衍生自b型肝炎病毒核蛋白精氨酸密集區的抗菌勝肽的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明是關于抗菌勝肽。
【背景技術】
[0002] 因廣泛使用傳統抗生素而造成病原體抗藥性提升，是全球所重視的問題，因此迫 切需要研發更多有效的治療并克服抗藥性問題。抗菌勝肽（Antimicrobial peptides，AMP) 是一種新的抗生素種類，具有新穎作用模式及卓越的治療效果。一般來說，抗菌勝肽含有 10~50個氨基酸，整體帶有正電并具有雙極性結構（amphipathic structure)。大部份的 抗菌勝肽可直接與細菌膜鍵結，并藉由使細胞膜瓦解或是攻擊細胞內的成分而致死。最重 要的是，抗菌勝肽對抗藥性病原體是有效的，此種性質使得近幾十年作為新型抗生素的抗 菌勝肽被大量研究。
[0003] 先前未有文獻報導衍生自B型肝炎病毒核蛋白（hepatitis B virus core protein，HBc)的勝肽擁有抗菌活性。B型肝炎病毒核蛋白（21KDa)為病毒復制所必需，其 在N端（第1至149個氨基酸殘基）包含一蛋白殼（capsid)組裝區域，且在C端（第150 至183個氨基酸殘基）有一個精氨酸密集區（arginine-rich domain，ARD) (Birnbaum et al. (1990) J Virol 64:3319-3330 ;Nassal M(1992) J Virol 66:4107-4116)。ARD 含有 16 個精氨酸，分成4個精氨酸密集群（ARD I、II、III、IV)，并具有鍵結至核苷酸的功能。當其 鍵結至HBV前基因體RNA或是聚陰離子時，HBc可組裝為一穩定的蛋白殼。此外，ARD包含 HBc核蛋白與粒子的核輸出與輸入的重要訊號。我們意外地發現，表現HBcl~183的大腸 桿菌比表現HBcl~149的大腸桿菌其生長慢得多（此結果尚未發表），而這現象的原因文 獻上并沒有任何報告提出一個合理的解釋。

【發明內容】

[0004] 本發明的一目的是關于一醫藥組成物，包含：
[0005] (a) -有效量的一單離勝肽，其中該單離勝肽包含B型肝炎病毒核蛋白 (hepatitis B virus core protein，HBc)的精氨酸密集駿基端區域（arginine-rich carboxy-terminal region)，并表現一抗菌活性；以及
[0006] (b) -藥學上可接受的載體。
[0007] 本發明的另一目的是關于一醫藥組成物，包含：
[0008] (a) -有效量的一單離勝肽，該單離勝肽包含B型肝炎病毒核蛋白的一片段，該片 段包含一個以上的精氨酸密集區（ARD)，是選自由下列（i)、（ii)及（iii)所組成的群組：
[0009] (i) HBc ARD I ~IV ;
[0010] (ii)HBc ARD I ~III ;
[0011] (iii)HBc ARD II ~IV ;
[0012] 其中該單離勝肽具有一抗菌活性；以及
[0013] (b) -藥學上可接受的載體。
[0014] 本發明另一目的是關于一種醫藥組成物包含一有效量的一單離勝肽，該單離勝肽 包含一衍生自B型肝炎病毒核蛋白的C端區域的精氨酸密集序列，其中該單離勝肽的特征 在于具有一抗菌活性。
[0015] 本發明又一目的是關于一種如前所述的醫藥組成物用于殺死及/或抑制一微生 物的生長及/或增殖的用途，是經由前述醫藥組成物與該微生物接觸。
[0016] 本發明又一目的是關于一種如前所述的醫藥組成物用于殺死及/或抑制一 需要的個體內一微生物的生長及/或增殖的用途，或用于治療受一微生物感染的一個 體。該個體可為感染金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus)或克雷伯氏肺炎桿菌 (K. pneumonia)〇
[0017] 后述較佳實施方式的說明與后附的圖式使得本案的目的變得顯而易見，本發明的 變體與修飾可能有些許不同，但不脫離本發明所揭露新穎概念的精神與范疇。
