一種利用誘導型雌性不育的雜交稻機械化制種方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于農業生物技術領域，公開了一種利用誘導型雌性不育的雜交稻機械化 制種方法。
【背景技術】
[0002] 我國現行雜交稻制種技術，采取父母本分期播種，多為先播父本，后播母本；父母 本箱式分開栽插，母本多行，父本雙行；收獲時父母本分開收割，或者授粉后成熟前割掉父 本。因此，雜交水稻制種是一項勞動強度大、工序繁瑣、生產成本高的技術。隨著城鎮化、工 業化、農業產業化和農村土地流轉政策的逐步實施，留守農村的青壯年勞動力逐年遞減，現 行勞動密集型、精耕細作型的制種技術已無足夠勞動力來承擔。同時，隨著國民經濟的發展 和農村產業結構的調整，農民收入渠道不斷增多，雜交水稻制種這一高風險、低回報的生產 模式對農戶也缺乏吸引力；而且由于部分農民對雜交水稻制種技術不熟練或覺得制種過程 太繁雜，所以不敢或不愿承擔雜交水稻制種工作。因此，雜交水稻機械化制種技術研究迫在 眉睫。
[0003] 已有不少研究者作了各種嘗試開展雜交稻機械化制種。有研究者提出用谷殼顏色 區別水稻不育系和恢復系種子，具體做法是將正常谷殼色的水稻不育系種子與非正常谷殼 色的水稻恢復系種子機械混播，成熟后經機械混收，再用色選機分選，獲得雜交種；有研究 者提出用飛機將花粉噴施在母本田塊里進行制種；也有研究者提出利用父、母本粒型的較 大懸殊，用粒選機分選；還有研究者提出用半機械化操作的方法，即直播母本，人工栽插和 收割父本，最后機械收割母本等方法；還有研究者利用水稻對除草劑苯達松的敏感特性進 行雜交水稻機械化制種。然而上述多種方法均存在諸多缺陷而不能從根本上實現雜交水稻 機械化制種，目前在生產上也未見大規模商業化應用。

【發明內容】

[0004] 本發明旨在克服現有技術的不足，提供一種利用誘導型雌性不育的雜交稻機械化 制種方法。
[0005] 為了達到上述目的，本發明提供的技術方案為：
[0006] 所述利用誘導型雌性不育的雜交稻機械化制種方法包括如下步驟：
[0007] (1)將誘導型啟動子驅動的水稻雌性可育基因插入水稻表達載體，水稻表達載體 優選為PCAMBIA1300 ;
[0008] (2)將步驟（1)所制備的水稻表達載體導入雌性不育水稻，并獲得純合的轉基因 水稻；
[0009] (3)將純合的轉基因水稻進行不育系繁殖或雜交稻制種；進行不育系繁殖時，向 純合的轉基因水稻施加誘導劑，使誘導型啟動子驅動的水稻雌性可育基因表達，實現可育 自交繁殖；進行雜交稻制種時，在不施加誘導劑的自然條件下將純合的轉基因水稻與母本 不育系種植，雜交獲得雜交種子（純合的轉基因水稻不施加誘導劑時表現為完全雌性不 育，因而可作為父本用于制種與母本雜交生產雜交種子；制種過程收獲時，父本由于為雌 性不育而不結實，因此，父母本無論箱式播種或者混播，收獲時都可混收）。
[0010] 其中，步驟（1)所述水稻雌性可育基因為雌性不育水稻sfsl的雌性不育基因的 野生型基因，PTB1雌性基因的野生型基因或FST雌性不育基因的野生型基因；所述雌性不 育水稻sfsl的雌性不育基因序列如SEQIDNO. 1所示；所述PTB1雌性基因序列如SEQID NO. 2所示；所述FST雌性不育基因序列如SEQIDNO. 3所示。
[0011] 步驟（1)所述誘導型啟動子的DNA序列如SEQIDNo. 4所示。
[0012] 步驟（2)所述雌性不育水稻為雌性不育水稻sfsl(該不育系已被申請號 為201210096970. 7的發明專利公開）或攜帶PTB1雌性基因（該基因已被申請號為 201010194553. 7的發明專利公開）的雌性不育水稻。
[0013] 步驟（3)所述不育系繁殖時是在雌配子發育期向純合的轉基因水稻施加誘導劑； 所述雌配子發育期為減數分裂期至大胞子發育期。
[0014] 所述誘導劑是丙環唑、腈菌唑、或丙環唑與腈菌唑的組合物。
[0015] 雌性不育水稻的繁殖和雜交稻機械化制種中利用了包含上述表達盒的轉基因水 稻進行轉育所獲得的水稻材料。
[0016] 下面結合原理，對本發明作進一步說明：
[0017] 本發明首先構建了攜帶由誘導型啟動子驅動的水稻雌性可育基因的表達盒的水 稻表達載體。利用水稻轉基因技術，將上述表達載體轉入雌性不育水稻。不育系繁殖時，上 述轉基因水稻利用相應的誘導劑誘導重組育性基因表達，使其可育自交繁殖；雜交稻制種 時，轉基因水稻不施加誘導劑時表現為完全雌性不育，因而可作為父本用于制種與母本雜 交生產雜交種子。制種過程收獲時，父本由于為雌性不育而不結實，因此，父母本可以箱式 播種，也可以混播，收獲時可以混收。
[0018] 與現有技術相比，本發明的有益效果為：
