1989，Mol Gen Genetics，217(2-3)246-253)的這些元件。
其它有利的控制序列是例如革蘭氏陽性細菌啟動子amy和SPO2，以及酵母或真菌啟動子ADC1、MFa、AC、P-60、CYC1、GAPDH、TEF、rp28、ADH。
原則上所有天然啟動子及其調控序列，像上文所述的那些，都可用于依照本發明的方法。另外，也可以有利的使用合成的啟動子。
遺傳控制序列還包括基因的5′非翻譯區、內含子或3′非編碼區，諸如肌動蛋白-1內含子、或Adh1-S內含子1、2和6(一般參考《The MaizeHandbook》(玉米手冊)，第116章，Freeling和Walbot編，Springer，紐約，1994)。已經證明它們在調控基因表達中可以發揮重要作用。由此，已經證明5′非翻譯序列能夠增強異源基因的瞬時表達。可以提及煙草花葉病毒5′前導序列(Gallie等人，1987，Nucl Acids Res，158693-8711)等作為翻譯增強子的實例。它們可能還促進組織特異性(Rouster J等人，1998，Plant J，15435-440)。
瞬時表達盒可以有利的包含一個或多個稱為增強子的序列，它們可操作連接啟動子，并使得可以增強核酸序列的重組表達。還可以將其它有利序列諸如其它調控元件或終止子插在待重組表達的核酸序列的3′末端。基因構建體中可以存在待重組表達的核酸序列的一個或多個拷貝。
適合作為控制序列的多聚腺苷酸化信號是植物多聚腺苷酸化信號，優選實質上相應于根癌農桿菌T-DNA多聚腺苷酸化信號的那些信號，特別是Ti質粒pTiACHS(Gielen等人，1984，EMBO J，3835及以下)的T-DNA基因3(章魚堿合酶)的那些信號或其功能等價物。特別合適的終止子序列的實例是OCS(章魚堿合酶)終止子和NOS(胭脂堿合酶)終止子。
控制序列應理解為也指可以同源重組或插入宿主生物體基因組或從基因組中除去的那些序列。在同源重組的情況中，例如，可以以定向方式將特定內源基因的編碼序列交換為編碼dsRNA的序列。諸如cre/lox技術等方法容許組織特異性地及可能地可誘導地由宿主生物體的基因組中除去表達盒(Sauer B，1998，Methods，14(4)381-392)。在這里，向靶基因添加某些側翼序列(lox序列)，這樣稍后可能通過cre重組酶將它們去除。
重組表達盒及由其衍生的重組載體可以包含其它功能元件。術語功能元件應廣義理解，指對依照本發明的表達盒、載體或轉基因生物體的生成、復制或功能有影響的所有那些元件。
可以提及的非限制性實例是a)賦予抗代謝抑制劑諸如2-脫氧葡萄糖-6-磷酸(WO 98/45456)、抗生素或殺生物劑(優選除草劑)，諸如卡那霉素、G418、博來霉素、潮霉素、或膦絲菌素等的抗性的選擇標記。特別優選的選擇標記是賦予除草劑抗性的那些標記。可以提及下列選擇標記作為實例編碼膦絲菌素乙酰轉移酶(PAT)的DNA序列和滅活谷氨酰胺合酶抑制劑的DNA序列(pat和bar基因)、賦予抗Glyphosate(N-(膦酰基甲基)甘氨酸)抗性的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶基因(EPSP合酶基因)、編碼Glyphosate降解酶(草甘膦氧化還原酶)的gox基因、deh基因(編碼滅活茅草枯的脫鹵素酶)、滅活碘酰脲和咪唑酮的乙酰乳酸合酶、和編碼降解溴苯腈的腈水解酶的bxn基因、賦予抗生素apectinomycin抗性的aasa基因、賦予鏈霉素抗性的鏈霉素磷酸轉移酶(SPT)基因、賦予卡那霉素或geneticidin抗性的新霉素磷酸轉移酶(NPTII)基因、賦予潮霉素抗性的潮霉素磷酸轉移酶(HPT)基因、賦予碘酰脲除草劑抗性的乙酰乳酸合酶基因(ALS)(例如具有例如S4和/或Hra突變的突變型ALS變體)。
b)編碼易于計量的蛋白質并能夠通過顏色或酶活性來評估轉化效率或者表達部位或時間的報道基因。在本文中極其特別優選的是報道蛋白(Schenborn E、Groskreutz D，Mol Biotechnol，1999，13(1)29-44)，諸如“綠色熒光蛋白”(GFP)(Sheen等人，1995，Plant Journal，8(5)777-784)、氯霉素轉移酶、螢光素酶(Ow等人，1986，Science，234856-859)、水母發光蛋白基因(Prasher等人，1985，BiochemBiophys Res Commun，126(3)1259-1268)、β-半乳糖苷酶，其中極其特別優選β-半乳糖苷酶(Jefferson等人，1987，EMBO J，63901-3907)。
c)容許依照本發明的表達盒或載體在例如大腸桿菌中進行復制的復制起點。可以提及的實例是ORI(DNA復制起點)、pBR322 ori或P15A ori(Sambrook等人，《Molecular Cloning，A Laboratory Manual》(分子克隆，實驗室指南)，第2版，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約，1989)。
d)由農桿菌介導的植物轉化所需要的元件，諸如T-DNA的左邊界或右邊界、或vir區。
為了選擇成功經歷同源重組的細胞或成功轉化的細胞，通常還需要導入可以賦予成功經歷重組的細胞抗殺生物劑(例如除草劑)、代謝抑制劑諸如2-脫氧葡萄糖-6-磷酸(WO 98/45456)或抗生素抗性的選擇標記。選擇標記容許從未轉化細胞中選出轉化細胞(McCormick等人，1986，PlantCell Report，581-84)。
另外，所述重組表達盒或載體可以包含不編碼酵母G3PDH但其重組表達可以導致脂肪酸生物合成進一步增強(作為proOIL的后果)的其它核酸序列。作為非限制實例，可以由編碼乙酰-CoA羧化酶(ACC酶)、甘油-3-磷酸酰基轉移酶(GPAT)、溶血磷脂酸酰基轉移酶(LPAT)、二酰甘油酰基轉移酶(DAGAT)和磷脂二酰甘油酰基轉移酶(PDAT)的核酸中選擇額外重組表達的此proOIL核酸序列。這些序列對于熟練技術人員而言是已知的，而且易于由數據庫或相應植物的合適cDNA文庫獲得。
通過使用其中存在重組表達盒的載體，可以有利的將依照本發明的表達盒導入生物體或其細胞、組織、器官、部分或種子(優選導入植物或植物細胞、組織、器官、部分或種子)。本發明因此還涉及包含酵母G3PDH的重組表達盒的所述重組載體。
例如，載體可以是質粒、粘粒、噬菌體、病毒或農桿菌。可以通過合適的限制性切割位點將表達盒導入載體(優選質粒載體)。首先將由此生成的載體導入大腸桿菌。使用熟練技術人員知道的方法選擇正確轉化的大腸桿菌，培養，并獲得重組載體。限制性分析和測序可用于確認克隆步驟。優選載體是可以將表達盒穩定整合到宿主基因組中的那些載體。
本發明還涉及包含上文定義的酵母G3PDH、酵母G3PDH的轉基因表達盒或含有這種表達盒的轉基因載體的轉基因植物生物體或其組織、器官、部分、細胞或繁殖材料。
這種轉基因植物生物體可以例如通過轉化或轉染的手段使用相應蛋白質或核酸生成。轉化生物體(或轉化細胞或組織)的生成需要將所涉及的DNA(例如表達載體)、RNA或蛋白質導入所涉及的宿主細胞。稱為轉化(或轉導或轉染)的過程可以使用多種方法實現(Keown等人，1990，Methods in Enzymology，185527-537)。由此，可以例如通過顯微注射或用DNA包被的微粒進行轟擊直接導入DNA或RNA。還可以通過化學手段透化處理細胞，例如使用聚乙二醇，從而使得DNA可以通過擴散進入細胞。還可以通過原生質體與其它含DNA的單元諸如微細胞、細胞、溶酶體或脂質體的融合來進行DNA導入。電穿孔是另一種用于導入DNA的合適方法；在這里，通過電脈沖使細胞被可逆透化。將植物部分浸泡在DNA溶液中、以及花粉或花粉管轉化也是可以的。這些方法已有描述(例如Bilang等人，1991，Gene，100247-250；Scheid等人，1991，Mol Gen Genet，228104-112；Guerche等人，1987，Plant Science，52111-116；Neuhause等人，1987，Theor Appl Genet，7530-36；Klein等人，1987，Nature，32770-73；Howell等人，1980，Science，2081265；Horsch等人，1985，Science，2271229-1231；DeBlock等人，1989，Plant Physiology，91694-701；《Methods for Plant Molecular Biology》(用于植物分子生物學的方法)，Weissbach和Weissbach編，Academic出版公司，1988；和《Methods in Plant Molecular Biology》(植物分子生物學中的方法)，Schuler和Zielinski編，Academic出版公司，1989)。
在植物中，對于瞬時或穩定轉化，可以利用已經描述的用于轉化和由植物組織或植物細胞再生植株的方法。具體而言，合適的方法有通過由聚乙二醇誘導的DNA攝取實施的原生質體轉化、使用基因槍的生物轟擊(biolistic)方法、稱為微粒轟擊的方法、電穿孔、將干胚胎在含DNA的溶液中孵育、和顯微注射。
除了這些“直接”轉化技術以外，還可以通過細菌感染(利用根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)或發根農桿菌(Agrobacteriumrhizogenes)轉移相應重組Ti質粒或Ri質粒)或轉基因植物病毒感染來實現轉化。由農桿菌介導的轉化最適合于雙子葉植物的細胞。這些方法描述于例如Horsch RB等人，1985，Science，2251229f。
在使用農桿菌時，將表達盒整合到特殊質粒，或是穿梭載體或是二元載體中。若轉化將使用Ti或Ri質粒，則至少將Ti或Ri質粒T-DNA的右邊界，但是在大多數情況中是右邊界和左邊界，連接到待導入的表達盒作為側翼區。
優選使用二元載體。二元載體在大腸桿菌和農桿菌中都能復制。通常，它們包含選擇標記基因和接頭或多接頭，側翼是T-DNA右和左邊界序列。可以將它們直接轉化到農桿菌中(Holsters等人，1978，Mol Gen Genet，163181-187)。選擇標記基因，例如賦予卡那霉素抗性的nptII基因，使得可以選擇經轉化的農桿菌。在這種情況中擔當宿主生物體的農桿菌應當已經包含具有vir區的質粒。后者是將T-DNA轉移到植物細胞中所需要的。以這種方式轉化的農桿菌可用于轉化植物細胞。已經深入研究并描述了T-DNA用于轉化植物細胞的用途(EP 120 516；Hoekema，《The BinaryPlant Vector System》(二元植物載體系統)，Offsetdrukkerij KantersB.V.、Alblasserdam，第五章；An等人，1985，EMBO J，4277-287)。已知多種二元載體，其中一些是商品化的，諸如pBI101.2或pBIN19(Clontech Laboratories公司，美國)。
已經描述了適于在植物中表達的其它啟動子(Rogers等人，1987，Methin Enzymol，153253-277；Schardl等人，1987，Gene，611-11；Berge等人，1989，Proc Natl Acad Sci USA，868402-8406)。
直接轉化技術適用于任何生物體和細胞類型。在將DNA或RNA注射或電穿孔到植物細胞中的情況下，所用質粒不必達到任何特定要求。可以使用簡單的質粒，諸如pUC系列的質粒。若要由轉化細胞再生完整植株，則質粒上必需存在額外選擇標記基因。
當選擇標記是插入DNA的一部分時，可以由未轉化細胞選擇穩定轉化的細胞，即插入DNA被整合到宿主細胞DNA中的那些細胞。例如，能夠賦予抗生素或除草劑(諸如卡那霉素、G418、博來霉素、潮霉素或膦絲菌素等等)抗性的任何基因均能夠擔當標記(見上文)。表達這種標記基因的轉化細胞能夠在存在殺傷未轉化野生型的一定濃度的這種抗生素或除草劑時存活。上文提及了實例，而且優選包括賦予除草劑膦絲菌素抗性的bar基因(Rathore KS等人，1993，Plant Mol Biol，21(5)871-884)、賦予卡那霉素抗性的nptII基因、賦予潮霉素抗性的hpt基因、或賦予除草劑草甘膦抗性的EPSP基因。選擇標記容許由未轉化細胞選擇轉化細胞(McCormick等人，1986，Plant Cell Reports，581-84)。獲得的植物能夠以常規方式進行繁殖和雜交。應當培養兩代或多代以確保基因組整合是穩定的且遺傳的。
上述方法描述于例如Jenes B等人，1993，Techniques for GeneTransfer(用于基因轉移的技術)，《Transgenic Plant》(轉基因植物)，第1卷，Engineering and Utilization(工程和利用)，SD Kung和R Wu編，Academic出版社，第128-132頁；和Potrykus，1991，Annu Rev PlantPhysiol Plant Molec Biol，42205-225。優選將待表達的構建體克隆到適于轉化根癌農桿菌的載體中，例如pBin19(Bevan等人，1984，Nucl AcidsRes，128711f)。
一旦生成了轉化植物細胞，就能夠使用熟練技術人員知道的方法獲得完整植株。例如，將愈傷組織培養物用作起始材料。可以以已知方式由未分化細胞生物塊誘導芽和根的發育。可以將獲得的幼苗移植戶外并用于育種。
熟練技術人員熟悉用于由植物細胞再生植物部分和完整植株的這些方法。可用于此目的的方法描述于例如Fennell等人，1992，Plant Cell Rep，11567-570；Stoeger等人，1995，Plant Cell Rep，14273-278；Jahne等人，1994，Theor Appl Genet，89525-533。
“轉基因”，例如在酵母G3PDH的情況中，指包含所述G3PDH核酸序列的核酸序列、表達盒或載體或者用所述核酸序列、表達盒或載體轉化的生物體，所有這些構建體都是通過重組方法建立的，其中a)編碼酵母G3PDH的核酸序列或b)可操作連接a)中所述核酸序列的遺傳控制序列，例如在植物生物體中發揮功能的啟動子，或c)a)和b)并非處于它們的天然遺傳環境中或者已經通過重組方法被修飾，修飾有可能是例如一個或多個核苷酸殘基的替代、添加、刪除、倒位或插入。天然遺傳環境指來源生物體中的天然染色體座位或指存在于基因組文庫中。在基因組文庫的情況中，優選至少在一定程度上保持核酸序列的天然遺傳環境。至少核酸序列的一側是天然環境，其長度至少50bp，優選至少500bp，特別優選至少1000bp，極其特別優選至少5000bp。天然表達盒，例如編碼酵母G3PDH的基因的啟動子與相應酵母G3PDH基因的天然聯合當后者通過非天然的合成(“人工”)方法諸如誘變經過修飾后將成為轉基因表達盒。這些方法描述于US 5,565,350；WO 00/15815；還可見上文。
首先，優選作為轉基因生物體的宿主或起始生物體是依照上文定義的植物。出于本發明的目的，包括植物界的所有高等和低等植物屬和種，特別是用于獲得油的植物，諸如油籽油菜、向日葵、芝麻、紅花、橄欖樹、大豆、玉米、小麥和堅果物種。另外還包括成熟植株、種子、枝條和幼苗，以及由其衍生的部分、繁殖材料和培養物，例如細胞培養物。成熟植株指處于幼苗階段以后的任何期望的發育階段的植株。幼苗指處于早期發育階段的幼小未成熟植株。
可以使用用于生物體轉化或轉染的上述方法生成轉基因生物體。
本發明還涉及依照本發明的轉基因生物體以及由其衍生的細胞、細胞培養物、部分-諸如在轉基因植物生物體的情況下根、葉等-和轉基因繁殖材料諸如種子或果實用于生產食品或飼料、藥物或精細化學藥品，特別是油、脂肪、脂肪酸或其衍生物的用途。
除了影響含油量，酵母G3PDH在植物中的轉基因表達還可以介導其它有利效果，諸如增強對例如滲透壓等協迫的抵抗力。通過提高甘油水平，酵母G3PDH賦予針對這種協迫的保護作用，其中甘油擔當滲透壓保護性物質(osmoprotective substance)。這種滲透壓協迫發生于例如鹽漬土和鹽水中，而且日益成為農業問題。提高協迫耐受力使得可能例如使用常規耕種植物不能茁壯成長的地區用于農業用途。
另外，酵母G3PDH的重組表達能夠影響植物生物體中的NADH水平繼而影響氧化還原平衡。諸如干旱、高溫或低溫、紫外線等協迫可以導致NADH水平升高，以及反應性氧(RO)形成增加。酵母G3PDH的轉基因表達能夠分解在所述協迫條件下積累的過多NADH，從而穩定氧化還原平衡并減輕協迫的影響。
序列簡述1.SEQ ID NO1編碼釀酒酵母G3PDH(Gpd1p)的核酸序列2.SEQ ID NO2編碼釀酒酵母G3PDH(Gpd1p)的蛋白質序列3.SEQ ID NO3編碼釀酒酵母G3PDH(Gpd2p)的核酸序列4.SEQ ID NO4編碼釀酒酵母G3PDH(Gpd2p)的蛋白質序列5.SEQ ID NO5編碼釀酒酵母G3PDH(Gpd2p)且具有第二個可選擇起始密碼子的蛋白質序列6.SEQ ID NO6編碼粟酒裂殖酵母G3PDH的核酸序列7.SEQ ID NO7編碼粟酒裂殖酵母G3PDH的蛋白質序列8.SEO ID NO8
編碼粟酒裂殖酵母G3PDH的核酸序列9.SEQ ID NO9編碼粟酒裂殖酵母G3PDH的蛋白質序列10.SEQ ID NO10編碼Yarrowinia lipolytica G3PDH的核酸序列11.SEQ ID NO11編碼Yarrowinia lipolytica G3PDH的蛋白質序列12.SEQ ID NO12編碼Yarrowinia lipolytica G3PDH且具有第二個可選擇密碼子的蛋白質序列13.SEQ ID NO13編碼Zygosaccharomyces rouxii G3PDH的核酸序列14.SEQ ID NO14編碼Zygosaccharomyces rouxii G3PDH的蛋白質序列15.SEQ ID NO15編碼Zygosaccharomyces rouxii G3PDH的核酸序列16.SEQ ID NO16編碼Zygosaccharomyces rouxii G3PDH的蛋白質序列17.SEQ ID NO17用于釀酒酵母G3PDH的基于pSUN-USP的表達載體(Gpd1p；1017-2190bp插入片段)18.SEQ ID NO18寡核苷酸引物ONP15′-ACTAGTATGTCTGCTGCTGCTGATAG-3′19.SEQ ID NO19寡核苷酸引物ONP25′-CTCGAGATCTTCATGTAGATCTAATT-3′20.SEQ ID NO20寡核苷酸引物ONP35′-GCGGCCGCCATGTCTGCTGCTGCTGATAG-3′21.SEQ ID NO21寡核苷酸引物ONP4
5′-GCGGCCGCATCTTCATGTAGATCTAATT-3′22-35.SEQ ID NO22至35酵母G3PDH的序列基序；指出了可能的序列變異。用基序的變異可以在每種情況中單獨存在，但是也可以以不同的相互組合形式存在。
36.SEQ ID NO36用于釀酒酵母G3PDH的基于pGPTV-napin的表達載體pGPTV-gpd1(Gpd1p；gdp1插入片段第11962-13137bp位；nos終止子13154-13408；napin啟動子10807-11951)。
37.SEQ ID NO37編碼Emericella nidulans G3PDH的核酸序列38.SEQ ID NO38編碼Emericella nidulans G3PDH的氨基酸序列39.SEQ ID NO39編碼漢遜德巴利酵母G3PDH的核酸序列(部分)40.SEQ ID NO40編碼漢遜德巴利酵母G3PDH的氨基酸序列(部分)附圖簡述圖1轉基因GPD1p株系的含油量測量包含釀酒酵母Gpd1p基因的轉基因擬南芥株系(G2至G30)T2種子中的TAG含量。測定了相應未轉化植株(野生型植株；W1至W10)中的含量用于進行比較。鑒定了含油量顯著提高的8個擬南芥株系。所述偏差在每個情況中為3次獨立測量的結果。
圖2T3代種子含油量的測定所示數據是各擬南芥株系的含油量(mg脂質/g干物質(DM))。每個柱代表每個獨立株系的6株植株的平均值。每株植株平行分析三次。誤差條指示所有數值的標準差。對照植株以“col”標識。下表還顯示了各個數據的數值(將對照設置成100％含油量)

脂質含量在統計學上顯著提高的株系以黑柱表示(#11、#21、#41和#67株系)。
圖3對照(“col”)和gdp1轉化植株中G3PDH活性的測定如實施例8中所述測定了各株系的G3PDH活性，并以nmol G3P/分/g鮮重(FW)表示。

G3PDH活性在統計學上顯著提高的株系以黑柱表示(#11、#21、#41和#67株系)。可以看到G3PDH活性提高與脂質含量提高相關。
實施例一般方法除非另外說明，所有化學制劑均來自Fluka(Buchs)、Merck(Darmstadt)、Roth(Karlsruhe)、Serva(Heidelberg)和Sigma(Deisenhofen)公司。限制酶、DNA修飾酶和分子生物學試劑盒來自Amersham-Pharmacia(Freiburg)、Biometra(Gttingen)、Roche(Mannheim)、New England Biolabs(Schwalbach)、Novagen(麥迪遜，威斯康星州，美國)、Perkin-Elmer(Weiterstadt)、Qiagen(Hilden)、Stratagen(阿姆斯特丹，荷蘭)、Invitrogen(Karlsruhe)和Ambion(劍橋郡，英國)公司。依照制造商的說明書使用所用試劑。
例如，可以以已知方式使用亞磷酰胺法化學合成寡核苷酸(Voet，Voet，第二版，紐約，Wiley出版社，第896-897)。出于本發明的目的而進行的克隆步驟，如限制性酶切、瓊脂糖凝膠電泳、DNA片段的純化、將核酸轉移至硝酸纖維素和尼龍膜、DNA片段的連接、大腸桿菌細胞的轉化、細菌培養、噬菌體的增殖和重組DNA的序列分析，如文獻所述進行Sambrook等人，1989，冷泉港實驗室出版社，ISBN0-87969-309-6。重組DNA分子使用ABI激光熒光DNA測序儀遵循Sanger法進行測序(Sanger等人，1977，Proc Natl Acad Sci USA，745463-5467)。
實施例1一般方法植物擬南芥屬于高等植物(有花植物)。此植物不但與諸如油菜等十字花科的其它植物物種密切相關，而且與雙子葉植物的其它科密切相關。由于其DNA序列或多肽序列的高度同源性，擬南芥可以用作其它植物物種的模式植物。
a)擬南芥植物的培養將植物在補充0.5％蔗糖的Murashige-Skoog培養基(Ogas等人，1997，Science，27791-94)或土壤(Focks和Benning，1998，Plant Physiol，11891-101)中進行培養。為了實現統一的發芽和開花時間，首先將種子放置在培養基上或散播在土壤上，然后于4℃層積保藏兩天。開花后標記莢果。然后依照這些標記收獲開花后6-20天的莢果。
