一種大鱗副泥鰍良種選育方法
【專利摘要】本發明公開了一種大鱗副泥鰍良種選育方法。具體而言，該方法包括如下步驟：1）提供12個與生長性狀相關的微衛星分子標記；2）選擇親本群體1進行電子標記并提取DNA；3）采用分子標記對親本群體1進行基因型篩選并選定親本群體2；4）采用分子標記對親本群體2進行基因型篩選，分別建立具有不同純合基因型的親本群體3和4；5）以親本群體3和4為繁殖群體，分別進行人工繁殖獲得親本群體5和6；6）親本群體5和6之間進行雜交并進行規模化繁殖。與傳統育種相比，該方法具有迅速、穩定、可靠的特點，實用性強、成本低、準確性高、不受環境等因素的影響，可擺脫對表型性狀鑒定的依賴，縮短了育種年限，提高了育種效率，極具應用價值。
【專利說明】一種大鱗副泥鰍良種選育方法

【技術領域】
[0001] 本發明屬于魚類育種學領域，具體涉及一種大鱗副泥鰍良種選育方法。

【背景技術】
[0002] 大鱗副泥鰍)屬鰍科、花鰍亞科、副泥鰍屬，是一種分 布于東南亞地區的小型淡水底棲魚類，國內多分布于四川、浙江、臺灣、遼寧、黑龍江等地。 體近圓筒形，頭較短。口下位，馬蹄形，下唇中央有一小缺口。鼻孔靠近眼，眼下無刺，鰓孔 小。頭部無鱗，體鱗較泥鰍為大。須5對，其中吻須2對，口角須1對，頦須2對，各須均長， 口角須后伸可達鰓蓋后緣。眼被皮膜覆蓋。尾柄處皮褶棱發達，與尾鰭相連。尾柄長與高 約相等。尾鰭圓形。肛門近臀鰭起點。體背部及體側上半部灰褐色，腹面白色。體側具有 許多不規則的黑色褐色斑點。背鰭、尾鰭具黑色小點，其他各鰭灰白色。大鱗副泥鰍肉質鮮 美，營養豐富，富含鈣、維生素A、維生素D以及多種蛋白質、氨基酸和礦物質，素有"水中人 參"之美譽，具有較高的食用、藥用及經濟價值，已發展成為我國重要的養殖對象，也是我國 出口韓國的主要水產品之一。
[0003] 中國已成為全世界大鱗副泥鰍養殖規模最大的國家,江蘇省大鱗副泥鰍養殖規模 又占居了全國的70%以上。然而，目前用于大鱗副泥鰍養殖的魚種主要捕撈自天然水域，野 生苗種的質量難以保證，生長性能與養殖效果也極不穩定。眾所周知，種質是水產養殖的物 質基礎，良種在我國水產業從捕撈為主的產業向以養殖為主的產業的轉變過程中起到的作 用不容小覷。傳統良種培育技術基本上分為兩類：遺傳操作和選擇操作，遺傳操作技術最為 成功的是雜交育種技術，選擇操作技術則主要有家系和群體選育。雜交選育面臨引入不良 性狀尚需多代回交的問題；傳統選育要想建成目標品種，至少需要經過多代（4-5代）人工 選擇才能育成優良品種(遺傳穩定、在生物學、形態學和經濟性狀基本一致的有一定數量的 群體)。傳統選擇操作的弊端在于對基因型富集的解釋和控制近親繁殖的方法尚處于經驗 階段，僅間接利用現代遺傳學理論，概念模糊，操作和理論間缺乏等價關系，以致育種過程 出現優良品種雜合度低，有害基因通過純合而表現出來，雜合度和多態性下降，有綜合經濟 性狀下降的隱患。
[0004] 隨著分子生物學和基因組學在水產遺傳育種上的應用，多種分子標記(如SSR/SNP 等)出現及應用有效地解決了上述問題。然而，國內外目前尚未開始大鱗副泥鰍的系統遺傳 選育工作，特別是分子標記輔助選育，優質苗種的缺乏已嚴重制約了大鱗副泥鰍養殖業的 發展，因此亟待開發出一種大鱗副泥鰍的良種選育方法。


【發明內容】

[0005]為了解決上述技術問題，本發明提供了一種大鱗副泥鰍良種選育方法，從而可以 快速選育出質量可靠、生長性能與養殖效果穩定的大鱗副泥鰍優良品種，此項技術適用于 有較大規模的良種場或國家良種基地進行大鱗副泥鰍的良種選育。