[0018] 后附圖式說明本發明一或多個實施方式，并且與說明書的說明一同用于解釋本發 明原理。只要有可能，于所有圖中同樣的標號是關于一實施方式的相同或類似元件。
【附圖說明】
[0019] 圖1顯示為測試抗菌能力的不同HBc ARD的氨基酸序列。下方呈現不同的磷酸化 勝肽與R替代成A的變異勝肽，是在HBcl47~183的ARD-III與ARD-IV有總共4個Arg 替代成Ala。
[0020] 圖2顯示HBcl47~183抗綠膿桿菌、克雷伯氏肺炎桿菌、大腸桿菌以及金黃色葡 萄球菌的殺傷動力學。細菌以HBcl47~183 (lx MBC)處理。于指定的時間點（每隔20分 鐘）量測細菌的存活率。樣本以三重復方式量測。
[0021] 圖3顯示FITC-HBcl47~183勝肽于細菌上的位置。將近IO7CFU的綠膿桿菌 TCC9027、ATCC27853 (A 及 B)、克雷伯氏肺炎桿菌 ATCC13884 (C)、大腸桿菌 ATCC25922 (D)、 以及金黃色葡萄球菌 ATCC19636、ATCC25923 與 ATCC 29213 (E、F 與 G)與 HBcl47-183 (0? 5x MBC) -起培養1小時。細菌經清洗、固定并以DAPI染色（藍色）。影像以共焦顯微鏡拍攝。
[0022] 圖4顯示HBc 147~183可能的殺菌機制。㈧綠膿桿菌、克雷伯氏肺炎桿菌、大腸 桿菌以及金黃色葡萄球菌經由HBcl47~183的SYTOX Green染劑攝入。每分鐘記錄以熒 光測量的數據。（B)綠膿桿菌經由0. 5、1與2 y M的HBcl47~183與HBcl53~176的細胞 膜穿透化劑量依賴曲線。2iiM的蜜蜂毒素迷力挺（melittin)作為正控制組。樣本以三重 復方式測量。（C)HBcl47~183的DNA鍵結活性。HBcl47~183與pSUPER質體DNA以指 定的N/P比（0、0. 2、0. 4、0. 6、0. 8、1、2及3)混合30分鐘。DNA的流動性以凝膠阻滯實驗評 估。
[0023] 圖5顯示LPS與LPS抗體于HBcl47~183的殺菌活性的劑量反應作用。綠膿桿菌 及大腸桿菌來源的LPS及LPS抗體與綠膿桿菌及HBcl47~183 (lx MBC)混合3小時。細 菌置于MH瓊脂上以測量存活率。樣本以三重復方式測量。
[0024] 圖6顯示ARD勝肽HBc 147~183在數個不同的體外鍵結分析中，可鍵結至LPS與A 月旨。每個分析中，樣本以三重復方式量測。（A)草圖顯示勝肽LPS與勝肽A脂鍵結的體外分 析，以及LPS/A脂的競爭分析。（B)恒定量的LPS與卵白素偶聯微球上漸增濃度的生物素化 ARD HBc 147 ~183 勝肽（0、0.004、0.02、0. 1、0.5 與 2.5yM) -起培養。以 LAL ELISA 分析 量測懸浮液中未鍵結的LPS。將EU值以一不含勝肽的控制組標準化。HBcl47~1838p (含 有8個磷酸化的氨基酸）亦作為一控制組勝肽，因其與LPS的鍵結微弱。（C)微珠鍵結的 LPS經由胰蛋白酶瓊脂糖消化隔夜而釋放至懸浮液中。以LAL ELISA分析懸浮液中自由的 LPS。懸浮液中被釋放的LPS的量是與微珠上ARD勝肽HBcl47~183的量成比例。（D)恒 定量的A脂分別與增加濃度的HBcl47~183以及HBcl47~1838P培養。以LAL ELISA試 劑檢測懸浮液。這里的結果與先前發現一致，是A脂可直接鍵結至HBcl47~183。（E)LPS/ A脂競爭分析。恒定量的LPS (I y g)涂布于ELISA盤上的每一孔，然后與一含有IOnM恒定 量的HBcl47-183與增加濃度的A脂的反應混合物培養。A脂的增加以劑量依賴的方式降低 盤上鍵結ARD勝肽HBc 147~183的量。