實施例2酵母Gpd1基因的克隆遵循下文描述的方法由釀酒酵母菌株S288C(MatαSUC2 mal melgal2 CUP1 flol flo8-1；Invitrogen，卡爾斯魯厄，德國)分離基因組DNA將100ml培養物于30℃培養至光密度達到1.0。取60ml培養物以3000g離心3分鐘。將沉淀重懸于6ml重蒸水，將懸浮液分裝于1.5ml小管，并離心棄上清。將沉淀渦旋震蕩重懸于200μl溶液A、200μl酚/氯仿(1∶1)和0.3g玻璃珠中，然后進行裂解。在添加200μl pH8.0 TE緩沖液后，將裂解物離心5分鐘。向上清液中加入1ml乙醇進行乙醇沉淀。沉淀后，將產生的沉淀溶于添加30μg/ml RNase A的400μl pH8.0 TE緩沖液中。于37℃保溫5分鐘后，加入18μl pH4.8的3M乙酸鈉溶液和1ml乙醇，然后離心收集沉淀的DNA。將DNA沉淀溶于25μl重蒸水中。通過其在260nm處的吸收值確定基因組DNA的濃度。
溶液A2％ Triton-X1001％ SDS0.1MNaCl0.01M Tris-HCl pH 8.00.001M EDTA為了克隆Gpd1基因，將分離得到的酵母DNA和寡核苷酸引物ONP1和ONP2用于PCR反應。
ONP15’-ACTAGTATGTCTGCTGCTGCTGATAG-3’(SEQ ID NO18)
ONP25’-CTCGAGATCTTCATGTAGATCTAATT-3’(SEQ ID NO19)PCR反應液(50μl)的組成如下5.00μl 5μg基因組酵母DNA5.00μl 10X緩沖液(Advantage聚合酶)+25mM MgCl25.00μl 2mM dNTP1.25μl 各引物(10pmol/μL)0.50μl Advantage聚合酶所用Advantage聚合酶來自Clontech公司。
PCR程序95℃預變性2分鐘，然后進行35個循環95℃45秒，55℃45秒和72℃2分鐘。最后72℃延伸5分鐘。
遵循制造商的說明書將PCR產物克隆到載體Pcr2.1-TOPO(Invitrogen)中，得到載體Pcr2.1-gpd1，然后測序證實其序列。
克隆到agro轉化載體Pgptv中包括將0.5μg載體Pcr2.1-gpd1與限制酶XhoI(New England Biolabs)保溫2小時，隨后與Klenow片段(New EnglandBiolabs)保溫15分鐘。與SpeI保溫2小時后，通過凝膠電泳分離DNA片段。從凝膠中切下與載體(3.9kb)毗連的gpd1序列區段1185bp，用Qiagen的“凝膠純化”試劑盒遵循制造商的說明書進行純化，用50μl洗脫緩沖液洗脫。將0.1μg載體Pgptv首先用限制性酶SacI消化1小時，然后與Klenow片段(New England Biolabs)保溫15分鐘。將10μl gpd1片段洗脫液與10ng處理過的Pgptv載體于16℃連接過夜(T4連接酶，New England Biolabs)。然后遵循制造商的說明書將連接產物轉化到TOP10細胞(Stratagene)中并進行恰當的選擇，得到載體Pgptv-gpd1。測序并使用引物ONP1和ONP2進行PCR以驗證陽性克隆。
為了產生載體Psun-USP-gpd1，使用引物ONP3和ONP4對載體Pcr2.1-gpd1進行PCR。
ONP35′-GCGGCCGCCATGTCTGCTGCTGCTGATAG-3′(SEQ ID NO20)ONP45′-GCGGCCGCATCTTCATGTAGATCTAATT-3′(SEQ ID NO21)
PCR反應液(50μl)的組成如下5μgpCR2.1-gpd1質粒DNA5.00μl 10X緩沖液(Advantage聚合酶)+25mM MgCl25.00μl 2mM dNTP1.25μl 各種引物(10pmol/μL)0.50μl Advantage聚合酶所用Advantage聚合酶來自Clontech公司。
PCR程序95℃預變性2分鐘，然后進行35個循環95℃45秒，55℃45秒和72℃2分鐘。最后72℃延伸5分鐘。
用限制酶NotI消化1190bp的PCR產物24小時。將載體pSUN-USP用NotI消化2小時，然后與堿性磷酸酶(New England Biolabs)一起保溫15分鐘。將100ng已預處理的gpd1片段和10ng已處理的pGPTV于16℃連接過夜(來自New England Biolabs的T4連接酶)。然后遵循制造商的說明書將連接產物轉化到TOP10細胞(Stratagene)并進行恰當的選擇，得到載體pSUN-usp-gpd1。測序并使用引物ONP3和ONP4進行PCR以驗證陽性克隆。
實施例3用于植物轉化的質粒諸如pBinAR等二元載體可用于植物的轉化(Hfgen和Willmitzer，1990，Plant Science，66221-230)。可以通過以有義和反義方向將cDNA連接到T-DNA中來構建二元載體。位于cDNA 5′端的植物啟動子激活cDNA的轉錄。多聚腺苷酸化序列位于cDNA的3′端。
用組織特異性啟動子獲得組織特異性表達。例如，可以通過將napin或LeB4-或USP啟動子克隆到cDNA的5′端來獲得種子特異性表達。也可以使用任何其它種子特異性啟動子元件。CaMV 35S啟動子可用于在整株植株中的組成型表達。
其它二元載體實例是載體pSUN-USP和pGPTV-napin，其中克隆了實施例2的片段。載體pSUN-USP包含USP啟動子和OCS終止子。載體pGPTV-napin包含截短形式的napin啟動子和nos終止子。
將實施例2的片段分別克隆到載體pSUN-USP和pGPTV-napin的多克隆位點中，使gdp1基因的種子特異性表達成為可能。相應的構建體pSUN-USP-gpd1用SEQ ID NO17描述，而pGPTV-napin(pGPTV-gpd1)中的G3PDH構建體則用SEQ ID NO36描述。
實施例4農桿菌的轉化由農桿菌介導的植物轉化可以使用例如根癌農桿菌菌株GV3101(pMP90)(Koncz和Schell，1986，Mol Gen Genet，204383-396)或LBA4404(Clontech)來進行。轉化可以使用標準轉化技術(Deblaere等人，1984，Nucl Acids Res，134777-4788)。
實施例5植物的轉化可以使用標準的轉化和再生技術來實現由農桿菌介導的植物轉化(Gelvin SB、Schilperoort R，《Plant Molecular Biology Manual》(植物分子生物學指南)，第2版，多德雷赫特，Kluwer學術出版社，1995，in Sect.，Ringbuch Zentrale SignaturBT11-P ISBN 0-7923-2731-4；Glick BR、Thompson JE，《Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology》(植物分子生物學和生物技術中的方法)，伯克萊屯，CRC出版社，1993，第360頁，ISBN 0-8493-5164-2)。
使用Bechthold等人，1993，C.R.Acad Sci Ser III Sci Vie，3161194-1199的方法通過農桿菌進行了擬南芥轉化。
例如，可以通過子葉或下胚軸轉化法轉化油籽油菜(Moloney等人，1989，Plant Cell Report，8238-242；De Block等人，1989，Plant Physiol，91694-701)。使用抗生素選擇農桿菌和植物取決于轉化所用的二元載體和農桿菌菌株。油籽油菜的選擇通常使用卡那霉素作為植物選擇標記來進行。
可以使用例如Mlynarova等人，1994，Plant Cell Report，13282-285中描述的技術由農桿菌介導將基因轉移到亞麻籽(Linumusitatissimum)中。可以使用例如EP-A-0 0424 047(Pioneer Hi-BredInternational)或EP-A-0 0397 687、US 5,376,543、US 5,169,770(Toledo大學)中描述的方法轉化大豆。
使用粒子轟擊、由聚乙二醇介導的DNA攝取或通過碳酸硅纖維技術進行的植物轉化描述于例如Freeling和Walbot，《The Maize Handbook》(玉米手冊)，1993，ISBN 3-540-97826-7，Springer Verlag，紐約。
實施例6研究經轉化生物體中的重組基因產物的表達在轉錄和/或翻譯水平檢測經轉化宿主生物體中的重組基因產物的活性。
測定基因轉錄水平(指示可用于翻譯成基因產物的RNA量)的合適方法是如下文所述進行的RNA印跡(參閱Ausubel等人，1988，CurrentProtocols in Molecular Biology(分子生物學通用方案)，Wiley，紐約，或上文實施例部分)，其中用可檢測的標記物(通常是放射性標記或化學發光標記)標記為結合目的基因而設計的引物，以便于當生物體培養物的總RNA被提取、在凝膠上分離、轉移至穩定的基質并與此探針保溫時，探針的結合和結合程度可以顯示此基因mRNA的存在和量。此信息表明了轉化基因的轉錄程度。可以使用多種方法由細胞、組織或器官制備細胞總RNA，所有這些方法都是本領域已知的，例如Bormann，E.R.等人，1992，Mol Microbiol，6317-326的方法。
Northern雜交為了進行RNA雜交，遵循Amasino，1986，Anal Biochem，152304描述的方法，在添加甲醛的1.25％瓊脂糖凝膠中通過凝膠電泳分離20μg總RNA或1μg poly(A)+RNA，通過毛細引力使用10xSSC將RNA轉移至帶正電荷的尼龍膜(Hybond N+，Amersham，Brunswick)上，通過紫外光固定，并用雜交緩沖液(10％硫酸葡聚糖w/v，1M NaCl，1％SDS，100mg鯡魚精子DNA)于68℃預雜交3小時。在預雜交過程中利用Highprime DNA標記試劑盒(Roche，曼海姆，德國)用α-32P-dCTP(Amersham Pharmacia，不倫瑞克，德國)標記DNA探針。添加標記好的DNA探針后在同一緩沖液中于68℃雜交過夜。于68℃用2xSSC洗兩次15分鐘，再用1xSSC、1％SDS洗兩次30分鐘。將密封好的濾膜于-70℃曝光1-14天。
為了研究由此mRNA翻譯的蛋白質的存在及其相對量，可以使用諸如Western印跡等標準方法(參閱，例如，Ausubel等人，1988，Current Protocolin Molecular Biology(分子生物學通用方案)，Wiley，紐約)。在此方法中，提取并通過凝膠電泳的手段分離細胞總蛋白，將之轉移至諸如硝酸纖維素的基質上并與諸如抗體等與期望蛋白質特異結合的探針一起保溫。此探針通常攜帶便于檢測的化學發光或比色標記。所觀察到的標記的存在和量表明了細胞中出現的期望突變蛋白質的存在和量。
實施例7分析重組蛋白對期望產物生產的影響可以通過在合適的條件(如上所述)下培養已修飾的微生物或已修飾的植物并檢測培養基和/或細胞組分中是否有增加的期望產物(即脂質或脂肪酸)產量，從而確定遺傳修飾在植物、真菌、藻類、纖毛蟲中的作用或對期望化合物(如脂肪酸)產生的影響。這些分析技術是熟練技術人員已知的，包括分光光度法、薄層層析、各種染色方法、酶學和微生物學方法以及高效液相色譜等分析性色譜法(參閱，例如，Ullmann，Encyclopediaof Industrial Chemistry(Ullmann氏工業化學百科全書)，卷A2，第89-90頁和第443-613頁，VCH，Weinheim，1985；Fallon A等人，1987，Applications of HPLC in Biochemistry(HPLC在生化中的應用)，《Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology》(生化和分子生物學實驗室技術)，第17卷；Rehm等人，1993，Biotechnology(生物技術)，第3卷，第3章，“產物回收及純化”，第469-714頁，VCH，Weinheim；Belter PA等人，1988，Bioseparationsdownstream processingfor Biotechnology(生物分離生物技術中的下游加工)，John Wiley & Sons；Kennedy JF和Cabral JMS，1992，Recovery processes for biologicalMaterials(生物學材料的回收方法)，John Wiley & Sons；Shaeiwitz JA和Henry JD，1988，Biochemical Separations(生化分離)，《Ullmann′sEncyclopedia of Industrial Chemistry》(Ullmann氏工業化學百科全書)，卷B3，第11章，第1-27頁，VCH，Weinheim；和Dechow，F.J.，1989，生物技術中的分離和純化技術，Noyes出版社)。
除了上述方法以外，還可以如Cahoon等人，1999，Proc Natl Acad SciUSA，96(22)12935-12940，和Browse等人，1986，Analytic Biochemistry，152141-145所述由植物材料提取植物脂質。脂質或脂肪酸的定性和定量分析描述于如下文獻中Christie，William W，Advances in LipidMethodology(脂質方法學進展)，埃爾/蘇格蘭，Oily出版社(Oily PressLipid Libary；2)；Christie，William W.，Gas Chromatography and Lipids.A Practical Guide(氣相色譜和脂質，應用指南)，埃爾/蘇格蘭，Oily出版社，1989，Repr.1992，IX，第307頁(Oily Press Lipid Library；1)；Progress in Lipid Research(脂質研究中的進展)，牛津，Pergamon出版社，1(1952)-16(1977)，題為脂肪和其它脂質化學的進展，CODEN。
為了確定化合物生產的總體功效，除了檢測發酵終產物外，還可以分析用于產生期望化合物的代謝途徑的其它組分，諸如中間產物和次級產物。分析方法包括培養基中營養物量的檢測(例如糖、碳水化合物、氮源、磷酸鹽和其它離子)、生物質組成的測定和生長狀況的檢測、生物合成途徑常規代謝物產量的分析和發酵過程中產生的氣體的測定。用于這些檢測的標準方法參見Applied Microbial Physiology；A Practical Approach，P.M.Rhodes和P.F.Stanbury編，IRL出版社，第103-129頁、131-163頁和165-192頁(ISBN0199635773)及其中引用的參考文獻。
其中的一個實例是脂肪酸分析(縮寫FAME，脂肪酸甲酯；GC-MS，氣-液色譜/質譜；TAG，三酰基甘油；TLC，薄層層析)。
存在脂肪酸產物的明確證據可以通過Christie及其引用的參考文獻中描述的標準分析方法，即GC、GC-MS或TLC對重組生物體的分析來獲得(1997，Advances on Lipid Methodology(脂質方法學上的進展)，第4版，Christie，Oily出版社，敦提，119-169；1998，氣相色譜/質譜方法，Lipide，33343-353)。
可以通過超聲波、玻璃研磨器中碾磨、液氮和碾磨或其它可用方法破碎待分析材料。破碎后，必須將材料離心。將沉淀物重懸于蒸餾水，于100℃加熱10分鐘，冰上冷卻并再次離心，然后在含0.5M硫酸的甲醇中用2％二甲氧基丙烷于90℃萃取1小時，從而得到水解的油和轉甲基化脂質形式的脂質化合物。在石油醚中萃取這些脂肪酸甲酯，最后用毛細管柱(Chrompack，WCOT Fused Silica，CP-Wax-52 CB，25mm，0.32mm)于170℃-240℃溫度梯度進行GC分析20分鐘，于240℃進行GC分析5分鐘。必須使用可購買獲得的(即Sigma)標準品鑒定獲得的脂肪酸甲酯的身份。
以下方案被用于對經Gpd1基因轉化的擬南芥植物進行定量油分析使用Bligh和Dyer，1959，Can J Biochem Physiol，37911中的方法由種子提取脂質。為此目的，使用Sartoriius(Gottingen)微量天平稱取5mg擬南芥種子，置于1.2ml Qiagen微量離心管(Qiagen，Hilden)中。在Retsch(Haan)的MM300 Retsch研缽中將種子材料與500μl氯仿/甲醇(2∶1；含Sigma的單-C17-甘油作為內部標準)一起勻漿并于室溫放置20分鐘。添加500μl pH7.5 50mM磷酸鉀后分離各相。由有機相中取出50μl，用1500μl氯仿稀釋，將5μl加到Iatroscan的Chromarods SIII毛細管(SKS，Bechenheim)中。添加樣品后，首先在用6∶2∶2氯仿∶甲醇∶甲苯飽和的薄層室中分離15分鐘。然后，將毛細管于室溫干燥4分鐘，然后在用7∶3正己烷∶二乙酯飽和的薄層室中放置22分鐘。于室溫進一步干燥4分鐘后，使用Fraser和Taggart，1988，J Chromatogr，439404中的方法在IatroscanMK-5(SKS，Bechenheim)中分析樣品。為此檢測設定以下參數限幅寬(slice width)50msec，閾值20mv，噪音30，濾噪比(skim ratio)0。利用ChromStar軟件(SKS，Beichenheim)，參照內部標準品單-C17-甘油(Sigma)和通過三-C17-甘油(Sigma)建立的校準曲線量化這些數據。
分析含構建體pSUN-USP-gpd1或pGPTV-gpd1的數個獨立轉基因株系的T2種子以定量測定含油量。用每株系的種子庫進行三次獨立的提取，分別檢測提取物。三次獨立的檢測值用于計算平均值和標準差。
對含構建體pGPTV-gpd1的株系進行檢測的結果顯示，與10株野生型植株的測定值相比，在數個(10)轉基因株系中含油量顯著提高(圖1)。對于構建體pSUN-USP-gpd1也檢測到了相似的含油量(未顯示)。
上述株系的平均含油量為34.86±1.56％，而野生型植株的平均值為27.75±2.64％。這相當于含油量有了7.1％的絕對提高(相對值25.6％)。
為了證實gpd1效應(含油量提高)的遺傳性，種植來自含油量提高的株系的種子和來自含油量未改變的株系的種子。在各個情況下，每個株系種植6株植物，分析種子的含油量和酶活性。用上述方法學測定含油量。所獲數據顯示于圖2中。Col-0和C24擬南芥生態型用作對照。C24是一種以含油量較Col-0高為區別特征稱的生態型。這可以表征含油量超過Col-0的株系。由此證明了作為gpd1基因表達結果的含油量提高的遺傳性。
實施例8甘油-3-磷酸脫氫酶活性的測定另一個目的是證明酶在轉基因植物中引起的除了提高含油量以外的其它直接效應。為了測定甘油-3-磷酸脫氫酶活性，每株植物收獲兩個擬南芥種子莢果，用Geigenberger和Stitt的方法(1993，Planta，189329-339)進行提取。為此目的，將莢果在液氮下置于研缽中研磨，溶于200μl pH7.4的50mM HEPES、5mM MgCl2、1mM EDTA、1mM EGTA、5mM DTT、0.1％(w/w)牛血清白蛋白、2mM苯甲脒、2mM氨基-正己酸、0.5mM苯甲基磺酰、0.1％Triton X-100和10％(w/w)甘油，離心5分鐘，將上清液分裝成等分試樣。檢測從底物DHAP(磷酸二羥丙酮)和NADH產生的G3P(甘油-3-磷酸)產量以確定G3PDH活性。為此目的，在340nm波長處監測NADH的氧化。
用于活性測定的反應混合物包含pH7.450mM HEPES、4mM DHAP、0.2mM NADH和10μl提取混合物，終體積100μl。室溫放置30分鐘后，加熱終止反應(95℃20分鐘)。在對照反應中，通過加熱立即終止反應。
甘油-3-磷酸“循環測定法”將10μl反應混合物加入含200mMTricin、5mM MgCl2(pH8.5)的45μl溶液中，加熱(95℃20分鐘)破壞剩余的DHAP。將上清液轉移到96孔微量滴定板中，用含2個單位G3Pox、130個單位過氧化氫酶、0.4個單位G3PDH和0.12μmol NADH的混合液45μl進行處理。反應于30℃進行，并在Anthos htII微量滴定板讀數器中監測340nm處產生的吸收值。用Biolise軟件，基于吸收值(mOD*min-1)的下降計算反應速度(gibon Y等人，2002，Plant J，30(2)221-235)。
轉基因株系#11、#21、#41和#67中的酶活性明顯高于對照植株中的酶活性(圖3)。含油量提高的植物與酶活性提高的植物相關。因此證明了含油量的提高可歸因于DHAP轉變成G3P的增加，而G3P是油合成的前體。
序列表<110>巴斯福植物科學有限公司(BASF Plant Science GmbH)<120>用于提高植物含油量的方法<130>NAE 2166/2002<140>
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<160>40<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>1176<212>DNA<213>釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)<220>
<221>CDS<222>(1)..(1173)<223>編碼G3PDH<400>1atg tct gct gct gct gat aga tta aac tta act tcc ggc cac ttg aat48Met Ser Ala Ala Ala Asp Arg Leu Asn Leu Thr Ser Gly His Leu Asn1 5 10 15gct ggt aga aag aga agt tcc tct tct gtt tct ttg aag gct gcc gaa96Ala Gly Arg Lys Arg Ser Ser Ser Ser Val Ser Leu Lys Ala Ala Glu20 25 30aag cct ttc aag gtt act gtg att gga tct ggt aac tgg ggt act act144Lys Pro Phe Lys Val Thr Val Ile Gly Ser Gly Asn Trp Gly Thr Thr35 40 45att gcc aag gtg gtt gcc gaa aat tgt aag gga tac cca gaa gtt ttc192Ile Ala Lys Val Val Ala Glu Asn Cys Lys Gly Tyr Pro Glu Val Phe50 55 60gct cca ata gta caa atg tgg gtg ttc gaa gaa gag atc aat ggt gaa240Ala Pro Ile Val Gln Met Trp Val Phe Glu Glu Glu Ile Asn Gly Glu65 70 75 80aaa ttg act gaa atc ata aat act aga cat caa aac gtg aaa tac ttg288Lys Leu Thr Glu Ile Ile Asn Thr Arg His Gln Asn Val Lys Tyr Leu85 90 95cct ggc atc act cta ccc gac aat ttg gtt gct aat cca gac ttg att336Pro Gly Ile Thr Leu Pro Asp Asn Leu Val Ala Asn Pro Asp Leu Ile100 105 110
