專利名稱：高純度低聚木糖的酶法制備的制作方法
技術領域：
本發明涉及用麩皮、蔗渣或玉米芯為原料，堿法制備的精制木聚糖作底物，用假單胞菌Pseudomonas sp.XUN024CGMCCNo.0458發酵生產的木聚糖酶，進行酶轉化制造低聚木糖的方法。
低聚木糖(Xylooligosaccharide)是功能性低聚糖中的一種。所謂低聚糖，又稱寡糖(oligosaccharide)，它是由2-10個單糖分子通過糖苷鍵構成的聚合物。近20年來功能性低聚糖的研究開發及其產業化發展迅猛，這一類產品作為雙歧桿菌生長促進因子而廣泛應用于食品和飼料生產中。已工業化的功能性低聚糖有十多種。亞洲除日本外，韓國和我國，包括臺灣省也已有一些功能性低聚糖品種生產。歐洲國家對此研究很活躍，美國企業界近年對低聚糖也表示出很大興趣。美國在阿斯巴甜配制的低熱量飲料中，配以功能性低聚糖，以改善飲料的口感，并增加雙歧菌的增殖效果。
低聚木糖以其優異的特性口感好類似于蔗糖、酸穩定性和熱穩定性好、黏度低、降低水分活度、防止凍結等，而有利于食品工業加工；非消化性、整腸功能顯著、服用量少(每人每日0.7g)等，使能在眾多低聚糖產品中占有重要地位。尤其是對雙歧桿菌增殖效果，優于其他功能性低聚糖。人體口服試驗證明，每日攝入量0.7g，大腸中雙歧菌比例從攝入前8.5％，兩周后增加到17.9％，三周后增加到26.2％。與此對照，達到相當的雙歧菌增殖比例所需低聚異麥芽糖或低聚果糖的每日攝入量為10-15g，和7-8g。因此它在目前日本低聚糖市場上價格最高，是低聚異麥芽糖16倍，低聚果糖的6倍。
日本市場的低聚木糖產品有三種規格木寡糖70(液體，含低聚木糖70％，其他糖類30％，價格2500日元/公斤)；木寡糖35(粉末，含低聚木糖35％，其他糖類65％)；木寡糖20(粉末，含低聚木糖20％，其他糖類80％)。產品作為食品配料應用于乳酸飲料，巧克力和黑醋調味料等制成品的生產。
低聚木糖的制備方法有以下幾種1.化學方法降解，如用酸水解法(Mitsuish Y.；Agric.Biol.Chem，1988，52921-927)；2.物理方法降解，如熱水抽提(JP62281890A2)包括蒸汽壓力滲透法(JP6197800A2)、微波法(JP1224384A2)等；3.生物降解法或酶法，酶法制備主要是利用微生物的木聚糖酶系，酶解植物原料中的半纖維素即木聚糖，得到以木二糖、木三糖為主成分的低聚木糖產物。
物理、化學方法降解速度難以控制，或精制工藝繁瑣，得率低，不適合工業化生產。酶法制備是研究最多，也是更為實用的方法。酶法制備的關鍵是高活力、且具有合理酶系的木聚糖酶。
早期的木聚糖酶研究主要是用于飼料、造紙、紡織助劑等。國內外研究報道能產木聚糖酶的微生物有黑曲霉、海棗曲霉、里氏木霉、綠色木霉、球毛殼霉、微紫青霉、宛氏擬青霉、頂青霉、嗜熱芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、假單孢菌等。
木聚糖酶是一類復合酶系，主要包含內切-β-木聚糖酶，端切木聚糖酶，β-木糖苷酶等。不同來源的酶系組分有所不同。當用于制備低聚木糖時，則希望酶解產物中不含或少含單糖(木糖)。希望得到僅從內部切β-1.4糖苷鍵的內切酶，得到酶解產物木二糖、木三糖，而希望沒有或減少從一端切β-1.4鍵的端切酶和水解木二糖、木三糖的木糖苷酶。早期的木聚糖酶研究注重其酶活，希望酶解徹底，而不注重酶系。目前研究或報道的菌株所產的木聚糖酶，用于酶解木聚糖時都還產生較高的木糖、葡萄糖等組分。
