一種富含兒茶素的金花茶愈傷組織的獲取方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于植物組織培養技術領域，具體涉及一種富含兒茶素的金花茶愈傷組織的獲取方法。
【背景技術】
[0002]金花茶是一種富含次生代謝物質的藥用木本花卉，其中，兒茶素是一類具有抗氧化、抗炎與抑制克氏錐蟲生長等作用的酚類物質。目前對于金花茶兒茶素等藥用物質的開發主要集中在活體植物上，其開發過程對外界環境要求較高且會對作為國家一級保護植物的金花茶的生存造成影響。
[0003]組織培養技術以離體材料作為初始材料，對初始材料的量要求較小，對活體植物幾乎無影響，且更容易應用于大規模生產。因此，利用組織培養技術，以離體材料進行大規模兒茶素生產極為重要。遺憾的是，迄今為止尚無此類報道。
【發明內容】
[0004]本發明的目的在于提供一種富含兒茶素的金花茶愈傷組織的獲取方法，其以金花茶幼嫩莖段為材料、以植物組織培養為基礎進行金花茶愈傷組織的培養，所獲得的愈傷組織中兒茶素種類豐富且含量高，可應用于離體生產金花茶兒茶素。
[0005]為實現上述目的，本發明采用如下技術方案:
一種富含兒茶素的金花茶愈傷組織的獲取方法，其包括金花茶體細胞胚培養、金花茶愈傷組織誘導、金花茶愈傷組織增殖培養3個步驟，具體操作如下:
1)金花茶體細胞胚的培養:以金花茶成年植株的幼嫩莖段為材料，以MS+2.0mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+6 g/L瓊脂為誘導培養基誘導體細胞胚，80 d后將誘導出來的體細胞胚接種到MS+20 g/L山梨醇+40 g/L蔗糖+6 g/L瓊脂的培養基上，于25±2 °C、12h光照+12 h黑暗條件下以周期為30 d進行繼代培養；
2)金花茶愈傷組織的誘導:以MS+0.5 mg/L KT+8.0 mg/L NAA+5mg/L AgN03+30 g/L蔗糖+6 g/L瓊脂為組織誘導培養基，將繼代培養的金花茶體細胞胚切塊，于25±2 °C、黑暗條件下進行培養，30d后得到愈傷組織；
3)金花茶愈傷組織的增殖培養:以MS+4.0mg/L 6-BA+0.6 mg/L 2，4_D為增殖培養基，以30 d為培養周期，將誘導出的金花茶愈傷組織于25±2 °C、12h光照+12 h黑暗條件下進行繼代培養。
[0006]各培養基在高壓滅菌前調pH值為5.8;所述高壓滅菌的溫度為121°C，滅菌時間為
20 mino
[0007]本發明的優點在于:本發明以金花茶幼嫩莖段為材料、以植物組織培養為基礎進行金花茶愈傷組織的培養，有生長速度快、條件可控且不依賴于外界環境等特點，同時，按本發明方法進行處理，不會對金花茶的活體植株造成傷害，且在成功誘導愈傷組織后可進行大規模培養，具有規模化效應，所獲得的愈傷組織中兒茶素種類豐富且含量高，可應用于離體生產金花茶兒茶素。
【附圖說明】
[0008]圖1為金花茶體細胞胚的培養情況示意圖。
[0009]圖2為金花茶愈傷組織的誘導情況示意圖。
[0010]圖3為金花茶愈傷組織的增殖情況示意圖。
[0011]圖4為兒茶素類物質測定的高效液相色譜圖，其中(A)為(+ )_兒茶素標準品，(B)為金花茶愈傷組織干粉提取液。
【具體實施方式】
[0012]為了使本發明所述的內容更加便于理解，下面結合【具體實施方式】對本發明所述的技術方案做進一步的說明，但是本發明不僅限于此。
[0013]1、金花茶體細胞胚的培養
在晴天中午取無病、健壯的金花茶成年樹的未木質化的幼嫩莖段，先于流水下沖洗30min清除表面灰塵，然后在紫外消毒后的超凈工作臺上按75%酒精30 s，0.1%升汞3 min，無菌水I次，0.1%升汞9 min，無菌水4次的程序對外植體進行消毒，切除在消毒過程中的裸露傷口；然后將長約I cm左右的金花茶幼嫩莖段接種到MS+2.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+30g/L蔗糖+6 g/L瓊脂的誘導培養上，80 d后將誘導出來的體細胞胚接種到MS+20 g/L山梨醇+40 g/L蔗糖+6 g/L瓊脂的培養基上，培養基在高壓滅菌(121 °C,20 min)前調節pH值為
5.8，于培養光環境為:12 h光照+12 h黑暗、培養溫度為25±2 °C的條件下以周期為30 d進行繼代培養，得到生長旺盛的金花茶體細胞胚(如圖1);
2、金花茶愈傷組織的誘導
在紫外消毒后的超凈工作臺上將生長旺盛呈亮黃色的金花茶體細胞胚切成約0.5 cm3的方塊，并將與培養基接觸的一側表皮切除，然后接種到MS+ 0.5 mg/L KT+8.0 mg/L NAA+5mg/L AgN03+30 g/L蔗糖+6 g/L瓊脂的組織誘導培養基上，培養基在高壓滅菌(121 °C，20min)前調節pH值為5.8，于培養光環境為黑暗、培養溫度為25±2 °C的條件下培養30d，即可從金花茶體細胞胚切塊上誘導出愈傷組織(如圖2);