gat tca gtc aag gat gtc gac atc atc gtt ttc aac att cca cat caa384Asp Ser Val Lys Asp Val Asp Ile Ile Val Phe Asn Ile Pro His Gln115 120 125ttt ttg ccc cgt atc tgt agc caa ttg aaa ggt cat gtt gat tca cac432Phe Leu Pro Arq Ile Cys Ser Gln Leu Lys Gly His Val Asp Ser His130 135 140gtc aga gct atc tcc tgt cta aag ggt ttt gaa gtt ggt gct aaa ggt480Val Arg Ala Ile Ser Cys Leu Lys Gly Phe Glu Val Gly Ala Lys Gly145 150 155 160gtc caa ttg cta tcc tct tac atc act gag gaa cta ggt att caa tgt528Val Gln Leu Leu Ser Ser Tyr Ile Thr Glu Glu Leu Gly Ile Gln Cys165 170 175ggt gct cta tct ggt gct aac att gcc acc gaa gtc gct caa gaa cac576Gly Ala Leu Ser Gly Ala Asn Ile Ala Thr Glu Val Ala Gln Glu His180 185 190tgg tct gaa aca aca gtt gct tac cac att cca aag gat ttc aga ggc624Trp Ser Glu Thr Thr Val Ala Tyr His Ile Pro Lys Asp Phe Arg Gly195 200 205gag ggc aag gac gtc gac cat aag gtt cta aag gcc ttg ttc cac aga672Glu Gly Lys Asp Val Asp His Lys Val Leu Lys Ala Leu Phe His Arg210 215 220cct tac ttc cac gtt agt gtc atc gaa gat gtt gct ggt atc tcc atc720Pro Tyr Phe His Val Ser Val Ile Glu Asp Val Ala Gly Ile Ser Ile225 230 235 240tgt ggt gct ttg aag aac gtt gtt gcc tta ggt tgt ggt ttc gtc gaa768Cys Gly Ala Leu Lys Asn Val Val Ala Leu Gly Cys Gly Phe Val Glu245 250 255ggt cta ggc tgg ggt aac aac gct tct gct gcc atc caa aga gtc ggt816Gly Leu Gly Trp Gly Asn Asn Ala Ser Ala Ala Ile Gln Arg Val Gly260 265 270ttg ggt gag atc atc aga ttc ggt caa atg ttt ttc cca gaa tct aga864Leu Gly Glu Ile Ile Arg Phe Gly Gln Met Phe Phe Pro Glu Ser Arg275 280 285gaa gaa aca tac tac caa gag tct gct ggt gtt gct gat ttg atc acc912Glu Glu Thr Tyr Tyr Gln Glu Ser Ala Gly Val Ala Asp Leu Ile Thr290 295 300acc tgc gct ggt ggt aga aac gtc aag gtt gct agg cta atg gct act960Thr Cys Ala Gly Gly Arg Asn Val Lys Val Ala Arg Leu Met Ala Thr305 310 315 320tct ggt aag gac gcc tgg gaa tgt gaa aag gag ttg ttg aat ggc caa1008Ser Gly Lys Asp Ala Trp Glu Cys Glu Lys Glu Leu Leu Asn Gly Gln325 330 335tcc gct caa ggt tta att acc tgc aaa gaa gtt cac gaa tgg ttg gaa1056Ser Ala Gln Gly Leu Ile Thr Cys Lys Glu Val His Glu Trp Leu Glu340 345 350aca tgt ggc tct gtc gaa gac ttc cca tta ttt gaa gcc gta tac caa1104Thr Cys Gly Ser Val Glu Asp Phe Pro Leu Phe Glu Ala Val Tyr Gln
355 360 365atc gtt tac aac aac tac cca atg aag aac ctg ccg gac atg att gaa1152Ile Val Tyr Asn Asn Tyr Pro Met Lys Asn Leu Pro Asp Met Ile Glu370 375 380gaa tta gat cta cat gaa gat tag1176Glu Leu Asp Leu His Glu Asp385 390<210>2<211>391<212>PRT<213>釀酒酵母<400>2Met Ser Ala Ala Ala Asp Arg Leu Asn Leu Thr Ser Gly His Leu Asn1 5 10 15Ala Gly Arg Lys Arg Ser Ser Ser Ser Val Ser Leu Lys Ala Ala Glu20 25 30Lys Pro Phe Lys Val Thr Val Ile Gly Ser Gly Asn Trp Gly Thr Thr35 40 45Ile Ala Lys Val Val Ala Glu Asn Cys Lys Gly Tyr Pro Glu Val Phe50 55 60Ala Pro Ile Val Gln Met Trp Val Phe Glu Glu Glu Ile Asn Gly Glu65 70 75 80Lys Leu Thr Glu Ile Ile Asn Thr Arg His Gln Asn Val Lys Tyr Leu85 90 95Pro Gly Ile Thr Leu Pro Asp Asn Leu Val Ala Asn Pro Asp Leu Ile100 105 110Asp Ser Val Lys Asp Val Asp Ile Ile Val Phe Asn Ile Pro His Gln115 120 125Phe Leu Pro Arg Ile Cys Ser Gln Leu Lys Gly His Val Asp Ser His130 135 140Val Arg Ala Ile Ser Cys Leu Lys Gly Phe Glu Val Gly Ala Lys Gly145 150 155 160Val Gln Leu Leu Ser Ser Tyr Ile Thr Glu Glu Leu Gly Ile Gln Cys165 170 175Gly Ala Leu Ser Gly Ala Asn Ile Ala Thr Glu Val Ala Gln Glu His180 185 190Trp Ser Glu Thr Thr Val Ala Tyr His Ile Pro Lys Asp Phe Arg Gly195 200 205Glu Gly Lys Asp Val Asp His Lys Val Leu Lys Ala Leu Phe His Arg210 215 220Pro Tyr Phe His Val Ser Val Ile Glu Asp Val Ala Gly Ile Ser Ile225 230 235 240Cys Gly Ala Leu Lys Asn Val Val Ala Leu Gly Cys Gly Phe Val Glu245 250 255Gly Leu Gly Trp Gly Asn Asn Ala Ser Ala Ala Ile Gln Arg Val Gly
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<221>CDS<222>(1)..(1296)<223>編碼G3PDH<220>
<221>CDS<222>(145)..(1296)<223>編碼G3PDH(可選起始密碼子)<400>3atg ctt gct gtc aga aga tta aca aga tac aca ttc ctt aag cga acg 48Met Leu Ala Val Arg Arg Leu Thr Arg Tyr Thr Phe Leu Lys Arg Thr1 5 10 15cat ccg gtg tta tat act cgt cgt gca tat aaa att ttg cct tca aga 96His Pro Val Leu Tyr Thr Arg Arg Ala Tyr Lys Ile Leu Pro Ser Arg20 25 30tct act ttc cta aga aga tca tta tta caa aca caa ctg cac tca aag 144Ser Thr Phe Leu Arg Arg Ser Leu Leu Gln Thr Gln Leu His Ser Lys35 40 45atg act gct cat act aat atc aaa cag cac aaa cac tgt cat gag gac 192Met Thr Ala His Thr Asn Ile Lys Gln His Lys His Cys His Glu Asp50 55 60cat cct atc aga aga tcg gac tct gcc gtg tca att gta cat ttg aaa 240
His Pro Ile Arg Arg Ser Asp Ser Ala Val Ser Ile Val His Leu Lys65 70 75 80cgt gcg ccc ttc aag gtt aca gtg att ggt tct ggt aac tgg ggg acc288Arg Ala Pro Phe Lys Val Thr Val Ile Gly Ser Gly Asn Trp Gly Thr85 90 95acc atc gcc aaa gtc att gcg gaa aac aca gaa ttg cat tcc cat atc336Thr Ile Ala Lys Val Ile Ala Glu Asn Thr Glu Leu His Ser His Ile100 105 110ttc gag cca gag gtg aga atg tgg gtt ttt gat gaa aag atc ggc gac384Phe Glu Pro Glu Val Arg Met Trp Val Phe Asp Glu Lys Ile Gly Asp115 120 125gaa aat ctg acg gat atc ata aat aca aga cac cag aac gtt aaa tat432Glu Asn Leu Thr Asp Ile Ile Asn Thr Arg His Gln Asn Val Lys Tyr130 135 140cta ccc aat att gac ctg ccc cat aat cta gtg gcc gat cct gat ctt480Leu Pro Asn Ile Asp Leu Pro His Asn Leu Val Ala Asp Pro Asp Leu145 150 155 160tta cac tcc atc aag ggt gct gac atc ctt gtt ttc aac atc cct cat528Leu His Ser Ile Lys Gly Ala Asp Ile Leu Val Phe Asn Ile Pro His165 170 175caa ttt tta cca aac ata gtc aaa caa ttg caa ggc cac gtg gcc cct576Gln Phe Leu Pro Asn Ile Val Lys Gln Leu Gln Gly His Val Ala Pro180 185 190cat gta agg gcc atc tcg tgt cta aaa ggg ttc gag ttg ggc tcc aag624His Val Arg Ala Ile Ser Cys Leu Lys Gly Phe Glu Leu Gly Ser Lys195 200 205ggt gtg caa ttg cta tcc tcc tat gtt act gat gag tta gga atc caa672Gly Val Gln Leu Leu Ser Ser Tyr Val Thr Asp Glu Leu Gly Ile Gln210 215 220tgt ggc gca cta tct ggt gca aac ttg gca ccg gaa gtg gcc aag gag720Cys Gly Ala Leu Ser Gly Ala Asn Leu Ala Pro Glu Val Ala Lys Glu225 230 235 240cat tgg tcc gaa acc acc gtg gct tac caa cta cca aag gat tat caa768His Trp Ser Glu Thr Thr Val Ala Tyr Gln Leu Pro Lys Asp Tyr Gln245 250 255ggt gat ggc aag gat gta gat cat aag att ttg aaa ttg ctg ttc cac816Gly Asp Gly Lys Asp Val Asp His Lys Ile Leu Lys Leu Leu Phe His260 265 270aga cct tacttc cac gtc aat gtc atc gat gat gtt gct ggt ata tcc 864Arg Pro Tyr Phe His Val Asn Val Ile Asp Asp Val Ala Gly Ile Ser275 280 285att gcc ggt gcc ttg aag aac gtc gtg gca ctt gca tgt ggt ttc gta912Ile Ala Gly Ala Leu Lys Asn Val Val Ala Leu Ala Cys Gly Phe Val290 295 300gaa ggt atg gga tgg ggt aac aat gcc tcc gca gcc att caa agg ctg960Glu Gly Met Gly Trp Gly Asn Asn Ala Ser Ala Ala Ile Gln Arg Leu305 310 315 320
ggt tta ggt gaa att atc aag ttc ggt aga atg ttt ttc cca gaa tcc1008Gly Leu Gly Glu Ile Ile Lys Phe Gly Arg Met Phe Phe Pro Glu Ser325 330 335aaa gtc gag acc tac tat caa gaa tcc gct ggt gtt gca gat ctg atc1056Lys Val Glu Thr Tyr Tyr Gln Glu Ser Ala Gly Val Ala Asp Leu Ile340 345 350acc acc tgc tca ggc ggt aga aac gtc aag gtt gcc aca tac atg gcc1104Thr Thr Cys Ser Gly Gly Arg Asn Val Lys Val Ala Thr Tyr Met Ala355 360 365aag acc ggt aag tca gcc ttg gaa gca gaa aag gaa ttg ctt aac ggt1152Lys Thr Gly Lys Ser Ala Leu Glu Ala Glu Lys Glu Leu Leu Asn Gly370 375 380caa tcc gcc caa ggg ata atc aca tgc aga gaa gtt cac gag tgg cta1200Gln Ser Ala Gln Gly Ile Ile Thr Cys Arg Glu Val His Glu Trp Leu385 390 395 400caa aca tgt gag ttg acc caa gaa ttc cca att att cga ggc agt cta1248Gln Thr Cys Glu Leu Thr Gln Glu Phe Pro Ile Ile Arg Gly Ser Leu405 410 415cca gat agt cta caa caa cgt ccg cat gga aga cct acc gga gat gat1296Pro Asp Ser Leu Gln Gln Arg Pro His Gly Arg Pro Thr Gly Asp Asp420 425 430tga 1299<210>4<21l>432<212>PRT<213>釀酒酵母<400>4Met Leu Ala Val Arg Arg Leu Thr Arg Tyr Thr Phe Leu Lys Arg Thr1 5 10 15His Pro Val Leu Tyr Thr Arg Arg Ala Tyr Lys Ile Leu Pro Ser Arg20 25 30Ser Thr Phe Leu Arg Arg Ser Leu Leu Gln Thr Gln Leu His Ser Lys35 40 45Met Thr Ala His Thr Asn Ile Lys Gln His Lys His Cys His Glu Asp50 55 60His Pro Ile Arg Arg Ser Asp Ser Ala Val Ser Ile Val His Leu Lys65 70 75 80Arg Ala Pro Phe Lys Val Thr Val Ile Gly Ser Gly Asn Trp Gly Thr85 90 95Thr Ile Ala Lys Val Ile Ala Glu Asn Thr Glu Leu His Ser His Ile100 105 110Phe Glu Pro Glu Val Arg Met Trp Val Phe Asp Glu Lys Ile Gly Asp115 120 125Glu Asn Leu Thr Asp Ile Ile Asn Thr Arg His Gln Asn Val Lys Tyr130 135 140
Leu Pro Asn Ile Asp Leu Pro His Asn Leu Val Ala Asp Pro Asp Leu145 150 155 160Leu His Ser Ile Lys Gly Ala Asp Ile Leu Val Phe Asn Ile Pro His165 170 175Gln Phe Leu Pro Asn Ile Val Lys Gln Leu Gln Gly His Val Ala Pro180 185 190His Val Arg Ala Ile Ser Cys Leu Lys Gly Phe Glu Leu Gly Ser Lys195 200 205Gly Val Gln Leu Leu Ser Ser Tyr Val Thr Asp Glu Leu Gly Ile Gln210 215 220Cys Gly Ala Leu Ser Gly Ala Asn Leu Ala Pro Glu Val Ala Lys Glu225 230 235 240His Trp Ser Glu Thr Thr Val Ala Tyr Gln Leu Pro Lys Asp Tyr Gln245 250 255Gly Asp Gly Lys Asp Val Asp His Lys Ile Leu Lys Leu Leu Phe His260 265 270Arg Pro Tyr Phe His Val Asn Val Ile Asp Asp Val Ala Giy Ile Ser275 280 285Ile Ala Gly Ala Leu Lys Asn Val Val Ala Leu Ala Cys Gly Phe Val290 295 300Glu Gly Met Gly Trp Gly Asn Asn Ala Ser Ala Ala Ile Gln Arg Leu305 310 315 320Gly Leu Gly Glu Ile Ile Lys Phe Gly Arg Met Phe Phe Pro Glu Ser325 330 335Lys Val Glu Thr Tyr Tyr Gln Glu Ser Ala Gly Val Ala Asp Leu Ile340 345 350Thr Thr Cys Ser Gly Gly ArgAsn Val Lys Val Ala Thr Tyr Met Ala355360 365Lys Thr Gly Lys Ser Ala Leu Glu Ala Glu Lys Glu Leu Leu Asn Gly370 375 380Gln Ser Ala Gln Gly Ile Ile Thr Cys Arg Glu Val His Glu Trp Leu385 390 395 400Gin Thr Cys Glu Leu Thr Gln Glu Phe Pro Ile Ile Arg Gly Ser Leu405 410 415Pro Asp Ser Leu Gln Gln Arg Pro His Gly Arg Pro Thr Gly Asp Asp420 425 430<210>5<211>384<212>PRT<213>釀酒酵母<400>5Met Thr Ala His Thr Asn Ile Lys Gln His Lys His Cys His Glu Asp1 5 10 15His Pro Ile Arg Arg Ser Asp Ser Ala Val Ser Ile Val His Leu Lys20 25 30
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<212>DNA<213>粟酒裂殖酵母(schizosaccharomyces pombe)<220>
