冷休克誘導大鱗副泥鰍雄核發育單倍體的方法
冷休克誘導大鱗副泥鰍雄核發育單倍體的方法
【專利摘要】本發明公開一種冷休克誘導大鱗副泥鰍雄核發育單倍體的方法，其特征在于：所述的方法按照以下步驟進行：取性腺發育良好的大鱗副泥鰍進行催產，分別取雄性大鱗副泥鰍的精液和雌性大鱗副泥鰍的卵子，將所得的精液用Kurokura’ssolution溶液稀釋80-120倍；將稀釋后的精子與卵子混合形成受精卵，將受精卵至于2.5-3.5℃的水中，冷休克處理50-70min，然后將受精卵放入常溫水中進行孵化。這是一種無需卵子失活、可快速、高效生產大鱗副泥鰍雄核發育單倍體的方法。
【專利說明】冷休克誘導大鱗副泥鰍雄核發育單倍體的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種魚類雄核發育單倍體的方法，特別是一種冷休克誘導大鱗副泥鰍雄核發育單倍體的方法。
【背景技術】
[0002]雄核發育(androgenesis)是指用精子生產只帶父系遺傳物質個體的繁殖方式。可用于純系的建立，同時可冷藏瀕危物種的精子，對物種的保護具有特殊的意義。另外，在水產養殖上，由于很多重要經濟魚類不同性別往往表現出不同的生產性能，如體型和體色的差異，生長速度的快慢，性成熟時間的不同等。如飼養137天后莫桑比克羅非魚的雄魚體重增長速度比雌魚快1.74倍；又如飼養2年的黃顙魚，雌性體重一般為10(T200 g，雄性體重一般為20(T350 g。所以，通過雄核發育控制魚類的性別，選擇具有最佳生長性能的雄性進行單性養殖，具有極為重要的應用價值。
[0003]關于人工誘導雄核發育的研究多見于魚類，已成功培育出川鰈{Platichthys/7(9仰5.)、馬蘇大麻哈魚(Pncorhynchus msow)、虹蹲{Oncorhynchus、溪紅點魚圭{Salvelinus fontinalus) > MH.{Cyprinus carpio)、顧P魚{Carassius auratus) > pf福羅非魚{Oreochroinis niloticus)、娘敗(Misgurnus 、大鱗副泥嫩iParamisgurnus dabryanus)、斑馬魚{Danio rerio)、虎皮魚(funtius tetrazona)等雄核發育二倍體。但是雄核發育二倍體的成活率極低。人工誘導魚類雄核發育的方法主要包括兩個步驟，即卵細胞染色體遺傳失活及精子染色體加倍。卵細胞染色體遺傳失活是人工誘導雄核發育的關鍵技術之一。在魚類雄核發育的誘導中Y射線、X射線及紫外線(UV)是常用的遺傳失活手段。此種滅活方法雖然簡單易行，但是用射線破壞卵子細胞核的同時，細胞質和其他細胞器也會遭受到不同程度的破壞，導致其受精后不能正常發育。因此現在需要一種新的雄核發育單倍 體的方法出現。
【發明內容】
[0004]本發明是為了解決現有技術所存在的上述不足，提出一種無需卵子失活、可快速、高效生產大鱗副泥鰍雄核發育單倍體的方法。
[0005]本發明的技術解決方案是:一種冷休克誘導大鱗副泥鰍雄核發育單倍體的方法，其特征在于:所述的方法按照以下步驟進行:
a、取性腺發育良好的大鱗副泥鰍進行催產，分別取雄性大鱗副泥鰍的精液和雌性大鱗副泥鰍的卵子，將所得的精液用Kurokura’ s solution溶液稀釋80-120倍，
b、將稀釋后的精子與卵子混合形成受精卵，將受精卵至于2.5-3.5°C的水中，冷休克處理50-70min,然后將受精卵放入常溫水中進行孵化。
[0006]本發明同現有技術相比，具有如下優點:
本發明所公開的誘導大鱗副泥鰍雄核發育單倍體的方法，是取雄性大鱗副泥鰍的精液及雌性大鱗副泥鰍的卵子形成受精卵，只用冷休克處理的方法，讓受精卵快速、高效的生產雄核發育單倍體。該方法無需卵子遺傳失活，也避免了繁瑣的操作程序，具有廉價、易操作等優點，解決了現有理化誘導對受精卵造成傷害的問題，提高了雄核發育單倍體泥鰍孵化率和成活率，有利于大規模生產使用。其市場前景十分廣泛，經濟潛力巨大。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0007]圖1是本發明實施例所制備的雄核發育單倍體大鱗副泥鰍染色體(n=24)的圖片。
[0008]圖2是對照組(2n早X 2n (6)大鱗副泥鰍染色體(2n=48)的圖片。
【具體實施方式】
[0009]下面將結合【專利附圖】
【附圖說明】本發明實施例的【具體實施方式】，如圖1、圖2所示:一種冷休克誘導大鱗副泥鰍雄核發育單倍體的方法，按照以下步驟進行:
取發育良好的雄性大鱗副泥鰍及雌性大鱗副泥鰍，用傳統的催產方法進行催產，水溫23土1°C，效應時間10-12小時，確認排卵后，輕壓腹部采集雌性大鱗副泥鰍的卵子，并用毛細管采集雄性大鱗副泥鰍的精液，所得精液用Kurokura’ s solution溶液稀釋80-12倍待用，其稀釋倍數以100倍為最佳；Kurokura’ s solution溶液的配制方法是現有技術，即NaCl 750 mg, CaCl2 20 mg, NaHC03 20 mg, KCl 20 mg 溶于 100 ml 蒸餾水中；
按現有技術的方法將稀釋后的精液與卵子混合形成受精卵，將受精卵放入2.5-3.50C的水中冷休克處理50-70min，其最佳水溫為3°C，最佳冷休克處理時間為60min，將上述處理后的受精卵置于常溫的水中進行孵化，孵化按照現有技術進行，如經常更換曝氣的水體，保持室內空氣新鮮和流動，及時用吸管吸出死卵等，孵化出的魚苗放入水槽中進行飼養。
[0010] 倍性檢測:
通過早期單個胚胎制片法對本發明實施例及對照組的大鱗副泥鰍體細胞染色體數目進行檢測，對照組與本發明實施例的區別是受精卵未經冷休克處理。
[0011]早期單個胚胎制片法為:取本發明實施例及對照組發育眼胞期的胚胎30-50個，用鑷子剖去卵膜和卵黃后，放入盛有0.0025%的秋水仙素中處理45min，0.8%的檸檬酸低滲20min，再用預冷的卡諾固定液(甲醇:冰醋酸=3:1)固定3次，每次15~20min，最后-20°C冷凍12h以上。冷滴片，10%吉姆薩染色，鏡檢，拍照。
本發明實施例照片如圖1所示:結果表明雄核發育大鱗副泥鰍染色體為單倍體(n=24)。
[0012]對照組照片如圖2所示:結果表明染色體為二倍體(2n=48)。
【權利要求】
1.一種冷休克誘導大鱗副泥鰍雄核發育單倍體的方法，其特征在于:所述的方法按照以下步驟進行: a、取性腺發育良好的大鱗副泥鰍進行催產，分別取雄性大鱗副泥鰍的精液和雌性大鱗副泥鰍的卵子，將所得的精液用Kurokura’ s solution溶液稀釋80-120倍， b、將稀釋后的精子與卵子混合形成受精卵，將受精卵至于2.5-3.5°C的水中，冷休克處理50-70min,然后將 受精卵放入常溫水中進行孵化。
【文檔編號】A01K61/00GK103651195SQ201310592906
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年11月22日 優先權日:2013年11月22日
【發明者】李雅娟, 姜志強, 周賀, 王玉生, 李佳奇 申請人:大連海洋大學, 李雅娟
