專利名稱：一種提高中國對蝦免疫力的方法
技術領域：
本發明屬于中國對蝦養殖領域，具體的說是交替投喂添加免疫增強劑的飼料和不添加免疫增強劑的飼料，以提高中國對蝦免疫力的方法。
背景技術：
中國對蝦的自身抵抗力較差，并且養殖水環境較大，難以針對性的用藥，因此，一旦感染病害，幾乎全池覆滅。水產養殖的行業特點決定了在對待水產業病害上“重在防治”， 因此如何提高水產動物的自身的免疫力，是搞好水產養殖的關鍵。免疫增強劑是一類可以提高生物機體免疫能力的物質，研究發現，肽聚糖、脂多糖、葡聚糖等微生物多糖及小肽、水解蛋白、益生菌等生物活性物質均能不同程度的提高生物機體的免疫力，增強抗病力；蛋白質在酶解過程中可以產生一些具有特殊生理功能的生物活性肽。生物活性肽在水產養殖中可提高成活率、提高飼料轉換率及促進對飼料中各種礦物質元素的利用率，具有抗菌、免疫、抗氧化作用以及調節肉制品風味等特性，李清等 (飼料研究，200 在“小肽對鯉魚免疫力的影響”一文中研究表明通過在鯉魚日糧中添加一定量的小肽，能顯著增加鯉魚血液中的免疫球蛋白和補體濃度。肽聚糖(ρ印tid0nglyCan，PGN)是細菌細胞壁的基本骨架。具有重要生理作用，如免疫調節、抵抗腫瘤、誘導睡眠等。也有研究表明，PGN對攝食也有調節作用。周進等(飼料與工業，2006)在牙鲆日糧添加一定劑量的A3-肽聚糖，結果表明牙鲆血清中總免疫球蛋白、免疫球蛋白M及白蛋白與球蛋白的比率在40d時顯著提高。然而在生產實踐中表明長期使用某種免疫增強劑不僅經濟成本高，而且中國對蝦還會對某一免疫增強劑產生免疫疲勞，從而導致免疫效果下降。

發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種提高中國對蝦免疫力的方法，以達到最優的免疫效果，并降低長期投喂免疫增強劑的養殖成本。為了解決上述技術問題，本發明是采取以下技術方案(1)免疫增強劑的獲得用酶水解魚肉法制備水解魚蛋白粉，制備方法已申請發明專利(申請號:20091022989. X)；(2)在中國對蝦基礎飼料中添加1. 4% (重量比)的水解魚蛋白粉，用逐級擴大混合的方法與飼料原料混合，制成顆粒飼料；(3)投喂所述添加1. 4%的水解魚蛋白粉的飼料與所述基礎飼料交替投喂中國對蝦。上述步驟⑵所述的基礎飼料，優選成份為魚粉40%、豆粕20%、高筋粉 23. 5%、膽堿0.5%、蝦粉10%、魚油1%、磷脂1.5%、復合維生素1%、復合礦物質1%、碳酸氫鈣1.5%。上述步驟(；3)所述的交替投喂中國對蝦，即投喂7天中國對蝦基礎飼料中添加1. 4%水解魚蛋白粉的飼料，然后投喂7天中國對蝦基礎飼料，如此循環。本發明的有益效果在中國對蝦基礎飼料中分別添加質量比為1. 4%的水解魚蛋白粉和0. 的肽聚糖，投喂方式為以下幾種每投喂7天添加1. 4%的水解魚蛋白粉飼料，然后投喂7天中國對蝦基礎飼料，如此循環；連續投喂基礎飼料；連續投喂添加1. 4%水解魚蛋白粉飼料；連續投喂添加0. 的肽聚糖飼料；投喂2天1. 4%水解魚蛋白粉飼料然后投喂5天基礎飼料和投喂7天1. 4%水解魚蛋白粉飼料然后投喂7天基礎飼料，對平均體重5. 23士0. 12g， 體長5. 2士0. 30cm的中國對蝦進行飼喂實驗，定期取樣檢測試驗中國對蝦的血液非特異性免疫指標，經過8周的養殖試驗，結果顯示每間隔7天投喂7天添加1. 4%的水解魚蛋白粉飼料的中國對蝦血清酚氧化酶活性、血清堿性磷酸酶活性、血清溶菌酶活性、血清超氧化物歧化酶活性與連續投喂水解魚蛋白粉組、肽聚糖組差異不顯著；血清過氧化物酶活性在第5周結束時顯著高于連續投喂水解魚蛋白粉組、肽聚糖組；存活率和增重率與連續投喂水解魚蛋白粉組差異不顯著；本發明在中國對蝦基礎飼料中添加1. 4%的水解魚蛋白粉，添加1. 4%的水解魚蛋白粉飼料與中國對蝦基礎飼料各交替投喂7天，與連續投喂添加1. 4%的水解魚蛋白粉飼料相比，能夠獲得相同的免疫效果，但能節省一半的經濟成本。