[0006]為了實現上述目的，本發明通過以下技術方案來實現： 一種大鱗副泥鰍良種選育方法，其包括以下步驟： 1) 提供12個與生長性狀相關的微衛星分子標記，其各自對應的引物如下所示： 微衛星分子標記Pda48 的引物：L:5' -TGAGGCACITTGTTTACGCTC-3' ； R:5, -GCTCATGGGACACAAGATGG-3,； 微衛星分子標記Pda66 的引物：L:5' -TACCCTGTGCTAAGGAGGC-3' ； R:5' -AGAGGGAACGGCCAACAG-3,； 微衛星分子標記Pdal74 的引物：L:5' -GTCGGACCTGAAGAGGCAC-3' ； R:5' -TGCCGTCTGTCATCCATGC-3' ； 微衛星分子標記Pda242 的引物：L:5' -TGCCAGCAAITGACATAAAGGG-3' ； R:5' -GATTTCTCAAGCCCAGCGG-3' ； 微衛星分子標記Pda247 的引物：L:5' -ATAGTGCCCGITTCCTGCC-3' ； R:5' -TGGTGAAAGAGTGAAACAATTACC-3' ；微衛星分子標記Pda260 的引物：L: 5' -GCTCTGCTCCGAACATTCC-3' ； R:5' -CTTTCCGTCGCACCTTTCC-3' ； 微衛星分子標記Pda288 的引物：L:5' -AGGTGTGGITTCAGGITGC-3' ； R:5, -ACAGAGGAAACCGGTGAGG-3,； 微衛星分子標記Pda301 的引物：L:5' -CCTGTAGirGACCCAITTCGC-3' ； R:5' -AGAAGGGTGACTTGTCCAAAC-3' ； 微衛星分子標記Pda310 的引物：L:5' -GGGTCTCCACAGTGACGC-3' ； R:5, -CGCTGTCTGAGTGATCCCG-3,； 微衛星分子標記Pda315 的引物：L:5' -ACATCCTGCCTGAGGITCC-3' ； R:5, -TCTTAATGATGACGGCAGAGC-3,； 微衛星分子標記Pda316 的引物：L:5' -TGAGTGGCACGCTCCAAG-3' ； R:5, -CGAGGCCAAACTAACTGCG-3,； 微衛星分子標記Pda371 的引物：L:5' -CTGGITTCAACGGTGGACG-3' ； R:5' -GTGCGTGTCCCTGAACTTG-3' ； 2) 選擇體型、體色正常，無病無傷的大鱗副泥鰍個體作為備選親本群體1，對備選親本 群體1中的所有個體進行電子標記，并提取DNA; 3) 采用Pda66、Pdal74、Pda242、Pda247、Pda260、Pda288、Pda310、Pda316、Pda371 對備 選親本群體1進行基因型篩選，選取基因型為AA(對應Pda66)、FF(對應Pdal74)、EE(對應 Pda242)、NN(對應Pda247)、CC(對應Pda260)、CC或DD(對應Pda288)、CC(對應Pda310)、 BB或AA(對應Pda316)、AA或BB(對應Pda371)的個體作為備選親本群體2 ; 4) 采用Pda48、Pda301、Pda315對備選親本群體2進行基因型篩選，獲得基因型分別為 AA或FF(對應Pda48)、AA或BB(對應Pda301)、BB或CC(對應Pda315)的個體，將同一基 因位點具有相同基因型的個體進行單獨培育，分別建立備選親本群體3和備選親本群體4 ; 5) 以備選親本群體3為繁殖群體，進行人工繁殖一代獲得后備親本群體5 ;以備選親本 群體4為繁殖群體，進行人工繁殖一代獲得后備親本群體6 ; 6) 按照親本群體5中的雌性個體X親本群體6中的雄性個體或親本群體5中的雄性 個體X親本群體6中的雌性個體的配對方式進行規模化繁殖，即可獲得大鱗副泥鰍良種， 完成選育過程。
[0007] 在實際生產操作中，當步驟6)完成之后，可以重復步驟2)至步驟6)的操作，并監 控選育系遺傳背景，防止近親交配。
[0008] 優選的，在上述方案中，步驟1)中所述微衛星分子標記依下法獲得： a) 選取不同年齡及性別的大鱗副泥鰍，采集多種組織并提取RNA，等量移取并混合成 總RNA，分離出mRNA，反轉錄獲得cDNA文庫，PCR擴增富集后回收目的片段，定量后采用第 二代高通量測序平臺（IlluminaHiseq2000平臺）進行測序，測序后采用序列組裝軟件 (Trinity軟件）組裝測序片段，得到轉錄本序列； b) 采用微衛星分子標記捕獲軟件(Msatco_ander軟件）掃描步驟a)中獲得的轉錄本 序列，篩選出核心序列長度為10-360bp的微衛星分子標記，對側翼序列長度為50bp以上 的微衛星分子標記進行引物設計； c) 根據轉錄組GO功能注釋的結果，選取分類到生長過程條目的微衛星分子標記，加之 隨機選取的其他微衛星分子標記，共計合成微衛星引物400對； d) 收集不同地域的大鱗副泥鰍野生群體，觀察并比較其形狀差異，選取差異最大的群 體進行雜交，人工催產獲得全同胞家系群體； e) 隨機采用步驟b)中的微衛星分子標記對步驟d)中獲得的大鱗副泥鰍全同胞家系群 體中的個體進行掃描，進行微衛星分子標記與家系群體的生長性狀之間的相關分析，篩選 出12個與生長性狀相關的微衛星分子標記。