<221>CDS<222>(1)..(1119)<223>編碼G3PDH<400>6atg act gtg gct gct ttg aac aaa ctc agc gct ctc tcc gga agt att48Met Thr Val Ala Ala Leu Asn Lys Leu Ser Ala Leu Ser Gly Ser Ile1 5 10 15caa aaa tct ttt tca cct aaa ctt att tct gtt ggt atc atc gga tca96Gln Lys Ser Phe Ser Pro Lys Leu Ile Ser Val Gly Ile Ile Gly Ser20 25 30gga aat tgg gga acc gct att gct aaa ata tgt ggt gaa aat gcc aag144Gly Asn Trp Gly Thr Ala Ile Ala Lys Ile Cys Gly Glu Asn Ala Lys35 40 45gct cat cct gat att ttc cat cct caa gta cac atg tgg atg tat gaa192Ala His Pro Asp Ile Phe His Pro Gln Val His Met Trp Met Tyr Glu50 55 60gag aag att caa cat gag gga aaa gag tgc aat ctc acg gaa gtt ttt240Glu Lys Ile Gln His Glu Gly Lys Glu Cys Asn Leu Thr Glu Val Phe65 70 75 80aac act act cat gaa aac gtt aaa tat ctc aaa ggt atc aaa tgc cct288Asn Thr Thr His Glu Asn Val Lys Tyr Leu Lys Gly Ile Lys Cys Pro85 90 95tct aac gtc ttc gca aac ccg gac att cgt gat gta ggt tca cgt agc336Ser Asn Val Phe Ala Asn Pro Asp Ile Arg Asp Val Gly Ser Arg Ser100 105 110gac att ctg gta tgg gtt ctc cct cac cag ttc gtt gtg cgt att tgc384Asp Ile Leu Val Trp Val Leu Pro His Gln Phe Val Val Arg Ile Cys115 120 125aat caa ttg aag gga tgc cta aag aag gat gct gtt gca att tca tgc432Asn Gln Leu Lys Gly Cys Leu Lys Lys Asp Ala Val Ala Ile Ser Cys130 135 140atc aaa ggt gta tct gtc acc aag gac cgt gtt cgc ctc ttt tct gat480Ile Lys Gly Val Ser Val Thr Lys Asp Arg Val Arg Leu Phe Ser Asp145 150 155 160att atc gaa gaa aac acg gga atg tat tgt ggc gtt ctc tct ggc gcc528Ile Ile Glu Glu Asn Thr Gly Met Tyr Cys Gly Val Leu Ser Gly Ala165 170 175aac att gcc agc gaa gtt gct caa gag aag ttt tgc gaa act act atc576Asn Ile Ala Ser Glu Val Ala Gln Glu Lys Phe Cys Glu Thr Thr Ile180 185 190gga tat ttg cct aat agt tct gtt aat ccc cgc tat act cct aag act624Gly Tyr Leu Pro Asn Ser Ser Val Asn Pro Arg Tyr Thr Pro Lys Thr
195 200205atc caa gct ttg ttt aac cgt ccc tac ttc cgt gtc aac att gtt gag672Ile Gln Ala Leu Phe Asn Arg Pro Tyr Phe Arg Val Asn Ile Val Glu210 215 220gat gtt cct ggt gtt gct ttg ggc ggt gca ctc aag aat atc gtc gct720Asp Val Pro Gly Val Ala Leu Gly Gly Ala Leu Lys Asn Ile Val Ala225 230 235 240gtc gct gcc ggt att att gat gga ctt gaa ttg gga gat aat acc aaa768Val Ala Ala Gly Ile Ile Asp Gly Leu Glu Leu Gly Asp Asn Thr Lys245 250 255tct gct gtt atg cgc att ggc ctt ctg gaa atg cag aaa ttc ggc agg816Ser Ala Val Met Arg Ile Gly Leu Leu Glu Met Gln Lys Phe Gly Arg260 265 270atg ttt ttc gat tgt aag cct ctt act atg agc gag gaa tct tgt ggc864Met Phe Phe Asp Cys Lys Pro Leu Thr Met Ser Glu Glu Ser Cys Gly275 280 285ata gcc gat tta att aca act tgc tta ggc ggc cgt aac cac aaa tgc912Ile Ala Asp Leu Ile Thr Thr Cys Leu Gly Gly Arg Asn His Lys Cys290 295 300gct gtg gca ttt gtc aag aca gga aag ccc atg cat gtt gtt gaa caa960Ala Val Ala Phe Val Lys Thr Gly Lys Pro Met His Val Val Glu Gln305 310 315 320gaa ctt ctt gat ggt cag aag ttg caa ggt gca gct acc gcg aag gag1008Glu Leu Leu Asp Gly Gln Lys Leu Gln Gly Ala Ala Thr Ala Lys Glu325 330 335gtt tat gag ttc ctt gat aac cag aat aag gta agc gaa ttc cca ttg1056Val Tyr Glu Phe Leu Asp Asn Gln Asn Lys Val Ser Glu Phe Pro Leu340 345 350ttt aca gct gtt tat cgc att gtt tat gag gga ctt cca cct aat aag1104Phe Thr Ala Val Tyr Arg Ile Val Tyr Glu Gly Leu Pro Pro Asn Lys355 360 365ctt ctg gag gct att taa1122Leu Leu Glu Ala Ile370<210>7<211>373<212>PRT<213>粟酒裂殖酵母<400>7Met Thr Val Ala Ala Leu Asn Lys Leu Ser Ala Leu Ser Gly Ser Ile1 5 10 15Gln Lys Ser Phe Ser Pro Lys Leu Ile Ser Val Gly Ile Ile Gly Ser20 25 30Gly Asn Trp Gly Thr Ala Ile Ala Lys Ile Cys Gly Glu Asn Ala Lys35 40 45
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<220>
<221>CDS<222>(1)..(1152)<223>編碼G3PDH<400>8atg tct gga tat ggt caa caa ggt gtt tct gct gcc aac atc gac agc48Met Ser Gly Tyr Gly Gln Gln Gly Val Ser Ala Ala Asn Ile Asp Ser1 5 10 15atc cgc ccc aag aaa cgt ttg tca att ggt gta gtt ggc tcc ggt aac96Ile Arg Pro Lys Lys Arg Leu Ser Ile Gly Val Val Gly Ser Gly Asn20 25 30tgg ggt act gcc att gcc aag att tgc ggt gaa aat gcc cgt gcc cac144Trp Gly Thr Ala Ile Ala Lys Ile Cys Gly Glu Asn Ala Arg Ala His35 40 45ggt cac cat ttc aga ggt aag ggg cgc atg tgg gtc ttt gag gag gag192Gly His His Phe Arg Gly Lys Gly Arg Met Trp Val Phe Glu Glu Glu50 55 60att gag tac aag ggt gag aag aga aag ctc acc gaa gta ttc aac gaa240Ile Glu Tyr Lys Gly Glu Lys Arg Lys Leu Thr Glu Val Phe Asn Glu65 70 75 80gct cac gag aat gtc aaa tac tta ccc ggc atc gaa tgc cct ccc aac288Ala His Glu Asn Val Lys Tyr Leu Pro Gly Ile Glu Cys Pro Pro Asn85 90 95gtt att gcc gtc ccc gat gtt cgt gag gtc gct aga cgt gcc gac atc336Val Ile Ala Val Pro Asp Val Arg Glu Val Ala Arg Arg Ala Asp Ile100 105 110ctt gtc ttt gtc gtt cct cat caa ttt att gaa cgc gtt tgg cac caa384Leu Val Phe Val Val Pro His Gln Phe Ile Glu Arg Val Trp His Gln115 120 125atg gtc ggt ctc att cgc cct ggt gcc gtt ggt att tcc tgt atc aag432Met Val Gly Leu Ile Arg Pro Gly Ala Val Gly Ile Ser Cys Ile Lys130 135 140ggt gtt gct gtc agc aag gaa ggc tcg ctt tac tct gag gtt atc agc480Gly Val Ala Val Ser Lys Glu Gly Ser Leu Tyr Ser Glu Val Ile Ser145 150 155 160gag aaa ctc ggt att tac tgt ggt gtt ctt tct ggt gct aac gtt gca528Glu Lys Leu Gly Ile Tyr Cys Gly Val Leu Ser Gly Ala Asn Val Ala165 170 175aac gaa gtt gcc cgt gag caa ttc tgt gag act act att ggt ttc aac576Asn Glu Val Ala Arg Glu Gln Phe Cys Glu Thr Thr Ile Gly Phe Asn180 185 190cct cct aat gaa gtt gat atc cct cgc gag caa atc gcc gcc gtc tct624Pro Pro Asn Glu Val Asp Ile Pro Arg Glu Gln Ile Ala Ala Val Ser195 200 205gat cgc cct tac ttc tca gtt gtc tcc gtt gac gac gtt gcc ggt gtc672
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Leu Ala Thr Glu Ile Ala Leu Glu Lys Tyr Ser Glu Thr Thr Val Ala195 200 205tac aac cga ccc aag gac ttc ttt ggc gag ggt gat gtg acc aac gat672Tyr Asn Arg Pro Lys Asp Phe Phe Gly Glu Gly Asp Val Thr Asn Asp210 215 220gtg ctc aag gct ctg ttc cac cga ccc tac ttc cat gtg cga tgc gtt720Val Leu Lys Ala Leu Phe His Arg Pro Tyr Phe His Val Arg Cys Val225 230 235 240cag gac gtc gcc ggt gtc tcc atc gga ggt gcc ctt aag aac gtt gtt768Gln Asp Val Ala Gly Val Ser Ile Gly Gly Ala Leu Lys Asn Val Val245 250 255gcc ctt tgc gcc ggt ttc gtc gag ggc aag aac tgg gga gac aac gcc816Ala Leu Cys Ala Gly Phe Val Glu Gly Lys Asn Trp Gly Asp Asn Ala260 265 270aag gcc gca att atg cga cga ggc atg ctt gag atg atc aac ttc tcc864Lys Ala Ala Ile Met Arg Arg Gly Met Leu Glu Met Ile Asn Phe Ser275 280 285aag cga ttc ttc ccc gaa act gat att aac act ctt aca gtc gag tct912Lys Arg Phe Phe Pro Glu Thr Asp Ile Asn Thr Leu Thr Val Glu Ser290 295 300gcc ggt gtg gcc gat ctc atc acc tcg tgc gct gga ggc cga aac ttc960Ala Gly Val Ala Asp Leu Ile Thr Ser Cys Ala Gly Gly Arg Asn Phe305 310 315 320aag gtc ggc cga gca ttc gga aag gag agc ggc tcc ggc aag acc atc1008Lys Val Gly Arg Ala Phe Gly Lys Glu Ser Gly Ser Gly Lys Thr Ile325 330 335cag gac gtg gag aag gag ctt ctc aac ggc cag tcc gcc cag ggc gtc1056Gln Asp Val Glu Lys Glu Leu Leu Asn Gly Gln Ser Ala Gln Gly Val340 345 350atc aca tgt aac gag gtc cac gag ctg ctc aag aac aag aac atg cag1104Ile Thr Cys Asn Glu Val His Glu Leu Leu Lys Asn Lys Asn Met Gln355 360 365aag gac ttc cct ctg ttc gag tcc acc tgg ggc att atc cac ggt gag1152Lys Asp Phe Pro Leu Phe Glu Ser Thr Trp Gly Ile Ile His Gly Glu370 375 380ctc aag att gat gat ctc ccc gag att ctt tac cac gcc aac tag 1197Leu Lys Ile Asp Asp Leu Pro Glu Ile Leu Tyr His Ala Asn385 390 395<210>11<211>398<212>PRT<213>Yarrowia lipolytica<400>11Met Ser Ala Leu Leu Arg Ser Ser Leu Arg Phe Lys His Met Ser Ala
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<221>CDS<222>(1)..(1167)<223>編碼G3PDH<400>15atg gcc gcc act gac aga tta aac caa acc tcc gat atc cta tct cat48Met Ala Ala Thr Asp Arg Leu Asn Gln Thr Ser Asp Ile Leu Ser His1 5 10 15tct atg aag aag act gat acc tca atg tca att gtt acc gct gag aat96Ser Met Lys Lys Thr Asp Thr Ser Met Ser Ile Val Thr Ala Glu Asn20 25 30cct tac aag gtc gct gtt gtc ggt tct ggt aac tgg ggt acc act atc144Pro Tyr Lys Val Ala Val Val Gly Ser Gly Asn Trp Gly Thr Thr Ile35 40 45gct aag gtt gtt gcc gaa aac acc aaa gaa aag cca gag ttg ttc caa192Ala Lys Val Val Ala Glu Asn Thr Lys Glu Lys Pro Glu Leu Phe Gln50 55 60gga cgt gtg gac atg tgg gtt ttc gaa gaa caa atc gat ggt act cca240Gly Arg Val Asp Met Trp Val Phe Glu Glu Gln Ile Asp Gly Thr Pro65 70 75 80ttg act caa atc atc aac acc aaa cac caa aac gtc aaa tac ctt cca288Leu Thr Gln Ile Ile Asn Thr Lys His Gln Asn Val Lys Tyr Leu Pro
85 90 95aac atc gat ctt ccg ggg aat ttg gtc gct aac cca gat ttg atc tct336Asn Ile Asp Leu Pro Gly Asn Leu Val Ala Asn Pro Asp Leu Ile Ser100 105 110act acc aag gac gct gat gtc atc gtt ttc aac gtt cct cac caa ttt384Thr Thr Lys Asp Ala Asp Val Ile Val Phe Asn Val Pro His Gln Phe115 120 125ttg ggc cgt atc gtt tct caa atg aag ggt caa atc aaa cca gat gct432Leu Gly Arg Ile Val Ser Gln Met Lys Gly Gln Ile Lys Pro Asp Ala130 135 140cgt gcc atc tcc tgt cta aag ggt ttc gaa gtt ggt cca aag ggt gtc480Arg Ala Ile Ser Cys Leu Lys Gly Phe Glu Val Gly Pro Lys Gly Val145 150 155 160caa cta ctt tct gac tac gtc act caa gaa tta ggt atc caa tgt ggt 528Gln Leu Leu Ser Asp Tyr Val Thr Gln Glu Leu Gly Ile Gln Cys Gly165 170 175gcc cta tct ggt gct aac ttg gct cca gaa gtc gcc aag gaa cac tgg576Ala Leu Ser Gly Ala Asn Leu Ala Pro Glu Val Ala Lys Glu His Trp180 185 190tcc gaa act acc gtc gct tac caa gtc cca gat gac ttc aag ggt gaa624Ser Glu Thr Thr Val Ala Tyr Gln Val Pro Asp Asp Phe Lys Gly Glu195 200 205ggt aaa gat atc gac cac cgt gtc ttg aaa caa ttg ttc cac aga cca672Gly Lys Asp Ile Asp His Arg Val Leu Lys Gln Leu Phe His Arg Pro210 215 220tac ttc cac gtc aat gtg atc gac gat gtt gct ggt att tct atc gca720Tyr Phe His Val Asn Val Ile Asp Asp Val Ala Gly Ile Ser Ile Ala225 230 235 240ggt gca ttg aag aac gtg gtt gcc ttg ggt tgc ggt ttc gtc acc ggt768Gly Ala Leu Lys Asn Val Val Ala Leu Gly Cys Gly Phe Val Thr Gly245 250 255cta ggc tgg ggt aac aac gct gcc gcc gcc atc caa cgt gtt ggt ttg816Leu Gly Trp Gly Asn Asn Ala Ala Ala Ala Ile Gln Arg Val Gly Leu260 265 270ggt gaa atc atc aag ttc ggt aga atg ttc ttc cca gaa tcc aag gtg864Gly Glu Ile Ile Lys Phe Gly Arg Met Phe Phe Pro Glu Ser Lys Val275 280 285gaa act tac tac caa gaa tct gca ggt gtt gct gat ttg atc act acc912Glu Thr Tyr Tyr Gln Glu Ser Ala Gly Val Ala Asp Leu Ile Thr Thr290 295 300tgt tcc ggt ggt aga aac gtt cgt gtc gcc act gaa atg gcc aag act960Cys Ser Gly Gly Arg Asn Val Arg Val Ala Thr Glu Met Ala Lys Thr305 310 315 320ggt aag agc ggt gaa caa gtc gaa aag gac atc ttg aac ggt caa tcc1008Gly Lys Ser Gly Glu Gln Val Glu Lys Asp Ile Leu Asn Gly Gln Ser325 330 335gct caa ggt ttg att act gct aag gaa gtc cac caa tgg ttg gaa tcc1056