入江利夫等的日本專利特開昭62-155095和JP02119790A2，報道了木聚糖分解物的制造方法和木二糖的制造方法。他們對得到以木二糖為主的木聚糖酶生產菌株的篩選作了大量工作。最終篩選了球毛殼霉(Chaetomiumgracil)菌株生產木聚糖酶，誘變后的菌株(Chaetomium gracil 1161固態發酵的酶活達到2,600U/g培養基，酶液用于水解木聚糖(樺木)所得產物中低聚木糖與木糖之比從誘變前的34∶66提高到72∶21。該項技術被用于低聚木糖的工業化生產，由新日本化學株式會社生產木聚糖酶，三得利公司生產低聚木糖產品。
其他關于低聚木糖的研究如野口(NOGUCHI NORITAKA，JP06261750A2，JP10215866A2)等用芽孢桿菌Bacillus sp.生產的木聚糖酶制備低聚木糖。荒木(ARAKI TOSHIYOSHI，JP10295372A2)等用產堿桿菌(Alcaligenes)生產的β-1，3-木聚糖酶，它水解水聚糖的β-1，3鍵，而不作用木二糖β-1，4鍵，因而得到產物主要是木二到木六糖的低聚木糖。法國Patrice Pellerin等(Enzymic production of oligosaccharides from corncob xylan，Enzyme.Microb.Technol.，13617-621，1991)用梭狀芽孢桿菌(Clostridium)的木聚糖酶從玉米芯制備低聚木糖。其他國家的研究較少。
國內1997年蔡靜平等(微生物學通報，2491-94，1997)報道了真菌分解玉米芯生產低聚木糖的研究。最近還有一些研究者陸續報道了他們用黑曲霉、里氏木霉、頂青霉等真菌產生的木聚糖酶從玉米芯等的木聚糖來制備低聚木糖的研究。
本發明的目的是提供一種工藝簡單的酶轉化木聚糖制備低聚木糖的方法。所得到的酶轉化產物中低聚木糖含量達到90％以上，木糖、葡萄糖等單糖組分在10％以下。
本發明通過下列方案來實現(1)以本實驗室篩選并保藏的耐堿性木聚糖酶產生菌假單胞菌屬Pseudomonas sp.XY-11，為出發菌，經過紫外線和亞硝基胍誘變獲得變異菌株假單胞菌(Psudomonas sp.)XUN024-CGMCCNo.0458，作為產酶菌株；(2)菌株經斜面活化，發酵產酶，制備液體或固體酶制劑，作為酶源；(3)以麩皮、蔗渣或玉米芯為原料，堿法制備木聚糖，精制后作為酶轉化底物；(4)酶轉化生成低聚木糖，經脫色、脫鹽、濃縮，制成低聚木糖糖漿，或干燥成低聚木糖粉末。
菌種及其誘變從某造紙廠廢水溝取樣，經不斷的分離純化及篩選，獲得一株產木聚糖酶細菌XY-11，該菌株產酶穩定，酶活在產酶基礎培養基上搖瓶發酵36h酶活可達170U/ml。以該菌作為出發菌株。
菌種初步鑒定結果電鏡觀察該菌為革蘭氏染色陰性，短桿狀，細胞單個，無芽孢，無鞭毛。
在葡萄糖培養基上，此菌形成中間微凸的光滑的圓菌落，呈乳黃色，奶油狀，生長2天菌落直徑為1-1.5mm。在肉湯平板上，此菌為四周有環狀皺褶，中間微凹，菌落灰白略黃色，生長2天菌落直徑為2-3mm。
瓊脂穿刺培養生長緩慢，成直線，不擴散。肉湯瓊脂斜面上劃直線培養，菌苔呈絲狀，不向兩側擴散。肉湯表面培養時形成浮膜狀的菌膜，并產堿。
該菌嚴格好氧，在以簡單的有機化合物作為唯一的碳源和能源的無機培養基中就可以生長，能利用乙酸鹽、琥珀酸鹽、乳酸鹽和葡萄糖等碳源，硝酸鹽能作為氮源，該菌的生長溫度范圍較廣，在4-48℃之間可生長。在PH4.5C以下不生長，在PH9.4的條件下生長良好。部分生理生化特性研究結果見表1.1。