[0009] 此外，本發明還請求保護在上述大鱗副泥鰍良種選育方法中使用的12個微衛星 分子標記的引物。
[0010] 與現有技術相比，本發明的大鱗副泥鰍良種選育方法具有如下有益效果：分子標 記輔助育種（marker-assistantselection,簡稱MAS)利用分子標記從DNA水平上對育種 材料進行選擇，從而加快進程獲得具有目的性狀的后代。與傳統育種相比，MS方法具有迅 速、穩定、可靠的特點，實用性強、成本低、準確性高、不受環境等因素的影響，可擺脫對表型 性狀鑒定的依賴，在早世代進行選擇，從而大大縮短育種年限(理論上經過3代就可以選擇 出理想的優質種群)，提高育種效率，極具應用價值。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0011] 圖1為從不同性別的大鱗副泥鰍體內各組織中采集的RNA樣品的電泳圖。
[0012] 圖2為轉錄本序列長度分布圖。
[0013] 圖3為轉錄組GO功能注釋(生物過程水平）結果示意圖。
[0014] 圖4為12個微衛星分子標記在大鱗副泥鰍群體中的部分電泳圖，其中每個泳道 代表一個大鱗副泥鰍個體，M代表DNA分子量標準，條帶由上到下依次為1000bp，700bp， 500bp，400bp，300bp，200bp和100bp，由圖可知12個分子標記在群體中不同個體的帶型(基 因型）有明顯差異。

【具體實施方式】
[0015] 除非有相反陳述，下列用在說明書和權利要求書中的術語具有下述含義。
[0016] "良種"是指與養殖業中正在使用的同物種的多數養殖群體相比，具有比較優勢的 一個或多個經濟性狀的品種，其中養殖魚類的經濟性狀一般為生長性、出肉率、抗逆性等。
[0017] "良種選育"是指通過直接或間接篩選方法對基礎群體的一個或多個優良經濟性 狀進行世代選擇以獲得良種的過程。
[0018] "微衛星分子標記（MicrosatelliteMolecularMarker，MMM)" 是指一種遺傳標 記，又稱短串聯重復（ShortTandemRepeats，STR)或簡單重復序列（SimpleSequence R印eats，SSR)，是以1-6個堿基的序列串聯重復而成的DNA序列，長度一般在幾十到幾百個 喊基。
[0019] "高通量測序平臺"包括三種主流的第二代測序技術，分別為Roche/454焦磷酸測 序、Illumina/Solexa聚合酶合成測序和ABI/SOLiD連接酶測序技術，三種測序技術共有的 突出特征是單次運行產出序列數據量大，故而又被通稱為"高通量測序技術"。
[0020] "轉錄組GO功能注釋"是基于基因本體（GeneOntology,G0)對轉錄組數據進行的 基因功能注釋和分類方法，其包括生物過程、分子功能和細胞組件三個分支，屬生物信息學 范疇。
[0021] "基因型"是指決定物種特定性狀的遺傳物質(基因）表現形式，例如AA基因型代 表紅色花色性狀，BB基因型代表白色花色性狀，AB基因型代表粉色花色性狀。
[0022] "生長性狀"是指與生長相關的性狀，如體長、體高等，其中"全長"是指魚吻端到尾 鰭末端的長度；"體長"是指魚吻端到尾鰭基部或末端椎骨的長度；"體高"是指魚體的最大 高度；"體重"是指魚體的質量；"空殼重"是指去除內臟團后魚體的質量。
[0023] "基因型與生長性狀相關分析"是指利用統計學方法分析基因型與生長性狀(如體 長）有無相關性及相關性顯著程度。
[0024] "家系群體"是指用于遺傳圖譜繪制的試驗群體，包括全同胞家系(來源于相同父 母親的群體）和半同胞家系（同父異母或同母異父的群體)。
