專利名稱：一種小分子(＜15kd)發酵飼用多肽的制備方法
技術領域：
本發明涉及生物發酵技術領域，以豆粕、棉粕和麩皮為原料，利用微生物發酵 技術有效去除豆粕和棉粕中的主要抗營養因子，同時得到富含凝結芽孢桿菌的優質發酵 豆粕，尤其是一種固態發酵的制備分子量低于15道爾頓(KD)的飼用植物性多肽的工 藝。
背景技術：
近年來，進口優質魚粉、乳清粉價格大幅攀升，給飼料加工企業的生產帶來空 前的壓力，也給生物發酵餅粕產品帶來空前的發展機遇。開發進口優質動物蛋白(如魚 粉、血漿蛋白、腸膜蛋白等)替代產品，是實現飼料工業與養殖業的可持續發展，保持 乳仔豬養殖戶贏利能力的重要舉措發酵餅粕指是通過現代生物發酵技術對原料豆粕、棉粕、菜子粕等進行發酵處 理后的產物。發酵過程中可產生蛋白酶、非淀粉多糖酶等多種酶活，消除抗營養因子， 消解大豆抗原蛋白實現大豆生物脫敏，降解轉化有毒游離棉酚，把大分子量的餅粕蛋白 質分解為多肽、寡肽、甚至小肽，從而增加水溶性，提高消化率，利于動物消化吸收。 纖維類物質分解為糖，部分糖被轉化為乳酸，并產生大量有益微生物，使餅粕轉化成高 營養價值的功能性飼料。本發明技術主要針對上述的提供豆粕和棉粕營養價值的關鍵問題，通過研究芽 孢桿菌固體發酵的工藝參數，最終獲得一種富含小分子(< 15KD)發酵飼用多肽的制備 方法。為解決優質飼料蛋白資源緊缺特別是為幼齡動物提供優良蛋白原料和益生菌提供 了技術支撐。

發明內容
本發明的目的在于通過凝結芽孢桿菌固態生物發酵，提供一種小分子 (< 15KD)發酵飼用多肽的制備方法，促進豆粕和棉粕在幼齡動物飼喂中的有效應用， 解決優質蛋白飼料資源的緊缺問題。本發明的目的通過以下技術方案予以實現。本發明提供的一種小分子(< 15KD)發酵飼用多肽的制備方法，其步驟如下a.原始出發菌株凝結芽孢桿菌劃線在牛肉膏蛋白胨瓊脂斜面培養基上，30°C， 靜置培養48h進行活化。b.從斜面上挑取一環菌體，接種到牛肉膏蛋白胨液體培養基中，30°C， 200-250rpm,培養12_16h，作為種子液。在液體擴大牛肉膏蛋白胨液體培養基中，以 5%的接種量接種種子液，30°C，200-250rpm,培養OD6tltlnm = 4時，作為發酵接種液。C.將b中的發酵接種液以10%的接種量接種到餅粕發酵基料中(豆粕和棉粕粉碎 過20目，豆粕棉粕麩皮=4:4:2，料水比=1 0.9。)，混合均勻，于30°C發 酵48h。于60°C烘干，對發酵前后的餅粕進行營養成分分析。
本發明步驟a中所述的活化菌體的牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基按質量百分比含有 1.0%蛋白胨，0.5%氯化鈉，0.3%牛肉膏，2.0%瓊脂。本發明步驟b中所述的菌體種子液和擴大培養培養基按質量百分比含有1.0%蛋 白胨，0.5%氯化鈉，0.3%牛肉膏。本發明步驟a中所述的菌種為凝結芽孢桿菌(Bacillus Coagulans，CGMCC 1.2009) 1 株。本發明具有以下有益效果與其他化學和物理方法相比，本發明所用的微生物發酵法具有對飼料營養成分 的影響與破壞較小的特點。同時降低了豆粕和棉粕抗營養因子的含量，蛋白溶解度增 加，大分子蛋白質被明顯降解，從而大大提高了豆粕和棉粕的營養品質。通過專用軟 件(GlyKoBandScanVersion 5.0)針對餅粕發酵前后的蛋白的磷酸緩沖液抽提液(PBS， pH7.4 KH2PO4 0.24g/L, Na2HPO4 1.44g/L, NaCl 8.0g/L, KCl 0.2g/L)的三羥甲基甘氨 酸一十二烷基硫酸鈉一聚丙稀酰胺凝膠電泳(Tricine-SDS-PAGE)條帶濃度分析表明， 分子量大于45KDa的蛋白質在未發酵餅粕中平均占40%，發酵餅粕中平均為2% ；分子 量介于15KDa和45KDa之間的蛋白質在未發酵餅粕中平均占55%，發酵餅粕中平均為 35% ；分子量小于15KDa的蛋白質在未發酵餅粕中平均占5%，發酵餅粕中提高平均為 63% (表2).胰蛋白酶抑制劑含量由發酵前1.749mg/g降至發酵后0.082mg/g;發酵后水 解度為22.72%;從表2和圖1可以看出發酵餅粕中主要的抗原蛋白如β-伴球蛋白α 亞基(分子量為57-76KDa)和大豆球蛋白的5個亞基(分子量均大于58KDa)和棉粕中 有毒游離棉酚都得到有效地降解，從而可以降低其抗原性和毒性，益生菌凝結芽孢桿菌 達到5.0X 108CFU/g。有益微生物發酵植物性餅粕(豆粕和棉粕)基料的8大關鍵指標 包括小于15kD的小分子肽質量比例>60%，水解度>20%，真蛋白質表觀含量提高 2.55%,主要致敏蛋白降解率> 90%，胰蛋白酶抑制劑含量< 0.20mg/g，蛋白酶酶活> 1000U/g,棉酚含量< 80mg/Kg，益生菌凝結芽孢桿菌活菌數量> 1.0 X 108CFU/g，是一 種在現代畜牧業和飼料工業中有著重要應用前途的高值飼料蛋白。