根據XY-11菌株的初步鑒定結果，對照《伯杰氏細菌鑒定手冊》和相關的一些細菌鑒定文獻，比較了其中對G-、桿狀細菌的描述(特別是對有無鞭毛及氧化酶實驗)，我們初步鑒定為假單胞菌屬(Pseudomonas sp.XY-11)。
表1.1 XY-11的部分生理生化特性
用Pseudomonas sp.XY-11為親株，按常規方法進行紫外線(UV)和亞硝基胍(NTG)誘變處理。紫外線照射時間為60s(致死率為83％)，從選擇性平板上挑取透明圈較大的若干株菌，采用基礎產酶培養基進行搖瓶復篩，其中產酶較高的第15號菌株命名為XUV015，比出發菌株的酶活高出50％左右(酶活250U/ml)，再采用NTG進行誘變，作用時間為30min的劑量(致死率為86％)進行誘變，從選擇性平板上挑取數十株透明圈較大的菌進行搖瓶復篩，篩選到一株酶活很高的菌株24號，其酶活較XUV015提高約42％，達到354U/ml，命名為XUN024。該菌株已于2000年6月19日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物保藏中心，保藏號為CGMCC No.0458。
產酶菌株的培養和發酵斜面培養配制含葡萄糖1-10％，蛋白胨0.5-5％，NaCl0.5-5％，瓊脂2-2.5％，其余為水，PH6-9的培養基，各組分的含量均為重量體積百分比，即g/100ml，下同。100-120℃滅菌，20-50分鐘，滅菌后冷卻、接種上面獲得的XUN024菌株，20-40℃培養10-40小時。
產酶培養配制含麩皮1-6％，(NH4)2SO40.4-1％，K2HPO40.2-1％，其余為水，PH6-9的培養基，裝液量20-100ml/250ml三角瓶，100-120℃滅菌，20-50分鐘，滅菌后冷卻、接種斜面培養物，接種量5-10％，20-40℃，旋轉式搖瓶柜轉速100-220r/m。XUN024在上述條件下進行搖瓶發酵試驗，24-36h產酶可達600U/ml以上。
木聚糖酶活測定方法參照文獻Bailey et al.J.Biotechnol，1992，23257-270。巴比妥納緩沖液稀釋適當倍數后，依次加入0.5ml稀釋酶液，1ml、1％的標準木聚糖懸浮液，50℃水浴保溫30min，立即加入DNS試劑1ml，沸水浴5min，冰水浴冷卻，定容至25ml，于540nm處比色測OD值(以木糖為標準)。酶活定義為上述條件下，每分鐘釋放1μmol的還原糖量(以木糖計)的酶量為1個酶活單位(U)。
在以上酶活力單位計算時，是以每分鐘所產生的木糖量計算的，但木聚糖酶水解木聚糖的產物一般為木二糖、木三糖及更高聚合度的低聚木糖，而沒有或很少木糖，因此以木糖量計算可能會有一定的誤差。分別測定木糖、木二糖還原糖標準曲線，加以對照并比較O.D值與微摩爾量之間的關系，發現兩者相差很小。說明在計算酶活力時，以木糖量來代替木二糖或木三糖量來計算是合理的，而且由于文獻上都是以木糖量來計算酶活力單位，也便于對比。
木聚糖制備參考文獻(J.D.Breccia et al.J.Appl.Bacteriol.1995，78469-472)的方法，用堿法提取麩皮、蔗渣或玉米芯原料中的半纖維素即木聚糖，精制后用作酶轉化底物。
甘蔗渣粉(過40目篩)用0.1-2mol/l的NaOH溶液溶解，0-0.2Mpa的壓力下蒸煮0.5-3小時，過濾。濾液用乙醇沉淀，20000×g離心傾去上清液，沉淀用0.1-2mol/l的NaClOa沸水浴溶解。于20000×g離心傾去上清液，收集的沉淀用乙醇溶解。此操作再重復兩次，得到的沉淀，于烘干4-36小時，得到木聚糖。