圖1酸性磷酸酶活性變化；圖2堿性磷酸酶活性變化；圖3溶菌酶活性變化；圖4 酚氧化酶活性變化；圖5過氧化物酶活性變化；圖6超氧化物歧化酶活性變化。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明作進一步的說明。1材料與方法1. 1水解魚蛋白粉和肽聚糖的制備水解魚蛋白粉制備同發明專利中國對蝦非特異免疫增強劑寡肽的制備與應用 (申請號20091022989.X)；肽聚糖由黃海水產研究所病研室贈送。1.2實驗飼料以魚粉和豆粕為主要蛋白源，魚油為主要脂肪源配制成基礎飼料，成份為魚粉 40%、豆粕20%、高筋粉23. 5%、膽堿0.5%、蝦粉10%、魚油1%、磷脂1.5%、復合維生素1%、復合礦物質1%、碳酸氫鈣1. 5% ；其中復合維生素(mg/kg or g/kg飼料)的成分為硫胺素，25mg ；核黃素，45mg ；鹽酸吡哆醇，20mg ；維生素B12,0. Img ；維生素K3, IOmg ；肌醇，800mg ；泛酸，60mg ；煙酸，200mg ；葉酸，20mg ；生物素，1. 20mg ；維生素A，32mg ；維生素D， 5mg ；維生素E，120mg ；次粉18. 67g ；復合礦物質(mg/kg or g/kg飼料)的成分為氟化鈉，2mg ；碘化鉀，0. 8mg ；氯化鈷，50mg ；硫酸銅，IOmg ；硫酸鐵，80mg ；硫酸鋅，50mg ；硫酸鎂， 1200mg ；磷酸二氫鈣，3000mg ；氯化納，IOOmg ；沸石粉，15. 51g。在中國對蝦基礎飼料中分別添加質量比為1.4%水解魚蛋白粉和0. 的肽聚糖，用逐級擴大混合的方法與基礎飼料原料混合，經螺桿擠條機制成直徑為1. 5mm的實驗飼料，60°C烘干后，剪切成3mm長的顆粒貯存于-20°C冰箱中待用，另制作不添加免疫增強
4劑的基礎飼料作為對照組實驗用料。1. 3實驗中國對蝦的管理中國對蝦取自黃海水產研究所鰲山衛基地，挑選個體大小均勻的健康中國對蝦 1500尾(體重5. 23 士0. 12g，體長5. 2 士0. 30cm)，用基礎飼料飽食投喂暫養10天，隨機分到 18個缸里進行飼養，每缸50尾。實驗分6種投喂方法Fm(對照)連續投喂中國對蝦基礎飼料；Fph 連續投喂中國對蝦基礎飼料中添加1. 4% (重量比)水解魚蛋白粉飼料；Fre 連續投喂中國對蝦基礎飼料中添加0. (重量比)肽聚糖的飼料；F2PH+5M 投喂2天中國對蝦基礎飼料中添加1. 4%水解魚蛋白粉飼料，然后投喂5天中國對蝦基礎飼料，如此循環； F7PH+7M 投喂7天中國對蝦基礎飼料中添加1. 4%水解魚蛋白粉飼料，然后投喂7天中國對蝦基礎飼料，如此循環；F7PH+7re 投喂7天中國對蝦基礎飼料中添加1. 4%水解魚蛋白粉飼料， 然后投喂7天中國對蝦基礎飼料中添加0. 肽聚糖的飼料，如此循環。每種投喂方法設3個平行組，飼養期間連續充氣，水溫M_28°C，鹽度ZAjegL—1， pH7. 8-8. 2，溶解氧不低于6. SmgL—1。每日換水1次，日換水量為1/3。每天投喂4次，投喂時間:6:00、11:00、18:00和23:00，養殖實驗進行8周。1. 