[0025] 圖7顯示ARD勝肽HBcl47~183的細胞毒性分析。（A)以10 %人類紅血球細胞 (RBC)測量HBcl47~183與迷力挺的溶血活性。與迷力挺相較，未顯示HBcl47~183具有 溶血活性。（B)Huh7、IfepG2、Vero以及HEK293細胞與不同濃度（0至100 y M)的HBcl47~ 183與迷力挺于37°C培養1小時。對細胞存活率的影響以MTT分析測定。迷力挺用于作為 一正控制組。未檢測到HBcl47~183對于細胞存活率的影響，而迷力挺則顯示強烈的細胞 毒性。（C)腎臟細胞Vero與HEK293以CFSE染色并于第0天植入。第1天時細胞以不同濃 度（0至100 yM)的HBcl47~183培養1小時。以流式細胞儀評估第1天及第3天的細胞 增殖。與空的控制組（mock control)實驗相似，在Vero與HEK293細胞上未有顯著作用。 于第7A~C圖的樣本是以三重復的方式分析。（D)利用3周大ICR公小鼠評估ARD勝肽 HBcl47~183的體內細胞毒性。小鼠腹膜內注射勝肽（10與20mg/體重kg)。所有的小鼠 于7天后仍存活。
[0026] 圖8顯示體內ARD勝肽HBcl47~183抗金黃色葡萄球菌的保護活性試驗。（A) 3 周大ICR公小鼠接受致命濃度的金黃色葡萄球菌ATCC 19636，然后分為5組不同的時間點。 于每一時間點（n = 5)收集、稀釋血液樣本，并將其覆于BHI瓊脂上。第二天計算細菌的 數目。觀察到接種后2小時血液中有最大細菌量。數據以平均值土標準偏差（SD)表示。 (B)如前所述以致命濃度的金黃色葡萄球菌培養的ICR小鼠，分別在接種后1、1. 5或2小 時以腹膜內注射ARD勝肽（10mg/kg)治療。每組包含10只小鼠。以PBS治療的控制組小 鼠全數（100% )于第一天死亡，而以ARD勝肽于接種后1、1. 5或2小時治療的小鼠，7天后 存活率分別為100%、70%與40%。（C)如前所述，ICR小鼠腹膜內接種金黃色葡萄球菌，隨 即腹膜內注射PBS(n = 5)或于接種后1小時腹膜內注射10mg/kg ARD勝肽（n = 5)。接 種后4小時，收集血液、肝臟及脾臟。肝臟及脾臟樣本經均質化、稀釋，并與血液樣本一同覆 于BHI瓊脂上。于隔日計算細菌量。與用PBS治療的小鼠相較，ARD勝肽的治療能有效降 低血液、肝臟及脾臟中的細菌量。（D)以PBS治療（空心的圓形、菱形與正方形）與ARD勝 肽HBcl47~183治療（實心的圓形、菱形與正方形）的小鼠血液、肝臟及胰臟樣本細菌量 的量化比較。圖中的線表示細菌量的平均值。**表示于PBS與ARD勝肽HBcl47~183治 療結果的間的 P〈0. 01 (Mann-Whitney U test) 〇
[0027] 圖9顯示ARD勝肽抗克雷伯氏肺炎桿菌的體內抗菌活性的IVIS分析。（A)感染 克雷伯氏肺炎桿菌的小鼠，在接種后1小時以PBS(n = 5)或10mg/kg ARD勝肽（n = 5)治 療。接種后4小時，麻醉小鼠并攝影。細菌量顯示于生物冷光迭加的攝影影像中。假色影 像（False color imaging)將強冷光處以紅色表示，中度冷光處以綠色表示，低冷光處以藍 色與紫色表示。（B)總光通量以IVIS影像軟件量化。**表示于PBS與ARD勝肽HBcl47~ 183 治療結果的間的 P〈0.0 l (Mann-Whitney U test) 〇
[0028] 圖10為一顯示HBCARD勝肽的抗菌活性表。
[0029] 圖11為一顯示ARD勝肽HBcl47~183對于對黏菌素具有抗藥性與敏感性的綠膿 桿菌與鮑氏不動桿菌的抗菌活性的表。
[0030] 圖12顯示人類B型肝炎病毒（HBV)核蛋白（HBc)的精氨酸密集區（ARD)的序列 組合。HBcARD區域從目前不同地域的病患中分離出來的不同血清型中，是為高度保守。
[0031] 圖13A~B顯示從靈長類、嚙齒動物及禽類來源嗜肝病毒的HBc ARD區域的序列 組合。HBc ARD序列在人類、絨毛猴（wooly monkey)、地松鼠、土撥鼠以及蝙蝠的間是高度 保守的。在HBc ARD的精氨酸（正電荷）群集的次區域為ARD-I、ARD-II、ARD-III、以及 ARD-IV。第13B圖進一步顯示在鴨、蒼鷺、鸚鵡、羅斯雁及雪雁的核蛋白C端也有4個群集 正電荷氨基酸。不論靈長類、嚙齒動物及禽類嗜肝病毒的間的序列歧異度與演化