枯草芽孢桿菌h8-3及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一株枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)H8-3及在制備腐熟菌劑中的應用，枯草芽孢桿菌H8-3保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏日期為2013年10月21日，保藏編號為CCTCC NO：M 2013483，地址為湖北武漢武漢大學；本發明枯草芽孢桿菌H8-3耐高溫，在30℃-60℃均能存活，蛋白酶活性較高，且生長較迅速；利用該菌株制備的腐熟菌劑具有耐高溫，分泌蛋白酶、脂肪酶以高效發酵動物類廢棄物的優點，利用所述腐熟菌劑堆肥具有環境污染小、經濟易行等優點，堆肥處理后的產品經過后續處理，可以作為有機肥料達到變廢為寶的目的。
CCTCC NO：M 2013483
2013.10.21

CCTCC NO：M 2013482
2013.10.21

CCTCC NO：M 2013481
2013.10.21
【專利說明】枯草芽孢桿菌H8-3及其應用 (一）

【技術領域】
[0001] 本發明涉及一株枯草芽孢桿菌及應用，特別涉及一株枯草芽孢桿菌H8-3及其在 制備腐熟囷劑中的應用。 (二）

【背景技術】
[0002] 有機廢棄物常被當作垃圾送進垃圾場、焚化爐或者隨意丟棄。開發利用有機廢棄 物的方法是非常必要的，不光能保護環境，而且能變廢為寶。當前已經開發了不少利用有機 廢棄物的方法，但是大部分都是對纖維素、淀粉含量高的廢棄物的利用，而對含蛋白質與脂 肪較高的廢棄物的利用方法則較少。
[0003] 富含蛋白質與脂肪的廢棄物（如動物類廢棄物），如果直接丟棄，將產生大量的污 水、臭氣，污染環境，并有可能導致病菌傳播擴散，存在極大的安全隱患。目前世界范圍內處 理動物類廢棄物的方法主要包括深埋法、焚化法、和煉油法。但這些方法都各自存在這一些 諸如成本高、效率低或安全性差等不足之處。正是基于這一出發點，應用堆肥法處理動物 類廢棄物逐漸走入了人們的視線。堆肥法可以定義為利用自然界廣泛存在的微生物（細 菌、放線菌、真菌等）或商業菌株，有控制的促進可被生物降解的有機物向穩定的腐殖質轉 化的生物化學過程。由于堆肥過程受微生物種類、環境溫度等因素的影響較大，所以在沒 有人為添加菌劑的情況下堆肥發酵效率較低。所以亟待開發一種發酵效率高的菌劑以安全 環保又經濟的處理動物類廢棄物。
[0004] 本發明提供的菌劑具有耐高溫，分泌蛋白酶、脂肪酶以高效發酵動物類廢棄物的 優點。利用該菌劑堆肥具有環境污染小、經濟易行等優點，堆肥處理后的產品經過后續處 理，可以作為有機肥料達到變廢為寶的目的。 (三）