得到木聚糖在酶解前應進行精制處理，目的是為了除去木聚糖提取液中可能影響木聚糖酶作用的雜質，并有利于酶解液中低聚木糖產物的提取、純化，可保證產品的質量。
酶轉化反應以木聚糖為底物，底物濃度為1-2.0％，加酶量為100-500U/g底物，反應溫度為30-40℃，酶解時間為10-30小時。在此條件下所得的木聚糖酶解液進行薄層層析色譜分析表明，酶解液中主要成分為木二糖及木三糖。
低聚木糖提取精制酶解后所得的低聚木糖酶解液主要成分為木二糖及木三糖，還有未轉化的木聚糖，還含有較高的無機鹽雜質及較深的顏色，必須對其進行分離、提取并進行脫鹽和脫色處理來加以精制，從而得到高純度、高質量的低聚木糖產品。
采用超濾方法分離未轉化的大分子木聚糖，采用活性炭、717#強陰離子交換樹脂、732#強陽離子交換樹脂進行脫鹽脫色處理，這樣，能達到較好的精制效果和低聚木糖得率。
木聚糖酶解液組分及含量的測定采用HPLC(高壓液相色譜)方法，色譜儀Waters 510型，色譜柱Spherisorb氨基柱，檢測器Waters 2410，溫度30℃，流動相66.6％(V/V)乙腈/水溶液，流動相流速1.0ml/min。
或采用快速層析柱方法，即加壓柱層析技術。洗脫劑為正丁醇∶冰醋酸∶水＝4∶1∶1可以滿足對Rf值的要求。裝柱方法取適量的薄層層析硅膠(G60)于研缽中，加入洗脫劑，適當研磨后，緩慢加入層析柱中。在柱的底部及硅膠表面均勻鋪上一薄層石英沙。進樣及收集以少量的洗脫劑溶解干燥過的樣品，用滴管小心加入層析柱中，加入洗脫劑，加壓，打開下部活塞，以每管5ml收集洗脫液。
分析與測定將收集的洗脫液，每隔一管取樣，點樣于薄層層析硅膠板上，于層析缸中以上行法層析后，顯色。與原木聚糖酶解液薄層層析色譜圖比較，將同一組分的各管合并，真空濃縮，即得到所需組分的樣品。


圖1為菌株XY-11的選育譜系；圖2為本發明工藝流程示意圖；本發明克服了物理、化學方法降解速度難以控制，或精制工藝繁瑣，得率低，不適合工業化生產的缺點。本發明的優點是選育了一株高酶活、主要包含內切-β-木聚糖酶的假單胞菌Pseudomonas sp.XUN024-CGMCCNo.0458，提供了一種工藝簡單的酶轉化木聚糖制備低聚木糖的方法。所得到的酶轉化產物中低聚木糖含量達到90％以上，木糖、葡萄糖等單糖組分在10％以下，并由此得到高純度的低聚木糖產品。
下面的實施例對本發明作詳細說明。
實施例1木聚糖酶的制備斜面培養培養基為葡萄糖1％，蛋白胨0.5％，NaCl0.5％，瓊脂2％，PH8.5，110℃滅菌20分鐘，滅菌后冷卻接種，菌種為假單胞菌Pseudomonassp.XUN024-CGMCCNo.0458，37℃培養17小時，作為斜面活化種子。
種子培養培養基為葡萄糖1％，蛋白胨0.5％，PH8.5，裝液量20ml/250ml，110℃滅菌20分鐘，滅菌后冷卻接種斜面種子1環，37℃培養17小時，作為液體種子。
產酶培養培養基為麩皮6％，(NH4)2SO40.4％，K2HPO40.2％，pH8.5，裝液量20ml/250ml，110℃滅菌，20分鐘，滅菌后冷卻、接種種子液，接種量5％，37℃，旋轉式搖瓶柜轉速220r/m。XUN024在上述條件下進行搖瓶發酵試驗，36h產木聚糖酶酶活為825U/ml。
實施例2麩皮木聚糖酶解麩皮預處理麩皮過60目篩后，按液料比V/W為4∶1加水，每克麩皮加10單位耐高溫α-淀粉，95℃水解，再以熱水洗滌麩皮兩次，過濾，去除淀粉及一部分可溶性蛋白質。