Ala Gln Gly Leu Ile Thr Ala Lys Glu Val His Gln Trp Leu Glu Ser340 345 350agc ggt cac acc gaa gaa tac cca ttg ttt gaa gcc gtc tac caa atc1104Ser Gly His Thr Glu Glu Tyr Pro Leu Phe Glu Ala Val Tyr Gln Ile355 360 365act tac gaa aac gtg ccc atg aag gag ttg cca tcc atg atc gaa gaa1152Thr Tyr Glu Asn Val Pro Met Lys Glu Leu Pro Ser Met Ile Glu Glu370 375 380ttg gat atc gta gaa taa1170Leu Asp Ile Val Glu385<210>16<211>389<212>PRT<213>Zygosaccharomyces rouxii<400>16Met Ala Ala Thr Asp Arg Leu Asn Gln Thr Ser Asp Ile Leu Ser His1 5 10 15Ser Met Lys Lys Thr Asp Thr Ser Met Ser Ile Val Thr Ala Glu Asn20 25 30Pro Tyr Lys Val Ala Val Val Gly Ser Gly Asn Trp Gly Thr Thr Ile35 40 45Ala Lys Val Val Ala Glu Asn Thr Lys Glu Lys Pro Glu Leu Phe Gln50 55 60Gly Arg Val Asp Met Trp Val Phe Glu Glu Gln Ile Asp Gly Thr Pro65 70 75 80Leu Thr Gln Ile Ile Asn Thr Lys His Gln Asn Val Lys Tyr Leu Pro85 90 95Asn Ile Asp Leu Pro Gly Asn Leu Val Ala Asn Pro Asp Leu Ile Ser100 105 110Thr Thr Lys Asp Ala Asp Val Ile Val Phe Asn Val Pro His Gln Phe115 120 125Leu Gly Arg Ile Val Ser Gln Met Lys Gly Gln Ile Lys Pro Asp Ala130135 140Arg Ala Ile Ser Cys Leu Lys Gly Phe Glu Val Gly Pro Lys Gly Val145 150 155 160Gln Leu Leu Ser Asp Tyr Val Thr Gln Glu Leu Gly Ile Gln Cys Gly165 170 175Ala Leu Ser Gly Ala Asn Leu Ala Pro Glu Val Ala Lys Glu His Trp180 185 190Ser Glu Thr Thr Val Ala Tyr Gln Val Pro Asp Asp Phe Lys Gly Glu195 200 205Gly Lys Asp Ile Asp His Arg Val Leu Lys Gln Leu Phe His Arg Pro210 215 220Tyr Phe His Val Asn Val Ile Asp Asp Val Ala Gly Ile Ser Ile Ala
225 230 235 240Gly Ala Leu Lys Asn Val Val Ala Leu Gly Cys Gly Phe Val Thr Gly245 250 255Leu Gly Trp Gly Asn Asn Ala Ala Ala Ala Ile Gln Arg Val Gly Leu260 265 270Gly Glu Ile Ile Lys Phe Gly Arg Met Phe Phe Pro Glu Ser Lys Val275 280 285Glu Thr Tyr Tyr Gln Glu Ser Ala Gly Val Ala Asp Leu Ile Thr Thr290 295 300Cys Ser Gly Gly Arg Asn Val Arg Val Ala Thr Glu Met Ala Lys Thr305 310 315 320Gly Lys Ser Gly Glu Gln Val Glu Lys Asp Ile Leu Asn Gly Gln Ser325 330 335Ala Gln Gly Leu Ile Thr Ala Lys Glu Val His Gln Trp Leu Glu Ser340 345 350Ser Gly His Thr Glu Glu Tyr Pro Leu Phe Glu Ala Val Tyr Gln Ile355 360 365Thr Tyr Glu Asn Val Pro Met Lys Glu Leu Pro Ser Met Ile Glu Glu370 375 380Leu Asp Ile Val Glu385<210>17<211>8809<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述含有酵母屬G3PDH的表達載體pSUN-USP<220>
<221>misc_feature<222>(1017)..(2189)<223>編碼G3PDH<400>17aatattcaaa caaacacata cagcgcgact tatcatggac atacaaatgg acgaacggat 60aaaccttttc acgccctttt aaatatccga ttattctaat aaacgctctt ttctcttagg 120tttacccgcc aatatatcct gtcaaacact gatagtttaa actgaaggcg ggaaacgaca 180atcagatcta gtaggaaaca gctatgacca tgattacgcc aagcttgcat gcctgcaggt 240cgactctaga ctagtggatc cgatatcgcc cgggctcgag gtaccgagct cgaattcggc 300gcgccgagct cctcgagcaa atttacacat tgccactaaa cgtctaaacc cttgtaattt 360gtttttgttt tactatgtgt gttatgtatt tgatttgcga taaattttta tatttaatac 420taaatttata acacctttta tgctaacgtt tgccaacact tagcaatttg caagttgatt 480aattgattct aaattatttt tgtcttctaa atacatatac taatcaactg gaaatgtaaa 540tatttgctaa tatttctact ataggagaat taaagtgagt gaatatggta ccacaaggtt 600tggagattta attgttgcaa tgatgcatgg atggcatata caccaaacat tcaataattc 660
ttgaggataa taatggtacc acacaagatt tgaggtgcat gaacgtcacg tggacaaaag 720gtttagtaat ttttcaagac aacaatgtta ccacacacaa gttttgaggt gcatgcatgg 780atgccctgtg gaaagtttaa aaatattttg gaaatgattt gcatggaagc catgtgtaaa 840accatgacat ccacttggag gatgcaataa tgaagaaaac tacaaattta catgcaacta 900gttatgcatg tagtctatat aatgaggatt ttgcaatact ttcattcata cacactcact 960aagttttaca cgattataat ttcttcatag ccagcccacc gcggtgggcg gccgccatgt 1020ctgctgctgc tgatagatta aacttaactt ccggccactt gaatgctggt agaaagagaa 1080gttcctcttc tgtttctttg aaggctgccg aaaagccttt caaggttact gtgattggat 1140ctggtaactg gggtactact attgccaagg tggttgccga aaattgtaag ggatacccag 1200aagttttcgc tccaatagta caaatgtggg tgttcgaaga agagatcaat ggtgaaaaat 1260tgactgaaat cataaatact agacatcaaa acgtgaaata cttgcctggc atcactctac 1320ccgacaattt ggttgctaat ccagacttga ttgattcagt caaggatgtc gacatcatcg 1380tcttcaacat tccacatcaa tttttgcccc gtatctgtag ccaattgaaa ggtcatgttg 1440attcacacgt cagagctatc tcctgtctaa agggttttga agttggtgct aaaggtgtcc 1500aattgctatc ctcttacatc actgaggaac taggtattca atgtggtgct ctatctggtg 1560ctaacattgc cactgaagtc gctcaagaac actggtctga aacaacagtt gcttaccaca 1620ttccaaagga tttcagaggc gagggcaagg acgtcgacca taaggttcta aaggccttgt 1680tccacagacc ttacttccac gttagtgtca tcgaagatgt tgctggtatc tccatctgtg 1740gtgctttgaa gaacgttgtt gccttaggtt gtggtttcgt cgaaggtcta ggctggggta 1800acaacgcttc tgctgccatc caaagagtcg gtttgggtga gatcatcaga ttcggtcaaa 1860tgtttttccc agaatctaga gaagaaacat actaccaaga gtctgctggt gttgctgatt 1920tgatcaccac ctgcgctggt ggtagaaacg tcaaggttgc taggctaatg gctacttctg 1980gtaaggacgc ctgggaatgt gaaaaggagt tgttgaatgg ccaatccgct caaggtttaa 2040ttacctgcaa agaagttcac gaatggttgg aaacatgtgg ctctgtcgaa gacttcccat 2100tatttgaagc cgtataccaa atcgtttaca acaactaccc aatgaagaac ctgccggaca 2160tgattgaaga attagatcta catgaagatt aggcggccgc ctgcagtcta gaaggcctcc 2220tgctttaatg agatatgcga gacgcctatg atcgcatgat atttgctttc aattctgttg 2280tgcacgttgt aaaaaacctg agcatgtgta gctcagatcc ttaccgccgg tttcggttca 2340ttctaatgaa tatatcaccc gttactatcg tatttttatg aataatattc tccgttcaat 2400ttactgattg tccgtcgacg aattcactgg ccgtcgtttt acaacgactc agagcttgac 2460aggaggcccg atctagtaac atagatgaca ccgcgcgcga taatttatcc tagtttgcgc 2520gctatatttt gttttctatc gcgtattaaa tgtataattg cgggactcta atcataaaaa 2580cccatctcat aaataacgtc atgcattaca tgttaattat tacatgctta acgtaattca 2640acagaaatta tatgataatc atcgcaagac cggcaacagg attcaatctt aagaaacttt 2700attgccaaat gtttgaacga tcggggatca tccgggtctg tggcgggaac tccacgaaaa 2760tatccgaacg cagcaagatc tagagcttgg gtcccgctca gaagaactcg tcaagaaggc 2820gatagaaggc gatgcgctgc gaatcgggag cggcgatacc gtaaagcacg aggaagcggt 2880cagcccattc gccgccaagc tcttcagcaa tatcacgggt agccaacgct atgtcctgat 2940agcggtccgc cacacccagc cggccacagt cgatgaatcc agaaaagcgg ccattttcca 3000ccatgatatt cggcaagcag gcatcgccat gtgtcacgac gagatcctcg ccgtcgggca 3060tgcgcgcctt gagcctggcg aacagttcgg ctggcgcgag cccctgatgc tcttcgtcca 3120gatcatcctg atcgacaaga ccggcttcca tccgagtacg tgctcgctcg atgcgatgtt 3180tcgcttggtg gtcgaatggg caggtagccg gatcaagcgt atgcagccgc cgcattgcat 3240cagccatgat ggatactttc tcggcaggag caaggtgaga tgacaggaga tcctgccccg 3300gcacttcgcc caatagcagc cagtcccttc ccgcttcagt gacaacgtcg agcacagctg 3360cgcaaggaac gcccgtcgtg gccagccacg atagccgcgc tgcctcgtcc tgcagttcat 3420tcagggcacc ggacaggtcg gtcttgacaa aaagaaccgg gcgcccctgc gctgacagcc 3480
ggaacacggc ggcatcagag cagccgattg tctgttgtgc ccagtcatag ccgaatagcc 3540tctccaccca agcggccgga gaacctgcgt gcaatccatc ttgttcaatc atgcgaaacg 3600atccagatcc ggtgcagatt atttggattg agagtgaata tgagactcta attggatacc 3660gaggggaatt tatggaacgt cagtggagca tttttgacaa gaaatatttg ctagctgata 3720gtgaccttag gcgacttttg aacgcgcaat aatggtttct gacgtatgtg cttagctcat 3780taaactccag aaacccgcgg ctgagtggct ccttcaacgt tgcggttctg tcagttccaa 3840acgtaaaacg gcttgtcccg cgtcatcggc gggggtcata acgtgactcc cttaattctc 3900cgctcatgat cagattgtcg tttcccgcct tcagtttaaa ctatcagtgt ttgacaggat 3960cactgcttgg taataattgt cattagattg tttttatgca tagatgcact cgaaatcagc 4020caattttaga caagtatcaa acggatgtta attcagtaca ttaaagacgt ccgcaatgtg 4080ttattaagtt gtctaagcgt caatttgttt acaccacaat atatcctgcc accagccagc 4140caacagctcc ccgaccggca gctcggcaca aaatcaccac gcgtctaaaa aggtgatgtg 4200tatttgagta aaacagcttg cgtcatgcgg tcgctgcgta tatgatgcga tgagtaaata 4260aacaaatacg caaggggaac gcatgaaggt tatcgctgta cttaaccaga aaggcgggtc 4320aggcaagacg accatcgcaa cccatctagc ccgcgccctg caactcgccg gggccgatgt 4380tctgttagtc gattccgatc cccagggcag tgcccgcgat tgggcggccg tgcgggaaga 4440tcaaccgcta accgttgtcg gcatcgaccg cccgacgatt gaccgcgacg tgaaggccat 4500cggccggcgc gacttcgtag tgatcgacgg agcgccccag gcggcggact tggctgtgtc 4560cgcgatcaag gcagccgact tcgtgctgat tccggtgcag ccaagccctt acgacatatg 4620ggccaccgcc gacctggtgg agctggttaa gcagcgcatt gaggtcacgg atggaaggct 4680acaagcggcc tttgtcgtgt cgcgggcgat caaaggcacg cgcatcggcg gtgaggttgc 4740cgaggcgctg gccgggtacg agctgcccat tcttgagtcc cgtatcacgc agcgcgtgag 4800ctacccaggc actgccgccg ccggcacaac cgttcttgaa tcagaacccg agggcgacgc 4860tgcccgcgag gtccaggcgc tggccgctga aattaaatca aaactcattt gagttaatga 4920ggtaaagaga aaatgagcaa aagcacaaac acgctaagtg ccggccgtcc gagcgcacgc 4980agcagcaagg ctgcaacgtt ggccagcctg gcagacacgc cagccatgaa gcgggtcaac 5040tttcagttgc cggcggagga tcacaccaag ctgaagatgt acgcggtacg ccaaggcaag 5100accattaccg agctgctatc tgaatacatc gcgcagctac cagagtaaat gagcaaatga 5160ataaatgagt agatgaattt tagcggctaa aggaggcggc atggaaaatc aagaacaacc 5220aggcaccgac gccgtggaat gccccatgtg tggaggaacg ggcggttggc caggcgtaag 5280cggctgggtt gtctgccggc cctgcaatgg cactggaacc cccaagcccg aggaatcggc 5340gtgagcggtc gcaaaccatc cggcccggta caaatcggcg cggcgctggg tgatgacctg 5400gtggagaagt tgaaggccgc gcaggccgcc cagcggcaac gcatcgaggc agaagacgcc 5460ccggtgaatc gtggcaaggg gccgctgatc gaatccgcaa agaatcccgg caaccgccgg 5520cagccggtgc gccgtcgatt aggaagccgc ccaagggcga cgagcaacca gattttttcg 5580ttccgatgct ctatgacgtg ggcacccgcg atagtcgcag catcatggac gtggccgttt 5640tccgtctgtc gaagcgtgac cgacgagctg gcgaggtgat ccgctacgag cttccagacg 5700ggcacgtaga ggtttccgca gggccggccg gcatggccag tgtgtgggat tacgacctgg 5760tactgatggc ggtttcccat ctaaccgaat ccatgaaccg ataccgggaa gggaagggag 5820acaagcccgg ccgcgtgttc cgtccacacg ttgcggacgt actcaagttc tgccggcgag 5880ccgatggcgg aaagcagaaa gacgacctgg tagaaacctg cattcggtta aacaccacgc 5940acgttgccat gcagcgtacg aagaaggcca agaacggccg cctggtgacg gtatccgagg 6000gtgaagcctt gattagccgc tacaagatcg taaagagcga aaccgggcgg ccggagtaca 6060tcgagatcga gctagctgat tggatgtacc gcgagatcac agaaggcaag aacccggacg 6120tgctgacggt tcaccccgat tactttttga tcgatcccgg catcggccgt tttctctacc 6180gcctggcacg ccgcgccgca ggcaaggcag aagccagatg gttgttcaag acgatctacg 6240aacgcagtgg cagcgccgga gagttcaaga agttctgttt caccgtgcgc aagctgatcg 6300