【發明內容】

[0005] 本發明目的是提供一種新菌株-枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)H8_3及在制 備腐熟菌劑中的應用，利用H8-3菌株制備的腐熟菌劑在適當的培養和發酵條件下，能高效 分解蛋白質、脂肪，在處理動物類廢棄物方面有良好的應用。
[0006] 本發明采用的技術方案是：
[0007] 本發明提供一株新菌株一枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)H8_3,保藏于中國 典型培養物保藏中心，保藏日期為2013年10月21日，保藏編號為CCTCC NO :M 2013483， 地址為湖北武漢武漢大學。
[0008] 枯草芽孢桿菌H8-3生理生化特征如下：在LB培養基上菌落呈乳白色，無光澤，邊 緣不整齊，表面有皺褶。好氧呼吸，在有氧條件下生長良好；革蘭氏染色陽性；在葡萄糖、蔗 糖、木糖、甘露糖、麥芽糖發酵試驗中可產酸；能水解明膠、淀粉和酪蛋白；還原石蕊牛奶； V-P測定陽性；甲基紅測定陰性。產蛋白酶，能耐60°C的高溫。
[0009] 本發明還提供所述枯草芽孢桿菌H8-3在制備腐熟菌劑中的應用，所述腐熟菌劑 由短短芽孢桿菌H3凍干粉、枯草芽孢桿菌H4凍干粉、枯草芽孢桿菌H8-3凍干粉和淀粉構 成，所述短短芽孢桿菌H3凍干粉與枯草芽孢桿菌H4凍干粉、枯草芽孢桿菌H8-3凍干粉和 淀粉質量比為1:1:1:97 ;
[0010] 所述短短芽孢桿菌H3凍干粉是由短短芽孢桿菌H3經發酵培養獲得的發酵液離 心，取沉淀冷凍干燥（優選-50°C?-KTC冷凍干燥12?24h，更優選-50°C冷凍干燥24h) 獲得的，所述短短芽孢桿菌（Brevibacillus brevis)H3,保藏于中國典型培養物保藏中心， 保藏日期為2013年10月21日，保藏編號為CCTCC NO :M 2013481，地址為湖北武漢武漢大 學；
[0011] 所述枯草芽孢桿菌H8-3凍干粉是由枯草芽孢桿菌H8-3經發酵培養獲得的發酵 液離心，取沉淀冷凍干燥（優選-50°C?-KTC冷凍干燥12?24h，更優選-50°C冷凍干燥 24h)獲得的。
[0012] 所述枯草芽孢桿菌H4凍干粉是由枯草芽孢桿菌H4經發酵培養獲得的發酵液離 心，取沉淀冷凍干燥（優選-50°C?-KTC冷凍干燥12?24h，更優選-50°C冷凍干燥24h) 獲得的，所述枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)H4,保藏于中國典型培養物保藏中心，保 藏日期為2013年10月21日，保藏編號為CCTCC NO :M 2013482,地址為：湖北武漢武漢大 學。
[0013] 本發明還提供一種所述腐熟菌劑在降解含蛋白質和/或脂肪的廢棄物中的應用， 具體所述的應用為：將腐熟菌劑加入到含蛋白質和/或脂肪的廢棄物中，在30°c?60°C下 降解反應1?4天（即將腐熟菌劑與廢棄物混合均勻后放置1?4天即可進行降解），降解 產物處理后作為植物有機肥再利用，所述處理優選常溫堆肥1?4周即可。
[0014] 進一步，優選所述腐熟菌劑與廢棄物重量比為0. 1?5 :100。
[0015] 進一步，優選所述降解的溫度為50°C?60°C。
[0016] 所述枯草芽孢桿菌H4生理生化特征如下：在LB培養基上菌落呈乳白色，無光澤， 邊緣不整齊，表面有皺褶。好氧呼吸，在有氧條件下生長良好；革蘭氏染色陽性；在葡萄糖、 蔗糖、木糖、甘露糖、麥芽糖發酵試驗中可產酸；能水解明膠、淀粉和酪蛋白；還原石蕊牛 奶；V-P測定陽性；甲基紅測定陰性。產蛋白酶，能耐70°C的高溫。
[0017] 短短芽孢桿菌H3生理生化特征如下：在LB培養基上菌落呈白色，無光澤，邊緣不 整齊，表面有皺褶。好氧呼吸，在有氧條件下生長良好；產脂肪酶，能耐60°C的高溫。
[0018]本發明所述枯草芽孢桿菌H8-3具有耐高溫（在30°C -80°c均能存活）、蛋白酶活 性較高，且生長較迅速的優點。
[0019] 本發明所述枯草芽孢桿菌H4凍干粉的制備方法為：
[0020] (1)斜面培養
[0021] 將枯草芽孢桿菌H4接種至斜面培養基，30°C?50°C培養1天，獲得斜面菌體；所 述斜面培養基終濃度組成為：牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，瓊脂粉15g/L，溶劑 為去離子水，pH值為7. 0 ;
