專利名稱：利用嗜熱真菌生產熱穩定糖化酶的方法
(一)發明領域本發明涉及利用嗜熱真菌(Thermomyces lanuginosus)生產熱穩定糖化酶的方法。
(二)發明背景糖化酶是一種具有外切活性的淀粉酶，可將淀粉、糊精和糖原水解為葡萄糖，是淀粉轉化為葡萄糖過程中的主要酶類之一，已廣泛應用于輕工、醫藥、環保、食品加工、飲料工業等方面，受到業內的高度重視，被認為是最有應用潛力的酶制劑之一。目前國內外糖化酶主要由嗜溫真菌生產，它們產生的糖化酶熱穩定差，酶活力低；另一方面，用嗜溫真菌發酵生產糖化酶，普遍存在雜菌污染，使糖化酶的生產和應用受到很大限制。

發明內容本發明的目的是提供利用嗜熱真菌生產熱穩定糖化酶的一種方法。用該方法生產的熱穩定糖化酶，不僅生產成本低、酶回收率高、無環境污染，而且可以有效防止常溫發酵條件下普遍存在的雜菌污染問題。嗜熱真菌是真核生物生長上限溫度最高的一種真菌。發明人從嗜熱真菌中經篩選獲得高產熱穩定糖化酶的優良菌株。該嗜熱真菌菌株產生的熱穩定糖化酶最適作用溫度70℃，最適作用pH5-7。在60℃條件下24小時不喪失活性，70℃的半衰期45分鐘，80℃的半衰期20分鐘，是目前發現的熱穩定最高的糖化酶，比國內外市場上應用的糖化酶產品有高的熱穩定性，具研究開發價值。其次，利用嗜熱真菌發酵生產糖化酶是在高溫條件(45-50℃)下進行，可以有效地防止雜菌的污染，在控制發酵污染方面具有重要意義。
本發明采取下列技術來實現(1)利用嗜熱真菌的分離技術，真菌經過篩選獲得高產熱穩定糖化酶的優良菌株；(2)采用玉米粉為主要碳源、酵母膏為主要氮源制成液體培養基；(3)將產酶菌株接入含有液體培養基的發酵罐中，在45-50℃、pH5-7條件下發酵72小時；(4)發酵液過濾后，經硫酸銨沉淀、透析脫鹽后，得到濃縮酶液，最終酶活50000單位/毫升。
(四)發明效果由于采用嗜熱真菌優良菌株生產熱穩定糖化酶，優良菌株糖化酶產量比原始菌株提高12％；高溫有效地防止了雜菌污染。將該糖化酶用于淀粉的糖化，酶用量減少21％，糖化時間縮短，降低了成本，提高了效益。
(五)發明附1嗜熱真菌生產熱穩定糖化酶工藝流程中1是準備菌種，2是組配培養基，3是發酵，4是酶液濃縮，5是成品。
(六)發明最佳實施例菌種嗜熱真菌優良菌株培養基玉米粉10％，酵母膏0.5％，磷酸氫二鉀0.1％，硫酸鎂0.05％，自來水配制。
發酵條件發酵罐10升，溫度45-50℃，pH5-7，發酵周期72小時，發酵液過濾得到原酶液。
酶液濃縮原酶液經硫酸銨沉淀、透析脫鹽后，得到濃縮酶液，最終酶活50000單位/毫升。
將菌種接種到PDA平板上45-50℃培養7天后，制成孢子懸浮液(孢子數106/毫升)，然后將孢子懸浮液接入到含上述培養基的10升發酵罐中，在45-50℃條件下，通風10.8，攪拌100-120轉/分鐘，發酵72小時，發酵液在4℃下1500g離心15分鐘，上清液為原酶液。原酶液加固體硫酸銨至飽和度80％，靜置24小時后，在4℃條件下10000g離心30分鐘，棄上清，沉淀加50mM磷酸緩沖液(pH7.0)溶解，利用透析袋在50mM磷酸緩沖液(pH7.0)中透析24小時(中間更換一次緩沖液)后，4℃ 10000g離心15分鐘，棄沉淀，上清液用50mM磷酸緩沖液(pH7.0)和1％苯甲酸鈉調濃度，使酶液糖化酶活性單位達到50000單位/毫升，苯甲酸鈉濃度為0.1％。
嗜熱真菌優良菌株熱穩定糖化酶進行淀粉糖化，糖化時間縮短。傳統的淀粉糖化過程由于使用的糖化酶熱穩定性差，糖化的溫度必須從90℃降低到55-60℃后，才能加糖化酶。利用該熱穩定糖化酶，糖化的溫度從90℃降低到70℃以后，就可加入糖化酶進行糖化，加之高溫條件糖化速度加快，因此糖化時間縮短。另一方面，由于該糖化酶的熱穩定性，克服了高溫失活的困難，所需酶量減少21％，降低了成本，提高了效益。
權利要求
1.一種利用嗜熱真菌生產熱穩定糖化酶的方法，其特征在于真菌培養基的成份及其重量比為玉米粉10％，酵母膏0.5％，磷酸氫二鉀0.1％，硫酸鎂0.05％，用自來水配制。
2.根據權利要求1所述的一種利用嗜熱真菌生產熱穩定糖化酶的方法，其特征在于培養基的發酵溫度為45-50℃，PH5-7，發酵時間72小時，將發酵液過濾后獲得原酶液。
3.根據權利要求1所述的一種利用嗜熱真菌生產熱穩定糖化酶的方法，其特征在于將原酶液經硫酸銨沉淀、透析脫鹽后獲得濃縮酶液。
全文摘要
本發明涉及嗜熱真菌(Thermomyces lanuginosus)熱穩定糖化酶的生產方法，其生產工藝是嗜熱真菌經過紫外線和亞硝基胍誘變等處理，篩選獲得高產熱穩定糖化酶的優良菌株。將嗜熱真菌優良菌株接入含有玉米粉為主要碳源、酵母膏為主要氮源制成液體培養基的發酵罐中，在45－50℃、pH5－7的條件下發酵72小時。發酵液過濾后，經硫酸銨沉淀、透析脫鹽后，得到濃縮酶液，最終酶活50000單位/毫升。應用上述酶制劑進行淀粉糖化生產，糖化時間縮短，酶量減少21％，效益顯著。
文檔編號C12N1/14GK1456667SQ0311256
公開日2003年11月19日 申請日期2003年6月11日 優先權日2003年6月11日
發明者李多川 申請人:山東農業大學