堿提取100克預處理后麩皮，加入NaOH溶液，堿濃度為5％，液料比(V/W)為5∶1，溫度為40℃，靜止浸泡，時間為4小時，堿提后，離心，離心后殘渣以蒸餾水洗滌離心兩次，合并上清液，經6.0mol/L鹽酸中和后，以兩倍工業酒精加以沉淀，放置過夜，離心，在這一條件下，木聚糖提取率為33.75％。(烘干至恒重，計算木聚糖提取得率)。
木聚糖酶解用堿提麩皮木聚糖，用水配制濃度為2.0％底物；加按實例1方法制備的木聚糖酶，加酶量為350U/g木聚糖；反應溫度為37℃，酶解時間為24小時。在此條件下所得的木聚糖酶解液進行薄層層析色譜分析表明，酶解液中主要成分為木二糖及木三糖，未檢出木糖、葡萄糖。用快速層析柱分析所得酶解液干燥物，其低聚木糖組分中，木二糖含量為30.45％，木三糖含量為36.32％，低聚木糖占總干燥物的含量為60.94％。
實施例3蔗渣木聚糖酶解按實施例2的方法，用堿提蔗渣木聚糖100g(干物質計)，配制濃度為2.0％的木聚糖水懸液，加按實例1方法制備的木聚糖酶，按實施例2的方法酶解。所得的酶解液進行超濾(膜分子量5000)，濾液用活性炭脫色，717#、732#樹脂脫鹽處理，再于50℃，-0.09MPa，真空濃縮，得到低聚木糖糖漿34.2g(干糖漿重)，對木聚糖總收率為34.2％。HPLC分析表明，所得低聚木糖組分木二糖44.7％，木三糖48.2％，低聚木糖含量為92.9％。
權利要求
1.一種高產木聚糖酸的菌株，它是假單胞菌(Pseudomonas sp.)XUN024CGMCC No.0458。
2.一種制備本聚糖酶的方法，包括將權利要求1所述的菌株經斜面活化，種子培養，發酵得木聚糖酶液。
3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于所述發酵條件為溫度20-40℃，轉速100-220r/m。
4.根據權利要求2所述的方法，其特征在于所述發酵墻養基為麩皮1-6％，(NH4)2SO4/0.4-1％，K2HPO40.2-1％，其余為水，PH6-9，各組分的含量均為重量體積百分比。
5.制造低聚木糖的方法，包括(1)以麩皮、蔗渣或玉米芯為原料，用堿法提取木聚糖，精制；(2)以(1)的產物為底物，加權利要求2得到的酶液，反應溫度30-40℃，酶解時間10-30小時；(3)采用超濾方法分離未轉化的大分子木聚糖，采用活性炭，717#強陰離子交換樹脂脫鹽，超濾或真空濃縮，制成低聚木糖糖漿，或真空干燥制成低聚木糖粉末。
6.根據權利要求5所述的方法，其中(2)所述的加酶量為100-500U/克底物。
全文摘要
本發明涉及酶轉化制造低聚木糖的方法,其特征是本實驗室篩選并保藏的耐堿性木聚糖酶產生菌假單胞菌Pseudomonas sp.XY－11為親株,按常規方法進行紫外線和亞硝基胍誘變處理,得到的突變株假單胞菌Pseudomonassp.XUN024(即CGMCCNo.0458),在優化條件下發酵產酶酶活達到800－1000U/ml;酶制劑用于麩皮、蔗渣或玉米芯為原料,堿法制備的精制木聚糖的酶轉化,產物組分木二糖、木三糖占總轉化產物90%以上;酶轉化液中的低聚木糖,經活性炭脫色、732、717離子交換樹脂脫鹽,超濾和真空濃縮,制成低聚木糖糖漿,或真空干燥制成低聚木糖粉末,低聚木糖產品木二糖、木三糖含量占總糖組分90%以上。
文檔編號C12N1/20GK1333371SQ00109788
公開日2002年1月30日 申請日期2000年7月7日 優先權日2000年7月7日
發明者陶文沂, 許正宏, 孫志浩, 敖宗華 申請人:無錫輕工大學