[0022] (2)種子培養
[0023] 從斜面菌體挑取一接種環菌體接種至種子培養基，在30°C?70°C培養1天，獲得 種子液；所述種子培養基終濃度組成為：牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，溶劑為去 離子水，pH值為7. 0 ;
[0024] (3)發酵培養
[0025] 將種子液以體積濃度0. 1%?1%(優選0. 1%)的接種量接種至發酵培養基， 30°C?70°C、100?300rpm發酵培養1?2天，獲得發酵液，將發酵液離心，收集沉淀 在-50°C?-KTC冷凍干燥12?24h (優選-50°C冷凍干燥24h)，獲得所述枯草芽孢桿菌H4 凍干粉；所述發酵培養基終濃度組成為：葡萄糖30g/L，蛋白胨10 g/L，酵母膏10 g/L，氯化 鈉2 g/L，硫酸鎂0.5 g/L，磷酸氫二鉀1 g/L，磷酸二氫鉀1 g/L，溶劑為去離子水，pH值為 7. 2。
[0026] 本發明所述枯草芽孢桿菌H8-3凍干粉的制備方法為：
[0027] (1)斜面培養
[0028] 將枯草芽孢桿菌H8-3接種至斜面培養基，30°C?50°C培養1天，獲得斜面菌體； 所述斜面培養基終濃度組成為：牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，瓊脂粉15g/L，溶 劑為去離子水，pH值為7.0;
[0029] (2)種子培養
[0030] 從斜面菌體挑取一接種環菌體接種至種子培養基，在30°C?60°C培養1天，獲得 種子液；所述種子培養基終濃度組成為：牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，溶劑為去 離子水，pH值為7. 0;
[0031] (3)發酵培養
[0032] 將種子液以體積濃度0. 1%?1%(優選0. 1%)的接種量接種至發酵培養基， 30°C?60°C、100?300rpm發酵培養1?2天，獲得發酵液，將發酵液離心，收集沉淀 在-50°C?-KTC冷凍干燥12?24h(優選-50°C冷凍干燥24h)，獲得所述枯草芽孢桿菌 H8-3凍干粉；所述發酵培養基終濃度組成為：葡萄糖30g/L，蛋白胨10g/L，酵母膏10g/L， 氯化鈉2g/L，硫酸鎂0. 5g/L，磷酸氫二鉀lg/L，磷酸二氫鉀lg/L，溶劑為去離子水，pH值為 7. 2。
[0033] 本發明所述短短芽孢桿菌H3凍干粉的制備方法為：
[0034] (1)斜面培養
[0035] 將短短芽孢桿菌H3接種至斜面培養基，30?50°C培養1天，獲得斜面菌體；所述 斜面培養基終濃度組成為：牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaC110g/L，瓊脂粉15g/L，溶劑為去 離子水，pH值為7. 0;
[0036] (2)種子培養
[0037] 從斜面菌體挑取一接種環菌體接種至種子培養基，在30?60°C培養1天，獲得種 子液；所述種子培養基終濃度組成為：牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，溶劑為去離 子水，pH值為7.0;
[0038] (3)發酵培養
[0039] 將種子液以體積濃度0? 1%?1% (優選0? 1% )的接種量接種至發酵培養 基，30?60°C、100?300rpm發酵培養1?2天，獲得發酵液，將發酵液離心，收集沉淀 在-50°C?-KTC冷凍干燥12?24h (優選-50°C冷凍干燥24h)，獲得所述短短芽孢桿菌H3 凍干粉；所述發酵培養基終濃度組成為：葡萄糖30g/L，蛋白胨10g/L，酵母膏10g/L，氯化鈉 2g/L，硫酸鎂0. 5g/L，磷酸氫二鉀lg/L，磷酸二氫鉀lg/L，溶劑為去離子水，pH值為7. 2。
[0040] 本發明所述含蛋白質和/或脂肪的廢棄物是指自然死亡的家畜家禽，如雞、鴨、豬 等，以及它們屠宰后的廢棄物。
[0041] 與現有技術相比，本發明的有益效果主要體現在：本發明提供一株新菌株--枯草 芽孢桿菌H8-3,菌株H8-3耐高溫，在30°C -60°c均能存活，蛋白酶活性較高，且生長較迅速； 利用該菌株制備的腐熟菌劑具有耐高溫，分泌蛋白酶、脂肪酶以高效發酵動物類廢棄物的 優點，利用所述腐熟菌劑堆肥具有環境污染小、經濟易行等優點，堆肥處理后的產品經過后 續處理，可以作為有機肥料達到變廢為寶的目的。 (四）