[0019] 本發明方法解決了雌性不育水稻繁殖技術難題，實現了雜交稻種子生產的混播混 收；繁殖時，施用化學誘導劑，收獲父本種子。制種時，可以箱式播插，也可以混播；收獲時， 可以混收。這一混播混收的雜交水稻種子生產技術，可以減少制種操作程序，便于進行機械 化操作，減輕勞動強度，降低種子生產成本，整體提高水稻種業的效益。
【附圖說明】
[0020] 圖1是實施例1中攜帶由誘導型啟動子驅動的水稻雌性可育基因的基因表達盒的 水稻表達載體圖譜；
[0021] 圖2是實施例3中部分轉基因植株的PCR檢測圖（M:DNA分子量標準；1~4 :轉 基因植株；5:陰性對照）
[0022] 圖3是實施例3中部分轉基因植株的Southernblot檢測圖（一:陰性對照；+ :以 質粒作為陽性對照）；
[0023] 圖4是實施例4中轉基因植株花粉Ι2_ΚΙ染色結果圖；
[0024]圖5是實施例4中轉基因植株施加誘導劑后的結實表現（上圖：轉基因植株不施 加誘導劑后的結實表現；下圖：轉基因植株施加誘導劑后的結實表現）；
[0025] 圖6是實施例5中水稻雌性不育系用于繁殖試驗；
[0026]圖7是實施例4中小規模制種現場圖。
【具體實施方式】
[0027] 下面通過具體實施例對本發明作進一步描述，但不因此限制本發明的范圍。所涉 及的菌株、載體、水稻品種都是可以公開獲得。
[0028] 實施例1 :攜帶誘導型啟動子驅動的水稻雌性可育基因的基因表達盒的水稻表達 載體構建
[0029]在植物表達載體pHB上插入1個表達盒：誘導型啟動子（SEQIDN0. 4)、野生型 PTB1 (水稻雌性可育基因）編碼區（SEQIDNO. 2)、rbcSPolyA終止子（SEQIDNO. 5)。完 整的表達盒序列如SEQIDNO.6所示。完整的構建載體圖譜見附圖1。
[0030] 所構建載體質粒導入農桿菌菌株EHA105用于水稻遺傳轉化。導入方法采用電擊 轉化方法，主要參考bio-rad公司的電擊儀使用說明書進行，具體步驟如下：
[0031] (1)將儲存于_80°C的DH10B感受態細胞取出放在冰上凍融，1mm電激杯放在冰上 預冷，把凍存的S0C放置在37°C解凍。
[0032] (2)將干凈的EP離心管插在冰上預冷，一般EP離心管的數目比要轉化的樣品多 兩個，一個用來做陰性對照（沒有加入DNA)、另一個做陽性對照（加入1μ1的10ng/μ1 pUC19)〇
[0033] (3)分別吸取1-2μ1要轉化的DNA樣品放入預冷的ΕΡ離心管中，然后將融化的 DH10B感受態細胞20μ1輕輕取出放入預冷的EP離心管底部，輕輕的將兩者混勻，盡量不 要產生氣泡，離心管底部不要用手接觸，避免溫度變化對感受態轉化效率造成影響，操作過 程盡量的快。
[0034] (4)設置轉化參數，1800ν，25μF，200Ω，1mm，BioRad電激儀一般有推薦的使用參 數。
[0035] (5)輕輕吸取感受態和DNA混合物，放入電激杯中，輕敲使混合物均勻的分布于杯 底，改上蓋子放入電激槽中，關上安全蓋，按下電激紅色按鈕，待電激完成后（一般會儀器 會發出完成提示音），將在37°C預熱好的S0C放入電激杯中，將混合物旋起，用吸頭將混合 物轉入搖菌管中，于37°C恒溫搖床，225rpm，lhr。
[0036] 實施例2 :轉基因水稻獲得
[0037] 2. 1植物材料選擇
[0038] 用于遺傳轉化的水稻（OryzasativaL.)品種選擇為對應的攜帶PTB1基因（SEQ IDNO. 1)的水稻雌性不育系。
[0039] 2. 2水稻胚性愈傷組織的誘導
[0040] 取授粉后10_15(1的未成熟水稻種子剝去種皮，于70%酒精浸泡31^11，再于0.1% 升汞中浸泡15min(或再轉入20 %的次氯酸鈉溶液中于搖床振蕩滅菌25min)，超凈工作臺 中無菌水清洗3-5次，將消毒后種子的幼胚用鑷子擠出，接種于誘導培養基上，每個皿約放 35粒，28°C暗培養4一5d，切除胚根，繼續培養12-15d，待愈傷長大后進行繼代培養，每兩周 繼代一次，共繼代2-3次。
[0041]成熟胚去殼，經上述方法消毒后，置于誘導培養基上。28°C暗培養至長出愈傷組 織。選用培養或預培養4天的愈傷組織作為轉化材料。
[0042] 2· 3愈傷組織的預培養
[0043] 取生長旺盛的胚性愈傷組織（從繼代培養上挑選分散狀，顏色鮮黃的2 - 3mm的 胚性愈傷顆粒）轉接到預培養培養基，27°C暗培養3 - 4天。生長旺盛的愈傷用于轉化。
[0044] 2. 4農桿菌介導的水稻轉化
[0045] 農桿菌的培養。挑農桿菌單菌落接種于含50mg/LYM培養基上，260C暗培養2~ 3天后，用一金屬匙收集農桿菌菌體，將其懸浮于AAM液體懸浮培養基中。調整菌落濃度至 0.D. 600為0. 8~1. 0,即可用于轉化。
[0046] 愈