[0025] "備選親本群體"是指用于選擇人工繁殖用雌、雄親魚的性成熟群體。
[0026] "后備親本群體"是指將來用于選擇人工繁殖用雌、雄親本的群體，群體內個體不 一定性成熟。
[0027] "電子標記"又稱為電子標簽、射頻標簽、應答器、數據載體，是指利用有別于傳統 物理標記的，基于電子芯片的，可以通過注射器注射的標簽來標記不同受試動物的方法。
[0028] 較佳實施例：大鱗副泥鰍的良種選育。
[0029] 1、大鱗副泥鰍轉錄組數據庫的構建： 選大鱗副泥鰍家系群體的親本為實驗材料，雄鰍、雌鰍分別來自洞庭湖和洪澤湖。用 100mg/L的間氨基苯甲酸乙酯甲磺酸鹽（MS-222)進行麻醉后，采集雌雄泥鰍的多種組織 (雌、雄魚的肌肉、骨骼、鰭條、腦、脾臟、肝胰臟及雌魚的卵)，按說明書（D311A試劑，寶生物 工程(中國）有限公司）的要求置于RNA保存液中，凍存備用。具體操作如下： 采用TRIzof試劑（100ml，生命科學（中國）公司）提取上述各種組織的RNA(其電泳 圖如圖1所示，圖中每個泳道包含兩到三條帶，說明RNA質量較好，滿足測序要求)，質量檢 測合格后等量移取各種RNA最終混合成5iig總RNA，用帶有oligo(dT)的磁珠分離出具 有PolyA尾的mRNA，離子法打斷mRNA，然后用6堿基隨機引物反轉錄得到一鏈cDNA，加入 dNTPs、RNaseH和DNA聚合酶I合成二鏈cDNA。得到雙鏈cDNA之后通過T4連接酶末端補平 并且連接"A"堿基，最后連接index接頭。以上構建文庫的試劑盒是Truseq?RNAsample prepKit。對得到的文庫進行PCR擴增富集，然后用2%的瓊脂糖膠回收目的片段。用TBS380 對文庫進行定量，在Hiseq2000測序平臺上測序。測序后經過去冗余和低質量片段過濾后， 剩余39, 751，380條序列片段，加之大鱗副泥鰍兩個肌肉轉錄組序列樣本共計105, 308, 078 個片段（10. 47Gb)，采用Trinity軟件組裝測序片段，組裝后得到71，887個轉錄組序列，均 長1464. 58bp，總長度105, 284, 263bp，序列均長1464. 58bp，其中大于IOOObp的序列有 34, 603 (48. 1%)條，適于微衛星分子標記的批量挖掘(具體數據參見圖2)。
[0030] 2、批量開發大鱗副泥鰍微衛星分子標記： 采用Msatcommander軟件對所有轉錄組序列進行SSR篩選，參數設計為核心序列大于 12bp的，發現SSR位點有15106個，用Primer3. 0軟件對側翼序列>50bp的所有微衛星分 子標記進行引物設計，具體引物設計參數詳見表1。

【權利要求】
1. 一種大鱗副泥鰍良種選育方法，其包括以下步驟： 1) 提供12個微衛星分子標記，其各自對應的引物如下所示： 微衛星分子標記 Pda48 的引物：L :5' -TGAGGCACITTGTTTACGCTC-3' ； R:5, -GCTCATGGGACACAAGATGG-3,； 微衛星分子標記 Pda66 的引物：L :5' -TACCCTGTGCTAAGGAGGC-3' ； R :5' -AGAGGGAACGGCCAACAG-3,； 微衛星分子標記 Pdal74 的引物：L :5' -GTCGGACCTGAAGAGGCAC-3' ； R:5' -TGCCGTCTGTCATCCATGC-3' ； 微衛星分子標記 Pda242 的引物：L :5' -TGCCAGCAAITGACATAAAGGG-3' ； R:5' -GATTTCTCAAGCCCAGCGG-3' ； 微衛星分子標記 Pda247 的引物：L :5' -ATAGTGCCCGITTCCTGCC-3' ； R :5' -TGGTGAAAGAGTGAAACAATTACC-3' ；微衛星分子標記 Pda260 的引物：L : 5' -GCTCTGCTCCGAACATTCC-3' ； R:5' -CTTTCCGTCGCACCTTTCC-3' ； 微衛星分子標記 Pda288 的引物：L :5' -AGGTGTGGITTCAGGITGC-3' ； R :5, -ACAGAGGAAACCGGTGAGG-3,； 