ggtcaaatga cctgccggag tacgatttga aggaggaggc ggggcaggct ggcccgatcc 6360tagtcatgcg ctaccgcaac ctgatcgagg gcgaagcatc cgccggttcc taatgtacgg 6420agcagatgct agggcaaatt gccctagcag gggaaaaagg tcgaaaaggt ctctttcctg 6480tggatagcac gtacattggg aacccaaagc cgtacattgg gaaccggaac ccgtacattg 6540ggaacccaaa gccgtacatt gggaaccggt cacacatgta agtgactgat ataaaagaga 6600aaaaaggcga tttttccgcc taaaactctt taaaacttat taaaactctt aaaacccgcc 6660tggcctgtgc ataactgtct ggccagcgca cagccgaaga gctgcaaaaa gcgcctaccc 6720ttcggtcgct gcgctcccta cgccccgccg cttcgcgtcg gcctatcgcg gcctatgcgg 6780tgtgaaatac cgcacagatg cgtaaggaga aaataccgca tcaggcgctc ttccgcttcc 6840tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc gagcggtatc agctcactca 6900aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca ggggataacg caggaaagaa catgtgagca 6960aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg 7020ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg 7080acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt 7140ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt 7200tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc 7260tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt 7320gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag cagccactgg taacaggatt 7380agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc taactacggc 7440tacactagaa ggacagtatt tggtatctgc gctctgctga agccagttac cttcggaaaa 7500agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt 7560tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt gatcttttct 7620acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt catgcatgat 7680atatctccca atttgtgtag ggcttattat gcacgcttaa aaataataaa agcagacttg 7740acctgatagt ttggctgtga gcaattatgt gcttagtgca tctaacgctt gagttaagcc 7800gcgccgcgaa gcggcgtcgg cttgaacgaa tttctagcta gacattattt gccgactacc 7860ttggtgatct cgcctttcac gtagtggaca aattcttcca actgatctgc gcgcgaggcc 7920aagcgatctt cttcttgtcc aagataagcc tgtctagctt caagtatgac gggctgatac 7980tgggccggca ggcgctccat tgcccagtcg gcagcgacat ccttcggcgc gattttgccg 8040gttactgcgc tgtaccaaat gcgggacaac gtaagcacta catttcgctc atcgccagcc 8100cagtcgggcg gcgagttcca tagcgttaag gtttcattta gcgcctcaaa tagatcctgt 8160tcaggaaccg gatcaaagag ttcctccgcc gctggaccta ccaaggcaac gctatgttct 8220cttgcttttg tcagcaagat agccagatca atgtcgatcg tggctggctc gaagatacct 8280gcaagaatgt cattgcgctg ccattctcca aattgcagtt cgcgcttagc tggataacgc 8340cacggaatga tgtcgtcgtg cacaacaatg gtgacttcta cagcgcggag aatctcgctc 8400tctccagggg aagccgaagt ttccaaaagg tcgttgatca aagctcgccg cgttgtttca 8460tcaagcctta cggtcaccgt aaccagcaaa tcaatatcac tgtgtggctt caggccgcca 8520tccactgcgg agccgtacaa atgtacggcc agcaacgtcg gttcgagatg gcgctcgatg 8580acgccaacta cctctgatag ttgagtcgat acttcggcga tcaccgcttc ccccatgatg 8640tttaactttg ttttagggcg actgccctgc tgcgtaacat cgttgctgct ccataacatc 8700aaacatcgac ccacggcgta acgcgcttgc tgcttggatg cccgaggcat agactgtacc 8760ccaaaaaaac agtcataaca agccatgaaa accgccactg cgttccatg 8809<210>18<211>26<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸引物<400>18actagtatgt ctgctgctgc tgatag26<210>19<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸引物<400>19ctcgagatct tcatgtagat ctaatt 26<210>20<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸引物<400>20gcggccgcca tgtctgctgc tgctgatag 29<210>21<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸引物<400>21gcggccgcat cttcatgtag atctaatt28<210>22<211>11<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述酵母G3PDH序列基序
<220>
<221>VARIANT<222>(8)<223>Thr<400>22Gly Ser Gly Asn Trp Gly Thr Ala Ile Ala Lys1 5 10<210>23<211>8<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述酵母G3PDH序列基序<220>
<221>VARIANT<222>(2)<223>Gln<400>23His Glu Gln Asn Val Lys Tyr Leu1 5<210>24<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述酵母G3PDH序列基序<220>
<221>VARIANT<222>(1)<223>Asn<220>
<221>VARIANT<222>(2)<223>Val<220>
<221>VARIANT
<222>(3)<223>Ile<220>
<221>VARIANT<222>(5)<223>Trp<220>
<221>VARIANT<222>(6)<223>Asn<220>
<221>VARIANT<222>(7)<223>Ile或Val<220>
<221>VARIANT<222>(12)<223>Leu或Ile<400>24Asp Ile Leu Val Phe Val Leu Pro His Gln Phe Val1 5 10<210>25<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述酵母G3PDH序列基序<220>
<221>VARIANT<222>(1)<223>Gly<220>
<221>VARIANT<222>(2)<223>Val<220>
<221>VARIANT
<222>(5)<223>Ile<400>25Ala Ile Ser Cys Leu Lys Gly1 5<210>26<211>14<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述酵母G3PDH序列基序<220>
<221>VARIANT<222>(3)<223>Ala<220>
<221>VARIANT<222>(9)<223>Ile或Val<220>
<221>VARIANT<222>(13)<223>Ile<400>26Cys Gly Val Leu Ser Gly Ala Asn Leu Ala Xaa Glu Val Ala1 5 10<210>27<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述酵母G3PDH序列基序<220>
<221>VARIANT<222>(1)<223>Val
<400>27Leu Phe Xaa Arg Pro Tyr Phe Xaa Val1 5<210>28<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述酵母G3PDH序列基序<220>
<221>VARIANT<222>(2)<223>Met<220>
<221>VARIANT<222>(3)<223>Gly<220>
<221>VARIANT<222>(5)<223>Ile<220>
<221>VARIANT<222>(6)<223>Gln<220>
<221>VARIANT<222>(7)<223>Lys或Asn<220>
<221>VARIANT<222>(9)<223>Ser或Ala<400>28Gly Leu Leu Glu Met Ile Arg Phe Gly1 5<210>29
<211>16<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述酵母G3PDH序列基序<220>
<221>VARIANT<222>(13)<223>Ile<400>29Gly Ser Gly Asn Trp Gly Thr Thr Ile Ala Lys Val Val Ala Glu Asn1 5 10 15<210>30<211>11<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述酵母G3PDH序列基序<220>
<221>VARIANT<222>(3)<223>Arg<400>30Asn Thr Lys His Gln Asn Val Lys Tyr Leu Pro1 5 10<210>31<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述酵母G3PDH序列基序<220>
<221>VARIANT<222>(2)<223>Val<220>
<221>VARIANT<222>(7)<223>Val<400>31Asp Ile Leu Val Phe Asn Ile Pro His Gln Phe Leu1 5 10<210>32<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述酵母G3PDH序列基序<220>
<221>VARIANT<222>(3)<223>Val<400>32Arg Ala Ile Ser Cys Leu Lys Gly Phe Glu1 5 10<210>33<211>14<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述酵母G3PDH序列基序<220>
<221>VARIANT<222>(11)<223>Thr<400>33Cys Gly Ala Leu Ser Gly Ala Asn Leu Ala Pro Glu Val Ala1 5 10<210>34<211>9<212>PRT<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述酵母G3PDH序列基序<400>34Leu Phe His Arg Pro Tyr Phe His Val1 5<210>35<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述酵母G3PDH序列基序<220>
<221>VARIANT<222>(7)<223>Arg<400>35Gly Leu Gly Glu Ile Ile Lys Phe Gly1 5<210>36<211>13718<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述表達載體pGPTV-gpd1<220>
<221>啟動子<222>(10807)..(11951)<223>napin啟動予<220>
<221>終止子<222>(13154)..(13408)<223>nos終止子<220>
<221>misc_feature<222>(11962)..(13137)<223>編碼酵母G3PDH(gpd1)
<400>36gatctggcgc cggccagcga gacgagcaag attggccgcc gcccgaaacg atccgacagc 60gcgcccagca caggtgcgca ggcaaattgc accaacgcat acagcgccag cagaatgcca 120tagtgggcgg tgacgtcgtt cgagtgaacc agatcgcgca ggaggcccgg cagcaccggc 180ataatcaggc cgatgccgac agcgtcgagc gcgacagtgc tcagaattac gatcaggggt 240atgttgggtt tcacgtctgg cctccggacc agcctccgct ggtccgattg aacgcgcgga 300ttctttatca ctgataagtt ggtggacata ttatgtttat cagtgataaa gtgtcaagca 360tgacaaagtt gcagccgaat acagtgatcc gtgccgccct ggacctgttg aacgaggtcg 420gcgtagacgg tctgacgaca cgcaaactgg cggaacggtt gggggttcag cagccggcgc 480tttactggca cttcaggaac aagcgggcgc tgctcgacgc actggccgaa gccatgctgg 540cggagaatca tacgcattcg gtgccgagag ccgacgacga ctggcgctca tttctgatcg 600ggaatgcccg cagcttcagg caggcgctgc tcgcctaccg cgatggcgcg cgcatccatg 660ccggcacgcg accgggcgca ccgcagatgg aaacggccga cgcgcagctt cgcttcctct 720gcgaggcggg tttttcggcc ggggacgccg tcaatgcgct gatgacaatc agctacttca 780ctgttggggc cgtgcttgag gagcaggccg gcgacagcga tgccggcgag cgcggcggca 840ccgttgaaca ggctccgctc tcgccgctgt tgcgggccgc gatagacgcc ttcgacgaag 900ccggtccgga cgcagcgttc gagcagggac tcgcggtgat tgtcgatgga ttggcgaaaa 960ggaggctcgt tgtcaggaac gttgaaggac cgagaaaggg tgacgattga tcaggaccgc 1020tgccggagcg caacccactc actacagcag agccatgtag acaacatccc ctcccccttt 1080ccaccgcgtc agacgcccgt agcagcccgc tacgggcttt ttcatgccct gccctagcgt 1140ccaagcctca cggccgcgct cggcctctct ggcggccttc tggcgctctt ccgcttcctc 1200gctcactgac tcgctgcgct cggtcgttcg gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa 1260ggcggtaata cggttatcca cagaatcagg ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa 1320aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct 1380ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac 1440aggactataa agataccagg cgtttccccc tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc 1500gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttt 1560ccgctgcata accctgcttc ggggtcatta tagcgatttt ttcggtatat ccatcctttt 1620tcgcacgata tacaggattt tgccaaaggg ttcgtgtaga ctttccttgg tgtatccaac 1680ggcgtcagcc gggcaggata ggtgaagtag gcccacccgc gagcgggtgt tccttcttca 1740ctgtccctta ttcgcacctg gcggtgctca acgggaatcc tgctctgcga ggctggccgg 1800ctaccgccgg cgtaacagat gagggcaagc ggatggctga tgaaaccaag ccaaccagga 1860agggcagccc acctatcaag gtgtactgcc ttccagacga acgaagagcg attgaggaaa 1920aggcggcggc ggccggcatg agcctgtcgg cctacctgct ggccgtcggc cagggctaca 1980aaatcacggg cgtcgtggac tatgagcacg tccgcgagct ggcccgcatc aatggcgacc 2040tgggccgcct gggcggcctg ctgaaactct ggctcaccga cgacccgcgc acggcgcggt 2100tcggtgatgc cacgatcctc gccctgctgg cgaagatcga agagaagcag gacgagcttg 2160gcaaggtcat gatgggcgtg gtccgcccga gggcagagcc atgacttttt tagccgctaa 2220aacggccggg gggtgcgcgt gattgccaag cacgtcccca tgcgctccat caagaagagc 2280gacttcgcgg agctggtgaa gtacatcacc gacgagcaag gcaagaccga gcgcctttgc 2340gacgctcacc gggctggttg ccctcgccgc tgggctggcg gccgtctatg gccctgcaaa 2400cgcgccagaa acgccgtcga agccgtgtgc gagacaccgc ggccgccggc gttgtggata 2460cctcgcggaa aacttggccc tcactgacag atgaggggcg gacgttgaca cttgaggggc 2520cgactcaccc ggcgcggcgt tgacagatga ggggcaggct cgatttcggc cggcgacgtg 2580gagctggcca gcctcgcaaa tcggcgaaaa cgcctgattt tacgcgagtt tcccacagat 2640gatgtggaca agcctgggga taagtgccct gcggtattga cacttgaggg gcgcgactac 2700tgacagatga ggggcgcgat ccttgacact tgaggggcag agtgctgaca gatgaggggc 2760