3、金花茶愈傷組織的增殖培養
在紫外消毒后的超凈工作臺上小心地將誘導出的愈傷組織與體細胞胚切割分離，切割時盡量不損傷愈傷組織，以減少損傷引起的褐化，然后將愈傷組織接種到MS+4.0 mg/L 6-BA+0.6 mg/L 2，4-D的增殖培養基上，培養基在高壓滅菌(121 °C，20 min)前調節pH值為5.8，于培養光環境為:12 h光照+12 h黑暗、培養溫度為25±2 °C的條件下以周期為30d進行繼代培養(如圖3)。
[0014]所得愈傷組織增殖系數(愈傷組織增殖系數=培養30d后的鮮重/接入的鮮重)可達3.19?3.55。
[0015]采用香莢蘭素法測定兒茶素含量，具體是將所得金花茶愈傷組織干燥后磨碎并過20目篩，然后取0.5 g干粉，加95%乙醇20 mL，90°C水浴提取30 min，使乙醇保持微沸;過濾后冷卻，用95%乙醇定容至25 mL;吸取試液320yL，注入盛有700yL 95%乙醇的10 mL離心管中，搖勻，得金花茶愈傷組織干粉提取液;另將于秋季在金花茶成年植株上采摘的葉片按相同方法進行處理，得金花茶葉片組織干粉提取液。然后分別在兩個提取液中加入1%香莢藍素鹽酸溶液5 mL，蓋上蓋子搖勻顯紅色;放置40分鐘后，以試劑空白作參比，用5 mm比色皿于波長500 nm處比色測定吸光度。結果顯示，金花茶葉片組織干粉提取液中兒茶素的含量僅為4.37-4.53 mg/g(干重)，而金花茶愈傷組織干粉提取液中兒茶素含量為27.25-28.66 mg/g(干重)。
[0016]采用高效液相色譜對所得金花茶愈傷組織干粉提取液中的兒茶素物質進行檢測，高效液相條件為:以日立高效液相儀為檢測儀器，以水:乙腈:甲醇(83:6:11)為流動相，流速為1.0 mL/min，以C-18為固定相，柱溫為25°C，檢測波長為280 nm，進樣量為40yL，每個樣品檢測40 min。結果如圖4顯示，金花茶愈傷組織干粉提取液中含有(+)-兒茶素且可能含有七種其他類型的兒茶素。
[0017]由此可見，采用本發明方法所獲得的愈傷組織中兒茶素種類豐富且含量高，可應用于離體生產金花茶兒茶素。
[0018]以上所述僅為本發明的較佳實施例，凡依本發明申請專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應屬本發明的涵蓋范圍。
【主權項】
1.一種富含兒茶素的金花茶愈傷組織的獲取方法，其特征在于:包括金花茶體細胞胚培養、金花茶愈傷組織誘導、金花茶愈傷組織增殖培養3個步驟。2.如權利要求1所述富含兒茶素的金花茶愈傷組織的獲取方法，其特征在于:所述金花茶體細胞胚培養的方法為:以金花茶成年植株的幼嫩莖段為材料，以MS+2.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+6 g/L瓊脂為誘導培養基誘導體細胞胚，80 d后將誘導出來的體細胞胚接種到MS+20 g/L山梨醇+40 g/L蔗糖+6 g/L瓊脂的培養基上，于25±2 °C、12h光照+12 h黑暗條件下以周期為30 d進行繼代培養。3.如權利要求1所述富含兒茶素的金花茶愈傷組織的獲取方法，其特征在于:所述金花茶愈傷組織誘導的方法為:以MS+0.5 mg/L KT+8.0 mg/L NAA+5mg/L AgN03+30 g/L蔗糖+6 g/L瓊脂為組織誘導培養基，將繼代培養的金花茶體細胞胚切塊，于25 ±2 °C、黑暗條件下進行培養，30d后得到愈傷組織。4.如權利要求1所述富含兒茶素的金花茶愈傷組織的獲取方法，其特征在于:所述金花茶愈傷組織增殖培養的方法為:以MS+4.0 mg/L 6-BA+0.6 mg/L 2，4_D為增殖培養基，以30 d為培養周期，將誘導出的金花茶愈傷組織于25±2 °C、12h光照+12 h黑暗條件下進行繼代培養。5.如權利要求2-4所述富含兒茶素的金花茶愈傷組織的獲取方法，其特征在于:各培養基在高壓滅菌前調pH值為5.8; 所述高壓滅菌的溫度為121°C，滅菌時間為20 min。
【專利摘要】本發明公開了一種富含兒茶素的金花茶愈傷組織的獲取方法，屬于植物組織培養技術領域，其包括金花茶體細胞胚培養、金花茶愈傷組織誘導、金花茶愈傷組織增殖培養3個步驟。本發明以金花茶幼嫩莖段為材料、以植物組織培養為基礎進行金花茶愈傷組織的培養，其具有生長速度快、條件可控且不依賴于外界環境等特點，具有規模化效應，且獲得的愈傷組織中兒茶素種類豐富且含量高，可應用于離體生產金花茶兒茶素。
【IPC分類】A01H4/00
【公開號】CN105532460
【申請號】CN201610007591
【發明人】鐘春水, 賴鐘雄, 程春振, 陳裕坤, 林玉玲, 劉生財, 張梓浩
【申請人】福建農林大學
【公開日】2016年5月4日
【申請日】2016年1月7日