【專利附圖】

【附圖說明】
[0042] 圖1枯草芽孢桿菌H4耐高溫實驗圖。
[0043] 圖2枯草芽孢桿菌H4蛋白水解圈實驗圖。
[0044] 圖3枯草芽孢桿菌H4蛋白酶活性實驗圖。
[0045] 圖4枯草芽孢桿菌H8-3耐高溫實驗圖。
[0046] 圖5枯草芽孢桿菌H8-3蛋白酶水解圈實驗圖。
[0047] 圖6枯草芽孢桿菌H8-3蛋白酶活性實驗圖。
[0048] 圖7短短芽孢桿菌H3耐高溫實驗圖。
[0049] 圖8短短芽孢桿菌H3脂肪酶水解圈實驗圖。
[0050] 圖9短短芽孢桿菌H3脂肪酶活性實驗圖。
[0051] 圖10豬肉經腐熟菌劑處理前后對比圖。
[0052] 圖11腐熟菌劑消化豬肉實驗中游離蛋白質含量變化圖。
[0053] 圖12腐熟菌劑消化豬肉實驗中粗脂肪含量變化圖。 (五）

【具體實施方式】
[0054] 下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述，但本發明的保護范圍并不僅限于 此：
[0055] 實施例1菌株篩選及鑒定
[0056] 1、菌株H4的篩選及鑒定
[0057] (1)培養基及試劑配方：
[0058] S0C液體培養基終濃度組成為：胰化蛋白胨20g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 0. 5g/ L、KC1 2. 5mmol/L、MgCl20. 01mol/L、葡萄糖 0? 02mol/L，溶劑為去離子水，pH 值 7. 0。
[0059] SOC固體培養基終濃度組成為：SOC液體培養基加質量終濃度1. 5%的瓊脂粉。
[0060] S0C液體培養基配制方法：配置每升培養基，在965ml去離子水中加入胰化蛋白胨 20g、酵母提取物5g、NaCl 0. 5g搖動容器使溶質完全溶解。加10ml 250mmol/L KC1水溶液， 用5mol/L NaOH調pH至7.0,在15psi(1.05kg/cm2)高壓下蒸汽滅菌20min。滅菌后的溶 液加入5ml過濾滅菌的2mol/L MgCl2，冷卻至60°C或60°C以下，加20ml過濾滅菌的lmol/ L葡萄糖水溶液。
[0061] 脫脂奶粉培養基終濃度組成：牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，脫脂奶粉 20g/L，15g/L瓊脂粉，溶劑為去離子水，pH值為7. 0。在15psi (1. 05kg/cm2)高壓下蒸汽滅 菌 20min。
[0062] LB液體培養基終濃度組成：牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，溶劑為去離 子水，pH值為7.0。在15psi(1.05kg/cm2)高壓下蒸汽滅菌20min。
[0063] LB平板終濃度組成：LB液體培養基加質量終濃度1. 5%的瓊脂粉。
[0064] (2) 土樣采集
[0065] 儲藏于杭州師范大學生物醫藥與健康研究中心的土樣：郴州汝城溫泉土壤。
[0066] (3)菌種初篩
[0067] 配制S0C液體培養基，滅菌冷卻后分裝，每根試管加入10ml培養基，加入土壤樣 品0. 5g，混勻后60°C水浴搖床震蕩3小時。無菌水稀釋103倍，涂布S0C固體培養基平板， 37°C培養20小時。
[0068] (4)菌種復篩
[0069] 挑取初篩平板生長良好的菌落接種于脫脂奶粉培養基，37°C培養20小時。觀察是 否有透明圈產生。得到一株能產生明顯透明圈的菌株，標記為菌株H4,保存。
[0070] (5)耐高溫實驗
[0071] 將菌株H4接種于LB液體培養基，37°C培養6小時。分裝于10ml試管，分別在30°C、 40°C、50°C、60°C、70°C、80°C、90°C的水浴搖床震蕩半小時，取出冷卻，無菌水稀釋10 5倍，取 200iil涂布于LB平板上，37°C培養18小時，計數生長的菌落（見圖1)。可見菌株H4能耐 70°C的高溫。
[0072] (6)蛋白酶活性實驗
[0073] 將菌株H4接種于脫脂奶粉培養基，37°C培養24小時，以無蛋白酶活性的大腸桿菌 作為對照。結果見圖2,表明H4具有蛋白酶活性。
[0074] 將菌株H4培養于LB液體培養基，37°C培養18小時，培養液離心，取上清。取 BSA(lmg/ml)(購于寶生物工程大連有限公司）100微升，加入100微升上清，50°C孵育0、5、 10、15、20、25、30分鐘，加入5ml考馬斯亮藍染色液終止反應。分光光度計測0D_吸收值。 結果見圖3,表明菌株H4能產蛋白酶。
[0075] (7) 16S rDNA測序鑒定菌種
[0076] 使用DNA提取試劑盒（購自杭州寶賽生物有限公司）提取菌株H4的DNA，以16S rDNA通用引物為引物，進行PCR擴增。擴增體系為16S rDNA通用引物1 iil，DNA模板 0.1 ill，dnTP2 iil，buffer 2 iil，rTaq 酶 0.2 iil，無菌水補足 20 ill。擴增條件為 95 °C 預 變性5min，32個循環（98°C變性lOsec ;58°C退火30sec ;72°C延伸2min)，16°C保持。擴增 序列由南京金斯瑞生物科技有限公司測定，菌株H4的16S rDNA全序列為SEQ ID. N01所 示。根據菌株H4的16S rRNA序列分析結果，結合生理生化試驗結果，在NCBI基因庫比對 后，確定菌株H4為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)，命名為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)H4〇
[0077] 引物：

【權利要求】
1. 枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)H8-3,保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏日 期為2013年10月21日，保藏編號為CCTCC NO :M 2013483,地址為湖北武漢武漢大學。
2. -種權利要求1所述枯草芽孢桿菌H8-3在制備腐熟菌劑中的應用。
【文檔編號】C05F17/00GK104328065SQ201410519534
【公開日】2015年2月4日 申請日期:2014年9月30日 優先權日:2014年3月28日
【發明者】黃黎鋒, 李海峰, 藍袁洋, 施建軍, 鐘丹成, 沈如玥 申請人:杭州法莫西生物醫藥科技有限公司