gcacctattg acatttgagg ggctgtccac aggcagaaaa tccagcattt gcaagggttt 2820ccgcccgttt ttcggccacc gctaacctgt cttttaacct gcttttaaac caatatttat 2880aaaccttgtt tttaaccagg gctgcgccct gtgcgcgtga ccgcgcacgc cgaagggggg 2940tgccccccct tctcgaaccc tcccggcccg ctaacgcggg cctcccatcc ccccaggggc 3000tgcgcccctc ggccgcgaac ggcctcaccc caaaaatggc agcgctggca gtccttgcca 3060ttgccgggat cggggcagta acgggatggg cgatcagccc gagcgcgacg cccggaagca 3120ttgacgtgcc gcaggtgctg gcatcgacat tcagcgacca ggtgccgggc agtgagggcg 3180gcggcctggg tggcggcctg cccttcactt cggccgtcgg ggcattcacg gacttcatgg 3240cggggccggc aatttttacc ttgggcattc ttggcatagt ggtcgcgggt gccgtgctcg 3300tgttcggggg tgcgataaac ccagcgaacc atttgaggtg ataggtaaga ttataccgag 3360gtatgaaaac gagaattgga cctttacaga attactctat gaagcgccat atttaaaaag 3420ctaccaagac gaagaggatg aagaggatga ggaggcagat tgccttgaat atattgacaa 3480tactgataag ataatatatc ttttatatag aagatatcgc cgtatgtaag gatttcaggg 3540ggcaaggcat aggcagcgcg cttatcaata tatctataga atgggcaaag cataaaaact 3600tgcatggact aatgcttgaa acccaggaca ataaccttat agcttgtaaa ttctatcata 3660attgggtaat gactccaact tattgatagt gttttatgtt cagataatgc ccgatgactt 3720tgtcatgcag ctccaccgat tttgagaacg acagcgactt ccgtcccagc cgtgccaggt 3780gctgcctcag attcaggtta tgccgctcaa ttcgctgcgt atatcgcttg ctgattacgt 3840gcagctttcc cttcaggcgg gattcataca gcggccagcc atccgtcatc catatcacca 3900cgtcaaaggg tgacagcagg ctcataagac gccccagcgt cgccatagtg cgttcaccga 3960atacgtgcgc aacaaccgtc ttccggagac tgtcatacgc gtaaaacagc cagcgctggc 4020gcgatttagc cccgacatag ccccactgtt cgtccatttc cgcgcagacg atgacgtcac 4080tgcccggctg tatgcgcgag gttaccgact gcggcctgag ttttttaagt gacgtaaaat 4140cgtgttgagg ccaacgccca taatgcgggc tgttgcccgg catccaacgc cattcatggc 4200catatcaatg attttctggt gcgtaccggg ttgagaagcg gtgtaagtga actgcagttg 4260ccatgtttta cggcagtgag agcagagata gcgctgatgt ccggcggtgc ttttgccgtt 4320acgcaccacc ccgtcagtag ctgaacagga gggacagctg atagacacag aagccactgg 4380agcacctcaa aaacaccatc atacactaaa tcagtaagtt ggcagcatca cccataattg 4440tggtttcaaa atcggctccg tcgatactat gttatacgcc aactttgaaa acaactttga 4500aaaagctgtt ttctggtatt taaggtttta gaatgcaagg aacagtgaat tggagttcgt 4560cttgttataa ttagcttctt ggggtatctt taaatactgt agaaaagagg aaggaaataa 4620taaatggcta aaatgagaat atcaccggaa ttgaaaaaac tgatcgaaaa ataccgctgc 4680gtaaaagata cggaaggaat gtctcctgct aaggtatata agctggtggg agaaaatgaa 4740aacctatatt taaaaatgac ggacagccgg tataaaggga ccacctatga tgtggaacgg 4800gaaaaggaca tgatgctatg gctggaagga aagctgcctg ttccaaaggt cctgcacttt 4860gaacggcatg atggctggag caatctgctc atgagtgagg ccgatggcgt cctttgctcg 4920gaagagtatg aagatgaaca aagccctgaa aagattatcg agctgtatgc ggagtgcatc 4980aggctctttc actccatcga catatcggat tgtccctata cgaatagctt agacagccgc 5040ttagccgaat tggattactt actgaataac gatctggccg atgtggattg cgaaaactgg 5100gaagaagaca ctccatttaa agatccgcgc gagctgtatg attttttaaa gacggaaaag 5160cccgaagagg aacttgtctt ttcccacggc gacctgggag acagcaacat ctttgtgaaa 5220gatggcaaag taagtggctt tattgatctt gggagaagcg gcagggcgga caagtggtat 5280gacattgcct tctgcgtccg gtcgatcagg gaggatatcg gggaagaaca gtatgtcgag 5340ctattttttg acttactggg gatcaagcct gattgggaga aaataaaata ttatatttta 5400ctggatgaat tgttttagta cctagatgtg gcgcaacgat gccggcgaca agcaggagcg 5460caccgacttc ttccgcatca agtgttttgg ctctcaggcc gaggcccacg gcaagtattt 5520gggcaagggg tcgctggtat tcgtgcaggg caagattcgg aataccaagt acgagaagga 5580
cggccagacg gtctacggga ccgacttcat tgccgataag gtggattatc tggacaccaa 5640ggcaccaggc gggtcaaatc aggaataagg gcacattgcc ccggcgtgag tcggggcaat 5700cccgcaagga gggtgaatga atcggacgtt tgaccggaag gcatacaggc aagaactgat 5760cgacgcgggg ttttccgccg aggatgccga aaccatcgca agccgcaccg tcatgcgtgc 5820gccccgcgaa accttccagt ccgtcggctc gatggtccag caagctacgg ccaagatcga 5880gcgcgacagc gtgcaactgg ctccccctgc cctgcccgcg ccatcggccg ccgtggagcg 5940ttcgcgtcgt ctcgaacagg aggcggcagg tttggcgaag tcgatgacca tcgacacgcg 6000aggaactatg acgaccaaga agcgaaaaac cgccggcgag gacctggcaa aacaggtcag 6060cgaggccaag caggccgcgt tgctgaaaca cacgaagcag cagatcaagg aaatgcagct 6120ttccttgttc gatattgcgc cgtggccgga cacgatgcga gcgatgccaa acgacacggc 6180ccgctctgcc ctgttcacca cgcgcaacaa gaaaatcccg cgcgaggcgc tgcaaaacaa 6240ggtcattttc cacgtcaaca aggacgtgaa gatcacctac accggcgtcg agctgcgggc 6300cgacgatgac gaactggtgt ggcagcaggt gttggagtac gcgaagcgca cccctatcgg 6360cgagccgatc accttcacgt tctacgagct ttgccaggac ctgggctggt cgatcaatgg 6420ccggtattac acgaaggccg aggaatgcct gtcgcgccta caggcgacgg cgatgggctt 6480cacgtccgac cgcgttgggc acctggaatc ggtgtcgctg ctgcaccgct tccgcgtcct 6540ggaccgtggc aagaaaacgt cccgttgcca ggtcctgatc gacgaggaaa tcgtcgtgct 6600gtttgctggc gaccactaca cgaaattcat atgggagaag taccgcaagc tgtcgccgac 6660ggcccgacgg atgttcgact atttcagctc gcaccgggag ccgtacccgc tcaagctgga 6720aaccttccgc ctcatgtgcg gatcggattc cacccgcgtg aagaagtggc gcgagcaggt 6780cggcgaagcc tgcgaagagt tgcgaggcag cggcctggtg gaacacgcct gggtcaatga 6840tgacctggtg cattgcaaac gctagggcct tgtggggtca gttccggctg ggggttcagc 6900agccagcgct ttactggcat ttcaggaaca agcgggcact gctcgacgca cttgcttcgc 6960tcagtatcgc tcgggacgca cggcgcgctc tacgaactgc cgataaacag aggattaaaa 7020ttgacaattg tgattaaggc tcagattcga cggcttggag cggccgacgt gcaggatttc 7080cgcgagatcc gattgtcggc cctgaagaaa gctccagaga tgttcgggtc cgtttacgag 7140cacgaggaga aaaagcccat ggaggcgttc gctgaacggt tgcgagatgc cgtggcattc 7200ggcgcctaca tcgacggcga gatcattggg ctgtcggtct tcaaacagga ggacggcccc 7260aaggacgctc acaaggcgca tctgtccggc gttttcgtgg agcccgaaca gcgaggccga 7320ggggtcgccg gtatgctgct gcgggcgttg ccggcgggtt tattgctcgt gatgatcgtc 7380cgacagattc caacgggaat ctggtggatg cgcatcttca tcctcggcgc acttaatatt 7440tcgctattct ggagcttgtt gtttatttcg gtctaccgcc tgccgggcgg ggtcgcggcg 7500acggtaggcg ctgtgcagcc gctgatggtc gtgttcatct ctgccgctct gctaggtagc 7560ccgatacgat tgatggcggt cctgggggct atttgcggaa ctgcgggcgt ggcgctgttg 7620gtgttgacac caaacgcagc gctagatcct gtcggcgtcg cagcgggcct ggcgggggcg 7680gtttccatgg cgttcggaac cgtgctgacc cgcaagtggc aacctcccgt gcctctgctc 7740acctttaccg cctggcaact ggcggccgga ggacttctgc tcgttccagt agctttagtg 7800tttgatccgc caatcccgat gcctacagga accaatgttc tcggcctggc gtggctcggc 7860ctgatcggag cgggtttaac ctacttcctt tggttccggg ggatctcgcg actcgaacct 7920acagttgttt ccttactggg ctttctcagc cccagatctg gggtcgatca gccggggatg 7980catcaggccg acagtcggaa cttcgggtcc ccgacctgta ccattcggtg agcaatggat 8040aggggagttg atatcgtcaa cgttcacttc taaagaaata gcgccactca gcttcctcag 8100cggctttatc cagcgatttc ctattatgtc ggcatagttc tcaagatcga cagcctgtca 8160cggttaagcg agaaatgaat aagaaggctg ataattcgga tctctgcgag ggagatgata 8220tttgatcaca ggcagcaacg ctctgtcatc gttacaatca acatgctacc ctccgcgaga 8280tcatccgtgt ttcaaacccg gcagcttagt tgccgttctt ccgaatagca tcggtaacat 8340gagcaaagtc tgccgcctta caacggctct cccgctgacg ccgtcccgga ctgatgggct 8400
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tgttagagtt gggttgaatg agatatacgt tcaagtgaat ggcataccgt tctcgagtaa 11280ggatgaccta cccattcttg agacaaatgt tacattttag tatcagagta aaatgtgtac 11340ctataactca aattcgattg acatgtatcc attcaacata aaattaaacc agcctgcacc 11400tgcatccaca tttcaagtat tttcaaaccg ttcggctcct atccaccggg tgtaacaaga 11460cggattccga atttggaaga ttttgactca aattcccaat ttatattgac cgtgactaaa 11520tcaactttaa cttctataat tctgattaag ctcccaattt atattcccaa cggcactacc 11580tccaaaattt atagactctc atcccctttt aaaccaactt agtaaacgtt ttttttttta 11640attttatgaa gttaagtttt taccttgttt ttaaaaagaa tcgttcataa gatgccatgc 11700cagaacatta gctacacgtt acacatagca tgcagccgcg gagaattgtt tttcttcgcc 11760acttgtcact cccttcaaac acctaagagc ttctctctca cagcacacac atacaatcac 11820atgcgtgcat gcattattac acgtgatcgc catgcaaatc tcctttatag cctataaatt 11880aactcatccg cttcactctt tactcaaacc aaaactcatc aatacaaaca agattaaaaa 11940catacacgag gatccactag tatgtctgct gctgctgata gattaaactt aacttccggc 12000cacttgaatg ctggtagaaa gagaagttcc tcttctgttt ctttgaaggc tgccgaaaag 12060cctttcaagg ttactgtgat tggatctggt aactggggta ctactattgc caaggtggtt 12120gccgaaaatt gtaagggata cccagaagtt ttcgctccaa tagtacaaat gtgggtgttc 12180gaagaagaga tcaatggtga aaaattgact gaaatcataa atactagaca tcaaaacgtg 12240aaatacttgc ctggcatcac tctacccgac aatttggttg ctaatccaga cttgattgat 12300tcagtcaagg atgtcgacat catcgtcttc aacattccac atcaattttt gccccgtatc 12360tgtagccaat tgaaaggtca tgttgattca cacgtcagag ctatctcctg tctaaagggt 12420tttgaagttg gtgctaaagg tgtccaattg ctatcctctt acatcactga ggaactaggt 12480attcaatgtg gtgctctatc tggtgctaac attgccactg aagtcgctca agaacactgg 12540tctgaaacaa cagttgctta ccacattcca aaggatttca gaggcgaggg caaggacgtc 12600gaccataagg ttctaaaggc cttgttccac agaccttact tccacgttag tgtcatcgaa 12660gatgttgctg gtatctccat ctgtggtgct ttgaagaacg ttgttgcctt aggttgtggt 12720ttcgtcgaag gtctaggctg gggtaacaac gcttctgctg ccatccaaag agtcggtttg 12780ggtgagatca tcagattcgg tcaaatgttt ttcccagaat ctagagaaga aacatactac 12840caagagtctg ctggtgttgc tgatttgatc accacctgcg ctggtggtag aaacgtcaag 12900gttgctaggc taatggctac ttctggtaag gacgcctggg aatgtgaaaa ggagttgttg 12960aatggccaat ccgctcaagg tttaattacc tgcaaagaag ttcacgaatg gttggaaaca 13020tgtggctctg tcgaagactt cccattattt gaagccgtat accaaatcgt ttacaacaac 13080tacccaatga agaacctgcc ggacatgatt gaagaattag atctacatga agattagctc 13140gacgaatttc cccgatcgtt caaacatttg gcaataaagt ttcttaagat tgaatcctgt 13200tgccggtctt gcgatgatta tcatataatt tctgttgaat tacgttaagc atgtaataat 13260taacatgtaa tgcatgacgt tatttatgag atgggttttt atgattagag tcccgcaatt 13320atacatttaa tacgcgatag aaaacaaaat atagcgcgca aactaggata aattatcgcg 13380cgcggtgtca tctatgttac tagatcggga attcagatcg gctgagtggc tccttcaacg 13440ttgcggntct gtcagtncca aacgtaaaac gggttggtcc gcggnatcgg gcggggggcc 13500ttaaccgtgn actnccntna ttnctccggc ttcantgnnn agaattggnc ntttccccgn 13560cntcagttta aactatcagg tgtttgacag gatatatttg gcgggtaaac ctaaganaaa 13620agagcgttta ttagaataat cggatattta aaagggccgn gaaaaggttt atcccttccg 13680tccatttgta tgngcatgcc naccaccagg gttcccca 13718<210>37<211>1254<212>DNA<213>Emericella nidulans
<220>