【專利摘要】本發明公開一種冷休克誘導大鱗副泥鰍雄核發育單倍體的方法，其特征在于：所述的方法按照以下步驟進行：取性腺發育良好的大鱗副泥鰍進行催產，分別取雄性大鱗副泥鰍的精液和雌性大鱗副泥鰍的卵子，將所得的精液用Kurokura’ssolution溶液稀釋80-120倍；將稀釋后的精子與卵子混合形成受精卵，將受精卵至于2.5-3.5℃的水中，冷休克處理50-70min，然后將受精卵放入常溫水中進行孵化。這是一種無需卵子失活、可快速、高效生產大鱗副泥鰍雄核發育單倍體的方法。
【專利說明】冷休克誘導大鱗副泥鰍雄核發育單倍體的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種魚類雄核發育單倍體的方法，特別是一種冷休克誘導大鱗副泥鰍雄核發育單倍體的方法。
【背景技術】
[0002]雄核發育(androgenesis)是指用精子生產只帶父系遺傳物質個體的繁殖方式。可用于純系的建立，同時可冷藏瀕危物種的精子，對物種的保護具有特殊的意義。另外，在水產養殖上，由于很多重要經濟魚類不同性別往往表現出不同的生產性能，如體型和體色的差異，生長速度的快慢，性成熟時間的不同等。如飼養137天后莫桑比克羅非魚的雄魚體重增長速度比雌魚快1.74倍；又如飼養2年的黃顙魚，雌性體重一般為10(T200 g，雄性體重一般為20(T350 g。所以，通過雄核發育控制魚類的性別，選擇具有最佳生長性能的雄性進行單性養殖，具有極為重要的應用價值。
[0003]關于人工誘導雄核發育的研究多見于魚類，已成功培育出川鰈{Platichthys/7(9仰5.)、馬蘇大麻哈魚(Pncorhynchus msow)、虹蹲{Oncorhynchus、溪紅點魚圭{Salvelinus fontinalus) > MH.{Cyprinus carpio)、顧P魚{Carassius auratus) > pf福羅非魚{Oreochroinis niloticus)、娘敗(Misgurnus 、大鱗副泥嫩iParamisgurnus dabryanus)、斑馬魚{Danio rerio)、虎皮魚(funtius tetrazona)等雄核發育二倍體。但是雄核發育二倍體的成活率極低。人工誘導魚類雄核發育的方法主要包括兩個步驟，即卵細胞染色體遺傳失活及精子染色體加倍。卵細胞染色體遺傳失活是人工誘導雄核發育的關鍵技術之一。在魚類雄核發育的誘導中Y射線、X射線及紫外線(UV)是常用的遺傳失活手段。此種滅活方法雖然簡單易行，但是用射線破壞卵子細胞核的同時，細胞質和其他細胞器也會遭受到不同程度的破壞，導致其受精后不能正常發育。因此現在需要一種新的雄核發育單倍 體的方法出現。
【發明內容】
[0004]本發明是為了解決現有技術所存在的上述不足，提出一種無需卵子失活、可快速、高效生產大鱗副泥鰍雄核發育單倍體的方法。
[0005]本發明的技術解決方案是:一種冷休克誘導大鱗副泥鰍雄核發育單倍體的方法，其特征在于:所述的方法按照以下步驟進行:
a、取性腺發育良好的大鱗副泥鰍進行催產，分別取雄性大鱗副泥鰍的精液和雌性大鱗副泥鰍的卵子，將所得的精液用Kurokura’ s solution溶液稀釋80-120倍，
b、將稀釋后的精子與卵子混合形成受精卵，將受精卵至于2.5-3.5°C的水中，冷休克處理50-70min,然后將受精卵放入常溫水中進行孵化。
[0006]本發明同現有技術相比，具有如下優點:
本發明所公開的誘導大鱗副泥鰍雄核發育單倍體的方法，是取雄性大鱗副泥鰍的精液及雌性大鱗副泥鰍的卵子形成受精卵，只用冷休克處理的方法，讓受精卵快速、高效的生產雄核發育單倍體。該方法無需卵子遺傳失活，也避免了繁瑣的操作程序，具有廉價、易操作等優點，解決了現有理化誘導對受精卵造成傷害的問題，提高了雄核發育單倍體泥鰍孵化率和成活率，有利于大規模生產使用。其市場前景十分廣泛，經濟潛力巨大。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0007]圖1是本發明實施例所制備的雄核發育單倍體大鱗副泥鰍染色體(n=24)的圖片。
[0008]圖2是對照組(2n早X 2n (6)大鱗副泥鰍染色體(2n=48)的圖片。
【具體實施方式】
[0009]下面將結合【專利附圖】
【附圖說明】本發明實施例的【具體實施方式】，如圖1、圖2所示:一種冷休克誘導大鱗副泥鰍雄核發育單倍體的方法，按照以下步驟進行:
取發育良好的雄性大鱗副泥鰍及雌性大鱗副泥鰍，用傳統的催產方法進行催產，水溫23土1°C，效應時間10-12小時，確認排卵后，輕壓腹部采集雌性大鱗副泥鰍的卵子，并用毛細管采集雄性大鱗副泥鰍的精液，所得精液用Kurokura’ s solution溶液稀釋80-12倍待用，其稀釋倍數以100倍為最佳；Kurokura’ s solution溶液的配制方法是現有技術，即NaCl 750 mg, CaCl2 20 mg, NaHC03 20 mg, KCl 20 mg 溶于 100 ml 蒸餾水中；
按現有技術的方法將稀釋后的精液與卵子混合形成受精卵，將受精卵放入2.5-3.50C的水中冷休克處理50-70min，其最佳水溫為3°C，最佳冷休克處理時間為60min，將上述處理后的受精卵置于常溫的水中進行孵化，孵化按照現有技術進行，如經常更換曝氣的水體，保持室內空氣新鮮和流動，及時用吸管吸出死卵等，孵化出的魚苗放入水槽中進行飼養。
[0010] 倍性檢測:
通過早期單個胚胎制片法對本發明實施例及對照組的大鱗副泥鰍體細胞染色體數目進行檢測，對照組與本發明實施例的區別是受精卵未經冷休克處理。
[0011]早期單個胚胎制片法為:取本發明實施例及對照組發育眼胞期的胚胎30-50個，用鑷子剖去卵膜和卵黃后，放入盛有0.0025%的秋水仙素中處理45min，0.8%的檸檬酸低滲20min，再用預冷的卡諾固定液(甲醇:冰醋酸=3:1)固定3次，每次15~20min，最后-20°C冷凍12h以上。冷滴片，10%吉姆薩染色，鏡檢，拍照。
本發明實施例照片如圖1所示:結果表明雄核發育大鱗副泥鰍染色體為單倍體(n=24)。
[0012]對照組照片如圖2所示:結果表明染色體為二倍體(2n=48)。
【權利要求】
1.一種冷休克誘導大鱗副泥鰍雄核發育單倍體的方法，其特征在于:所述的方法按照以下步驟進行: a、取性腺發育良好的大鱗副泥鰍進行催產，分別取雄性大鱗副泥鰍的精液和雌性大鱗副泥鰍的卵子，將所得的精液用Kurokura’ s solution溶液稀釋80-120倍， b、將稀釋后的精子與卵子混合形成受精卵，將受精卵至于2.5-3.5°C的水中，冷休克處理50-70min,然后將 受精卵放入常溫水中進行孵化。
【文檔編號】A01K61/00GK103651195SQ201310592906
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年11月22日 優先權日:2013年11月22日
【發明者】李雅娟, 姜志強, 周賀, 王玉生, 李佳奇 申請人:大連海洋大學, 李雅娟
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