4中國對蝦樣品的采集、分析與計算在8周中國對蝦養殖實驗期間，每周日取實驗中國對蝦血液測定免疫指標，8周實驗結束時稱重并計算存活率、增重率。1. 4. 1抗凝血的制備用Iml的無菌注射器從心臟部位進行取血，血淋巴與抗凝劑(抗凝劑檸檬酸 0. 48g、檸檬酸鈉1. 32g、葡萄糖1. 47g，加水至100ml，滅菌后備用)按照1 1的比例混合， 離心(3000Xg，4°C )，取上清液測測溶菌酶、過氧化物酶、酚氧化酶、超氧化物歧化酶、一氧化氮合酶、酸性磷酸酶和堿性磷酸酶活性，并進行血細胞記數。1.4. 2免疫指標測定酚氧化酶活性測定以L-多巴為底物，采用改進的Ashida方法在96孔酶標板中進行。在酶標儀O00m，Tecan)中振蕩4次，每隔^iin讀取490nm處的吸光值。在實驗條件下，每分鐘每毫克血清蛋白OD4i32增加0.001為一個酶活力單位(U min-1 mg pr_l)。酚氧化酶活力=103 (A終-A初)/C，其中A吸光度值，C為血清蛋白濃度。過氧化物酶活性測定、超氧化物歧化酶活性測定、酸性磷酸酶，堿性磷酸酶和溶菌酶活性測定均用南京建成試劑盒測定。1.4.3統計方法及計算各處理的數據進行單因素方差分析。當差異顯著(P < 0. 05)時，用Duncan’ s檢驗法進行均值間多重比較。統計分析所用的軟件為SPSS 11.5 for Windows。存活率(％) = NtX 100/N0 ；Nt為實驗結束時蝦體數；Ntl為實驗開始時蝦體數；增重率(%) = [ (Wt-W0) /W0] X 100 ；W0和Wt分別為初始體重和終末體重，t為實驗天數。2 結果2. 1不同投喂方法對中國對蝦血清非特異性免疫指標的影響2. 1. 1不同投喂方法對中國對蝦血清酸性磷酸酶活性的影響
血清酸性磷酸酶活性變化如圖1。Fph、Fre、F7PH+7M、F7PH+7PG組酸性磷酸酶活性在第一到第三周緩慢上升，第四、五周快速上升，第五周結束時血清酸性磷酸酶活力達到最高值，F7PH+7M 組顯著高于 Fpg、Fph、F7PH+7PG 組(P < 0. 05)，Fpg、Fph、F7PH+7PG 組間無顯著性差異(P > 0. 05)，第六到八周酸性磷酸酶活性基本呈下降趨勢；F2PH+5M組酸性磷酸酶活性在第四周結束達到最高值，對照組Fm組八周實驗期間酸性磷酸酶活性均顯著低于其他實驗組(P
<0. 05)，并且高低變化不大。2. 1. 2不同投喂方法對中國對蝦血清堿性磷酸酶活性的影響血清堿性磷酸酶活性變化如圖2。Fph、Fre、F7PH+7M、F7PH+7PG組對蝦血清堿性磷酸酶活性從第一周到第五周基本呈升高趨勢，在實驗第五周結束時堿性磷酸酶活力值最高，并且顯著高于 Fm、F2hmm 兩組(P < 0. 05)，Fph、Fpg、F7PH+7M、F7PH+7PG 組間無顯著性差異(P > 0. 05)， 第六周開始下降，Fm、F2PH+5M組變化波動不大。2. 1. 3不同投喂方法對中國對蝦血清溶菌酶活性的影響血清溶菌酶變化如圖3。FPH、Fre、F7PH+7M、F7PH+7re組血清溶菌酶活性以第五周結束時為分界點呈現先升高后降低的趨勢，在第五周結束時組血清溶菌酶活性達到最高，且著高于 Fm、F2PH+5M 組(P < 0. 05)，F7PH+7M 組顯著高于 Fra、Fre、F7PH+7re 組(P < 0. 05)，Fph 組顯著高于 Fpg 組(P < 0. 05)。2. 1. 4不同投喂方法對中國對蝦血清酚氧化酶活性的影響血清酚氧化酶活性變化如圖4。實驗第一周結束各組血清酚氧化酶活性無顯著性差異(P > 0. 05)，FPH、Fre、F7PH+7M、F7PH+7re組血清酚氧化酶活性從第二周開始上升，第三、四周加速上升，在第五周結束時血清酚氧化酶活性達到最高，并且顯著高于Fm組和F2PH+5M組(P