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Set Pro Ser Ala Ser Thr Asp Asn Ile Leu His Phe Glu His Lys Asp210 215 220gtt tcg ggt caa ctt tcg cgg gta aag cta cag gct cta cct tcc gaa720Val Ser Gly Gln Leu Ser Arg Val Lys Leu Gln Ala Leu Pro Ser Glu225 230 235 240ttt cct ccc atc gac cat gcc ctt ctc aag tcg cta ttc cac cgt cct768Phe Pro Pro Ile Asp His Ala Leu Leu Lys Ser Leu Phe His Arg Pro245 250 255tac ttc cat att ggt gtg gta agt gac gtc gca ggt gtt tcg tta gga816Tyr Phe His Ile Gly Val Val Ser Asp Val Ala Gly Val Ser Leu Gly260 265 270ggt gcc ctt aag aat gtc gtt gct gtc gcg gca ggg tgg gtt gtg ggc864Gly Ala Leu Lys Asn Val Val Ala Val Ala Ala Gly Trp Val Val Gly275 280 285aaa gga tgg gga gac aat gcg aag gct gca att atg cga gtt ggg ctt912Lys Gly Trp Gly Asp Asn Ala Lys Ala Ala Ile Met Arg Val Gly Leu290 295 300ttg gaa atg gtg aag ttc ggc gaa cag ttt ttc ggt gct acc atc aac960Leu Glu Met Val Lys Phe Gly Glu Gln Phe Phe Gly Ala Thr Ile Asn305 310 315 320act cgc acc ttc act gaa gaa agt gct ggt gtt gcc gat cta atc acg1008Thr Arg Thr Phe Thr Glu Glu Ser Ala Gly Val Ala Asp Leu Ile Thr325 330 335agt tgc agt ggc gga cga aac ttc cgc tgc gca aag ctt agc att gaa1056Ser Cys Ser Gly Gly Arg Asn Phe Arg Cys Ala Lys Leu Ser Ile Glu340 345 350aga aac cag ccg att gag aaa atc gag gag aca gag ttg aac ggc cag1104ArgAsn Gln Pro Ile Glu Lys Ile Glu Glu Thr Glu Leu Asn Gly Gln355 360 365aag ctg caa ggc act ttg act gca gtc gaa gtc aac agt ttc ttg aaa1152Lys Leu Gln Gly Thr Leu Thr Ala Val Glu Val Asn Ser Phe Leu Lys370375 380aag caa ggt tta gaa gaa gag ttc cca ttg ttt act gca gtc tac cga1200Lys Gln Gly Leu Glu Glu Glu Phe Pro Leu Phe Thr Ala Val Tyr Arg385 390 395 400gtt ctt caa ggc acc atg tct gtg gac gag att cct tct ttc att gag1248Val Leu Gln Gly Thr Met Ser Val Asp Glu Ile Pro Ser Phe Ile Glu405 410 415cgg taa 1254Arg<210>38<211>417<212>PRT<213>Emericella nidulans<400>38
Met Gly Ser Leu Gly Pro Tyr Lys Gln Lys His Lys Val Thr Val Val1 5 10 15Gly Ser Gly Asn Trp Gly Thr Ala Ile Ala Lys Ile Val Ala Glu Asn20 25 30Thr Ala Ser Asn Pro Ala Val Phe Glu Lys Asp Val Gln Met Trp Val35 40 45Phe Glu Glu Lys Val Glu Ile Pro Lys Ser Ser Lys His Tyr Asp Pro50 55 60Ala Ser Ser Leu Cys Gln Gly Pro Gln Asn Leu Thr Asp Ile Ile Asn65 70 75 80His Thr His Glu Asn Ile Lys Tyr Leu Pro Gly Ile Thr Leu Pro Glu85 90 95Asn Leu Ile Ala Asn Pro Ser Leu Val Asp Ala Val Gln Asp Ser Thr100 105 110Ile Leu Val Phe Asn Leu Pro His Gln Phe Ile Ile Asn Ile Cys Glu115 120 125Gln Ile Lys Gly Lys Ile Val Pro Tyr Ala Arg Gly Ile Ser Cys Ile130 135 140Lys Gly Val Asp Val Asn Glu Glu Gly Val His Leu Phe Ser Glu Thr145 150 155 160Ile Gly Lys Ile Leu Gly Ile Tyr Cys Gly Ala Leu Ser Gly Ala Asn165 170 175Ile Ala Asn Glu Val Ala Gln Glu Lys Trp Ser Glu Ser Ser Ile Gly180 185 190Tyr Asp Pro Pro His Phe Asp Ser Lys Ala Pro Ser Pro Pro Asn Arg195 200 205Ser Pro Ser Ala Ser Thr Asp Asn Ile Leu His Phe Glu His Lys Asp210 215220Val Ser Gly Gln Leu Ser Arg Val Lys Leu Gln Ala Leu Pro Ser Glu225 230 235 240Phe Pro Pro Ile Asp His Ala Leu Leu Lys Ser Leu Phe His Arg Pro245 250 255Tyr Phe His Ile Gly Val Val Ser Asp Val Ala Gly Val Ser Leu Gly260 265 270Gly Ala Leu Lys Asn Val Val Ala Val Ala Ala Gly Trp Val Val Gly275 280 285Lys Gly Trp Gly Asp Asn Ala Lys Ala Ala Ile Met Arg Val Gly Leu290 295 300Leu Glu Met Val Lys Phe Gly Glu Gln Phe Phe Gly Ala Thr Ile Asn305 310 315 320Thr Arg Thr Phe Thr Glu Glu Ser Ala Gly Val Ala Asp Leu Ile Thr325 330 335Ser Cys Ser Gly Gly Arg Asn Phe Arg Cys Ala Lys Leu Ser Ile Glu340 345 350Arg Asn Gln Pro Ile Glu Lys Ile Glu Glu Thr Glu Leu Asn Gly Gln355 360 365Lys Leu Gln Gly Thr Leu Thr Ala Val Glu Val Asn Ser Phe Leu Lys
370 375 380Lys Gln Gly Leu Glu Glu Glu Phe Pro Leu Phe Thr Ala Val Tyr Arg385 390 395 400Val Leu Gln Gly Thr Met Ser Val Asp Glu Ile Pro Ser Phe Ile Glu405 410 415Arg<2l0>39<211>999<212>DNA<213>漢遜德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)<220>
<221>CDS<222>(1)..(996)<223>編碼G3PDH(部分)<400>39gga tct ggt aac tgg ggt act gct gtt gct aag atc gta tct gaa aac48Gly Ser Gly Asn Trp Gly Thr Ala Val Ala Lys Ile Val Ser Glu Asn1 5 10 15acg gct gaa aaa cca gaa gtg ttc gaa aag caa gtg aac atg tgg gtt96Thr Ala Glu Lys Pro Glu Val Phe Glu Lys Gln Val Asn Met Trp Val20 25 30ttt gaa gaa gaa gtt gac gga caa aag ttg act gaa atc atc aac gcc144Phe Glu Glu Glu Val Asp Gly Gln Lys Leu Thr Glu Ile Ile Asn Ala35 40 45aaa cac gaa aac gtt aag tac ttg cca gaa gtc aag ttg ccg gaa aac192Lys His Glu Asn Val Lys Tyr Leu Pro Glu Val Lys Leu Pro Glu Asn50 55 60ttg gtt gca aac cca gac gtt gtt gac act gtc aag gat gca gac tta240Leu Val Ala Asn Pro Asp Val Val Asp Thr Val Lys Asp Ala Asp Leu65 70 75 80tta att ttt aac att cca cat caa ttc tta cca aga gtg tgt aag caa288Leu Ile Phe Asn Ile Pro His Gln Phe Leu Pro Arg Val Cys Lys Gln85 90 95ttg gtt ggc cat gtc aag cca tct gcc aga gcc atc tcc tgt ttg aag336Leu Val Gly His Val Lys Pro Ser Ala Arg Ala Ile Ser Cys Leu Lys100 105 110ggt ttg gaa gtt ggc cca gaa ggt tgt aag ttg tta tcg caa tct atc384Gly Leu Glu Val Gly Pro Glu Gly Cys Lys Leu Leu Ser Gln Ser Ile115 120 125aac gat act tta ggt gtc cac tgt ggt gtc tta tct ggt gcc aac att432Asn Asp Thr Leu Gly Val His Cys Gly Val Leu Ser Gly Ala Asn Ile130 135 140
gcc aac gaa gtt gcc aga gaa aga tgg tct gaa acc acc att gcc tac480Ala Asn Glu Val Ala Arg Glu Arg Trp Ser Glu Thr Thr Ile Ala Tyr145 150 155 160aac att cca gaa gat ttc aga ggt aag ggt aga gat atc gac gaa tac528Asn Ile Pro Glu Asp Phe Arg Gly Lys Gly Arg Asp Ile Asp Glu Tyr165 170 175gtc tta aag caa tta ttc cac aga acc tac ttc cat gtc aga gtc atc576Val Leu Lys Gln Leu Phe His Arg Thr Tyr Phe His Val Arg Val Ile180 185 190aac gac atc ata ggt gct tct ttc gct ggt gct ttg aag aat gtt gtt624Asn Asp Ile Ile Gly Ala Ser Phe Ala Gly Ala Leu Lys Asn Val Val195 200 205gcc tgt gct gtt ggt ttc gtt atc ggt gcc ggc tgg ggt gac aac gct672Ala Cys Ala Val Gly Phe Val Ile Gly Ala Gly Trp Gly Asp Asn Ala210 215 220aag gcc gct atc atg aga atc ggt atc aga gaa atc atc cac ttt gcc720Lys Ala Ala Ile Met Arg Ile Gly Ile Arg Glu Ile Ile His Phe Ala225 230 235 240tct tac tac caa aag ttc ggt gtc aag ggt cca gct cca gaa tcc act768Ser Tyr Tyr Gln Lys Phe Gly Val Lys Gly Pro Ala Pro Glu Ser Thr245 250 255act ttc act gag gaa tct gcc ggt gtc gct gac tta atc acc act tgt816Thr Phe Thr Glu Glu Ser Ala Gly Val Ala Asp Leu Ile Thr Thr Cys260 265 270tcc ggt ggt aga aat gtc aag gtt gct aga tac atg att gaa aac aac864Ser Gly Gly Arg Asn Val Lys Val Ala Arg Tyr Met Ile Glu Asn Asn275 280 285gtt gac gct tgg gaa gcc gaa aag att gtc tta aag ggt caa tct tct912Val Asp Ala Trp Glu Ala Glu Lys Ile Val Leu Lys Gly Gln Ser Ser290 295 300caa ggt atc tta act gcc aag gaa gtc cac gaa ttg tta act aac tac960Gln Gly Ile Leu Thr Ala Lys Glu Val His Glu Leu Leu Thr Asn Tyr305 310 315 320aac tta tcg aat gaa ttc cca tta ttt gaa gcc gta tac999Asn Leu Ser Asn Glu Phe Pro Leu Phe Glu Ala Val325 330<210>40<211>332<212>PRT<213>漢遜德巴利酵母<400>40GIy Ser Gly Asn Trp Gly Thr Ala Val Ala Lys Ile Val Ser Glu Asn1 5 10 15Thr Ala Glu Lys Pro Glu Val Phe Glu Lys Gln Val Asn Met Trp Val20 25 30
Phe Glu Glu Glu Val Asp Gly Gln Lys Leu Thr Glu Ile Ile Asn Ala35 40 45Lys His Glu Asn Val Lys Tyr Leu Pro Glu Val Lys Leu Pro Glu Asn50 55 60Leu Val Ala Asn Pro Asp Val Val Asp Thr Val Lys Asp Ala Asp Leu65 70 75 80Leu Ile Phe Asn Ile Pro His Gln Phe Leu Pro Arg Val Cys Lys Gln85 90 95Leu Val Gly His Val Lys Pro Ser Ala Arg Ala Ile Ser Cys Leu Lys100 105 110Gly Leu Glu Val Gly Pro Glu Gly Cys Lys Leu Leu Ser Gln Ser Ile115 120 125Asn Asp Thr Leu Gly Val His Cys Gly Val Leu Ser Gly Ala Asn Ile130 135 140Ala Asn Glu Val Ala Arg Glu Arg Trp Ser Glu Thr Thr Ile Ala Tyr145 150 155 160Asn Ile Pro Glu Asp Phe Arg Gly Lys Gly Arg Asp Ile Asp Glu Tyr165 170 175Val Leu Lys Gln Leu Phe His Arg Thr Tyr Phe His Val Arg Val Ile180 185 190Asn Asp Ile Ile Gly Ala Ser Phe Ala Gly Ala Leu Lys Asn Val Val195 200 205Ala Cys Ala Val Gly Phe Val Ile Gly Ala Gly Trp Gly Asp Asn Ala210 215 220Lys Ala Ala Ile Met Arg Ile Gly Ile Arg Glu Ile Ile His Phe Ala225 230 235 240Ser Tyr Tyr Gln Lys Phe Gly Val Lys Gly Pro Ala Pro Glu Ser Thr245 250 255Thr Phe Thr Glu Glu Ser Ala Gly Val Ala Asp Leu Ile Thr Thr Cys260 265 270Ser Gly Gly Arg Asn Val Lys Val Ala Arg Tyr Met Ile Glu Asn Asn275 280 285Val Asp Ala Trp Glu Ala Glu Lys Ile Val Leu Lys Gly Gln Ser Ser290 295 300Gln Gly Ile Leu Thr Ala Lys Glu Val His Glu Leu Leu Thr Asn Tyr305 310 315 320Asn Leu Ser Asn Glu Phe Pro Leu Phe Glu Ala Val325 330
權利要求
1.提高植物生物體或其組織、器官、部分、細胞或繁殖材料中的總含油量的方法，包括a)使酵母甘油-3-磷酸脫氫酶在所述植物生物體或其組織、器官、部分、細胞或繁殖材料中轉基因表達，和b)選擇植物生物體，其中，與起始生物體相比，所述植物生物體或其組織、器官、部分、細胞或繁殖材料中的總含油量得到提高。
2.權利要求1的方法，其中甘油-3-磷酸脫氫酶來自選自以下屬的酵母隱球酵母屬、球擬酵母屬、瓶形酵母屬、酒香酵母屬、假絲酵母屬、克勒克酵母屬、三角酵母屬、絲孢酵母屬、紅酵母屬、擲孢酵母屬、布勒彈孢酵母屬、酵母屬、德巴利酵母屬、油脂酵母屬、漢遜酵母屬、擬內孢霉屬、畢赤酵母屬和有孢漢遜酵母屬。
3.權利要求1或2的方法，其中甘油-3-磷酸脫氫酶來自選自以下種的酵母釀酒酵母、巴斯德畢赤酵母、多形漢遜酵母、粟酒裂殖酵母、乳酸克魯維酵母、Zygosaccharomyces rouxii、Yarrowia lipolitica、Emericellanidulans、構巢曲霉、漢遜德巴利酵母和漢遜有孢圓酵母。
4.權利要求1-3任一項的方法，其中所述甘油-3-磷酸脫氫酶使用NADH作為共底物將磷酸二羥丙酮轉化成甘油-3-磷酸，而且其具有包含至少一個選自下組的序列基序的肽序列i) GSGNWGT(A/T)IAKii) CG(V/A)LSGAN(L/I/V)AXE(V/I)Aiii)(L/V)FXRPYFXV。
5.權利要求1-4任一項的方法，其中所述甘油-3-磷酸脫氫酶使用NADH作為共底物將磷酸二羥丙酮轉化成甘油-3-磷酸，而且其具有包含至少一個選自下組的序列基序的肽序列iv) GSGNWGTTIAKV(V/I)AENv) NT(K/R)HQNVKYLPvi) D(I/V)LVFN(I/V)PHQFLvii) RA(I/V)SCLKGFEviii)CGALSGANLA(P/T)EVAix) LFHRPYFHVx) GLGEII(K/R)FG。
6.權利要求4或5的方法，其中所述甘油-3-磷酸脫氫酶還包含至少一個選自下組的序列基序xi) H(E/Q)NVKYLxii) (D/N)(I/V)(L/I)V(F/W)(V/N)(L/I/V)PHQF(V/L/I)xiii)(A/G)(I/V)SC(L/I)KGxiv) G(L/M)(L/G)E(M/I)(I/Q)(R/K/N)F(G/S/A)。
7.權利要求1-6任一項的方法，其中酵母甘油-3-磷酸脫氫酶是a)SEQ ID NO2、4、5、7、9、11、12、14、16、38或40的序列，或b)與序列SEQ ID NO2具有至少60％同一性的a)的功能等價物。
8.權利要求1-7任一項的方法，其中植物是油料作物。
9.權利要求1-8任一項的方法，其中植物種子中的總含油量得到提高。
10.包含處于啟動子控制下的編碼權利要求2-7任一項中定義的酵母甘油-3-磷酸脫氫酶的核酸序列的轉基因表達盒，其中所述啟動子在植物生物體或其組織、器官、部分或細胞中發揮功能。
11.權利要求10的轉基因表達盒，其中編碼甘油-3-磷酸脫氫酶的核酸序列是a)序列SEQ ID NO1、3、6、8、10、13、15、37或39，或b)根據遺傳密碼的簡并性，由序列SEQ ID NO1、3、6、8、10、13、15、37或39衍生的序列，或c)與序列SEQ ID NO1具有至少60％同一性的序列。
12.權利要求10或11的轉基因表達盒，其中啟動子是種子特異性啟動子。
13.包含權利要求10-12任一項的表達盒的轉基因載體。
14.包含權利要求2-7任一項中定義的酵母甘油-3-磷酸脫氫酶或權利要求10-12任一項中定義的表達盒或權利要求13中定義的載體的轉基因植物生物體或其組織、器官、部分、細胞或繁殖材料。
15.權利要求14的轉基因植物生物體，其中所述植物生物體是選自下組的油料作物琉璃苣、蕓苔、歐洲油菜、蕪菁、大麻、紅花、椰子、海甘藍、萼距花屬物種、油棕、美洲油棕、大豆、陸地棉、海島棉、草棉、向日葵、亞麻、月見草、油橄欖、稻、蓖麻、胡麻、小麥屬物種、玉蜀黍、胡桃和杏。
16.權利要求14或15的轉基因植物生物體或其組織、器官、部分、細胞或繁殖材料用于生產油、脂肪、游離脂肪酸或其衍生物的用途。
全文摘要
本發明涉及通過表達優選來自釀酒酵母的酵母甘油－3－磷酸脫氫酶(G3PDH)來提高植物，優選植物種子的含油量的方法。本發明還涉及用于在植物，優選植物種子中表達酵母G3PDH的表達構建體、表達酵母G3PDH的轉基因植物、以及所述轉基因植物用于生產食品、飼料、種子、藥物或精細化學藥品的用途，特別是用于生產油的用途。
文檔編號C12N9/04GK1653174SQ03810383
公開日2005年8月10日 申請日期2003年5月6日 優先權日2002年5月8日
發明者A·倫茨, J·鮑爾, 奈杰爾 M·施蒂特, R·M·茨倫納, P·蓋根貝格爾, H·維格奧拉斯 申請人:巴斯福植物科學有限公司