微衛星分子標記 Pda301 的引物：L :5' -CCTGTAGirGACCCAITTCGC-3' ； R：5, -AGAAGGGTGACTTGTCCAAAC-3,； 微衛星分子標記 Pda310 的引物：L :5' -GGGTCTCCACAGTGACGC-3' ； R:5, -CGCTGTCTGAGTGATCCCG-3,； 微衛星分子標記 Pda315 的引物：L :5' -ACATCCTGCCTGAGGITCC-3' ； R:5, -TCTTAATGATGACGGCAGAGC-3,； 微衛星分子標記 Pda316 的引物：L :5' -TGAGTGGCACGCTCCAAG-3' ； R:5, -CGAGGCCAAACTAACTGCG-3,； 微衛星分子標記 Pda371 的引物：L :5' -CTGGITTCAACGGTGGACG-3' ； R:5' -GTGCGTGTCCCTGAACTTG-3' ； 2) 選擇體型、體色正常，無病無傷的大鱗副泥鰍個體作為備選親本群體1，對備選親本 群體1中的所有個體進行電子標記，并提取DNA ; 3) 采用 Pda66、Pdal74、Pda242、Pda247、Pda260、Pda288、Pda310、Pda316、Pda371 對備 選親本群體1進行基因型篩選，選取基因型為Pda66對應的AA、Pdal74對應的FF、Pda242 對應的EE、Pda247對應的NN、Pda260對應的CC、Pda288對應的CC或DD、Pda310對應的 CC、Pda316對應的BB或AA、Pda371對應的AA或BB的個體作為備選親本群體2 ; 4) 采用Pda48、Pda301、Pda315對備選親本群體2進行基因型篩選，獲得基因型分別為 Pda48對應的AA或FF、Pda301對應的AA或BB、Pda315對應的BB或CC的個體，將同一基 因位點具有相同基因型的個體進行單獨培育，分別建立備選親本群體3和備選親本群體4 ; 5) 以備選親本群體3為繁殖群體，進行人工繁殖一代獲得后備親本群體5 ;以備選親本 群體4為繁殖群體，進行人工繁殖一代獲得后備親本群體6 ; 6) 按照親本群體5中的雌性個體X親本群體6中的雄性個體或親本群體5中的雄性 個體X親本群體6中的雌性個體的配對方式進行規模化繁殖，即可獲得大鱗副泥鰍良種， 完成選育過程。
2. 根據權利要求1所述的大鱗副泥鰍良種選育方法，其特征在于，在步驟6)完成之后 重復步驟2)至步驟6)的操作。
3. 根據權利要求1所述的大鱗副泥鰍良種選育方法，其特征在于，步驟1)中所述微衛 星分子標記依下法獲得： a) 選取不同年齡及性別的大鱗副泥鰍，采集多種組織并提取RNA，等量移取并混合成 總RNA，分離出mRNA，反轉錄獲得cDNA文庫，PCR擴增富集后回收目的片段，定量后采用 Illumina Hiseq 2000平臺進行測序，測序后采用Trinity軟件組裝測序片段，得到轉錄本 序列； b) 采用Msatcommander軟件掃描步驟a)中獲得的轉錄本序列，篩選出核心序列長度 為10-360 bp的微衛星分子標記，對側翼序列長度為50 bp以上的微衛星分子標記進行引 物設計； c) 根據轉錄組GO功能注釋的結果，選取分類到生長過程條目的微衛星分子標記，加之 隨機選取的其他微衛星分子標記，共計合成微衛星引物400對； d) 收集不同地域的大鱗副泥鰍野生群體，觀察并比較其形狀差異，選取差異最大的群 體進行雜交，人工催產獲得全同胞家系群體； e) 隨機采用步驟b)中的微衛星分子標記對步驟d)中獲得的大鱗副泥鰍全同胞家系群 體中的個體進行掃描，進行微衛星分子標記與家系群體的生長性狀之間的相關分析，篩選 出12個與生長性狀相關的微衛星分子標記。
4. 根據權利要求1至3中任一項所述的大鱗副泥鰍良種選育方法中使用的12個微衛 星分子標記的引物。
【文檔編號】A01K61/00GK104351096SQ201410606181
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年10月30日 優先權日:2014年10月30日
【發明者】凌去非, 李彩娟 申請人:蘇州大學