<0. 05)，FPH、Fre、F7PH+7M組間無顯著性差異(P > 0. 05)，從第六周到第八周血清酚氧化酶活性逐漸下降，在第八周結束時除F2PH+5M組外其他各組血清酚氧化酶活性均顯著高于Fm組對照組(P < 0. 05)。2. 1. 5不同投喂方法對中國對蝦血清過氧化物酶活性的影響 血清過氧化物酶活性變化如圖5。FPH、Fre、F2PH+5M、F7PH+7M、F7PH+7re組過氧化物酶活性呈現先升高后降低的趨勢，在第五周結束時各組過氧化物酶活性達到最高值，F7PH+7PG組F7PH+7M 組、Fre組、Fph組過氧化物酶活性顯著高于F2PH+5M組和Fm組，F7PH+7re組、F7PH+7M組、Fre組、Fph組間無顯著性差異(P < 0. 05)。2. 1. 6不同投喂方法對中國對蝦血清超氧化物歧化酶活性的影響血清超氧化物歧化酶活性變化如圖6。F7PH+7M組對蝦血清超氧化物歧化酶活性呈現高低交替變化的規律，其他各實驗組血清超氧化物歧化酶活性變化不大，各個時間段都維持在同一水平。2. 2不同投喂方法對中國對蝦生長性能的影響在中國對蝦基礎飼料中分別添加1. 4%的水解魚蛋白粉和0. 1 %肽聚糖通過不同的投喂方式飼喂中國對蝦，經過8周的養殖實驗，統計各實驗組的存活率和增重率，結果如表1。由表1可見，在實驗結束時F7PH+7M組與F7PH+7re組、Fph組、Fre組對蝦存活率無顯著性差異(P > 0. 05)，，Fm、F2PH+5M組存活率最低顯著低于其他組(P < 0. 05)。各實驗組中國對蝦增重率如表1。由表1可見，Fph、F7PH+7M、F7PH+7PG增重率顯著高于 Fm、F2PH+5M 組(P < 0. 05)，且 Fph、F7PH+7M、F7PH+7PG 組間無顯著性差異(P > 0. 05)，對照組 Fm 組對蝦增重率最低。表1.不同投喂方法對對蝦活率、增重率的影響(％ )
權利要求
1.一種提高中國對蝦免疫力的方法，其特征在于交替投喂中國對蝦基礎飼料和在中國對蝦基礎飼料中添加1. 4% (重量比)水解魚蛋白粉的飼料。
2.根據權利要求1所述的提高中國對蝦免疫力的方法，其特征在于交替投喂周期為7 天，即投喂7天中國對蝦基礎飼料中添加1. 4%水解魚蛋白粉的飼料，然后投喂7天中國對蝦基礎飼料，如此循環。
全文摘要
一種提高中國對蝦免疫力的方法，其特征在于交替投喂中國對蝦基礎飼料和在中國對蝦基礎飼料中添加1.4％(重量比)水解魚蛋白粉的飼料，即投喂7天中國對蝦基礎飼料中添加1.4％水解魚蛋白粉的飼料，然后投喂7天中國對蝦基礎飼料，如此循環。用本發明方法投喂中國對蝦，測定中國對蝦的血清酸性磷酸酶活性、血清酚氧化酶活性、血清溶菌酶活性、過氧化物酶活性變化、血清超氧化物歧化酶活性，與連續投喂水解魚蛋白粉組、肽聚糖組差異不顯著；存活率和增重率與連續投喂水解魚蛋白粉組差異不顯著；因此，使用本發明方法飼喂中國對蝦，與連續投喂基礎飼料中添加1.4％的水解魚蛋白粉飼料相比，能夠獲得相同的免疫效果，但能節省了一半的經濟成本。
文檔編號A23K1/18GK102224886SQ20111014388
公開日2011年10月26日 申請日期2011年5月31日 優先權日2011年5月31日
發明者李素紅, 梁萌青, 滕玉清, 鄭珂珂 申請人:中國水產科學研究院黃海水產研究所