圖1餅粕在發酵前后的Tricine-SDS-PAGE蛋白質電泳圖譜下面結合附圖對本發明做進一步說明。圖1為餅粕發酵前后的SDS-PAGE蛋白質電泳圖譜，其中泳道1為蛋白質分子 量標準，從上至下依次為94.0kDa，66.2kDa, 45.0kDa, 35.0kDa, 28.5kDa, 20.0kDa, 14.4kDa ；泳道2為未發酵基料樣品；泳道3為發酵餅粕產品。
具體實施例方式本發明提供的一種小分子(< 15KD)發酵飼用植物性多肽的制備方法的具體實 施方式如下本實施例所用的菌株為凝結芽孢桿菌(Bacillus Coagulans，CGMCC 1.2009)。a.l0g蛋白胨，5g氯化鈉，3g牛肉膏，定容至1L，加入20g瓊脂，加熱溶解后，
分裝到試管中，蒸汽滅菌121°C，20min,制成活化菌體的牛肉膏蛋白胨瓊脂斜面培養基。IOg蛋白胨，5g氯化鈉，3g牛肉膏，定容至1L，分裝到三角瓶，蒸汽滅菌121°C， 20min,制成菌體種子液和擴大培養液體培養基。b.原始出發菌株凝結芽孢桿菌劃線在牛肉膏蛋白胨瓊脂斜面培養基上，30°C， 靜止培養48h進行活化。C.從斜面上挑取一環菌體，接種到牛肉膏蛋白胨液體培養基中，30°C， 200-250rpm,培養12_16h，作為種子液。在液體擴大牛肉膏蛋白胨液體培養基中，以 5%的接種量接種種子液，30°C，200-250rpm,培養OD6tltlnm = 4時，作為發酵接種液。d.發酵接種液以10%的接種量接種到植物性餅粕發酵基料中(豆粕和棉粕粉碎 過20目，豆粕棉粕麩皮=4:4:2，料水比=1 0.9)，混合均勻，于30°C發酵 48h。于60°C烘干。e.對發酵前后的豆粕進行營養成分分析。經上述實例中微生物發酵法制備的植物源性小分子多肽與未發酵植物性餅粕相 比，營養特性得到明顯改善。豆粕發酵后，蛋白溶解度增加，大分子蛋白質被明顯降 解，通過專用軟件(GlyKo BandScan Version 5.0)針對豆粕、棉粕發酵前后的蛋白的PBS 抽提液(PBS pH7.4 KH2PO40.24g/L，Na2HPO41.44g/L, NaCl 8.0g/L, KCl 0.2g/L)的 Tricine-SDS-PAGE電泳條帶(圖1)濃度分析表明，分子量大于45KDa的蛋白質在未發 酵餅粕中平均占40%，發酵餅粕中平均為2%;分子量介于15KDa和45KDa之間的蛋白 質在未發酵餅粕中平均占55%，發酵餅粕中平均為35%;分子量小于15KDa的蛋白質 在未發酵餅粕中平均占5%，發酵餅粕中提高平均為63% (表2).胰蛋白酶抑制劑含量由 發酵前1.749mg/g降至發酵后0.082mg/g ；中性蛋白酶酶活> 1331U/g，發酵后水解度為 22.72%；豆粕中主要的抗原蛋白如β-伴球蛋白α亞基(分子量為57-76KDa)和大豆球 蛋白的5個亞基(分子量均大于58KDa)都得到有效地降解(表2和圖1)，從而可以降低 其抗原性；同時發酵培養基中棉粕所含有毒游離棉酚由330mg/Kg降低到77mg/Kg，降 低76.67% ；益生菌凝結芽孢桿菌達到5.0X 108CFU/g。通過凝結芽孢桿菌固態發酵以豆 粕和棉粕為主的飼料蛋白培養基，營養價值得到明顯改進，其效果見表1和表2。有益微 生物發酵植物性餅粕(豆粕和棉粕)基料所得產品的8大關鍵指標分別是小于15kD的 小分子肽質量比例> 60%，水解度>20%，真蛋白質表觀含量提高2.55%，主要致敏蛋 白降解率>90%，胰蛋白酶抑制劑含量<0.20mg/g，蛋白酶酶活> 1000U/g，棉酚含量 <80mg/Kg,益生菌凝結芽孢桿菌活菌數量>1.0X108CFU/g，是一種在現代畜牧業和飼 料工業中有著重要應用前途的高值飼料蛋白。表1培養基發酵前后成分的比較
權利要求
1.一種小分子(< 15KD)發酵飼用多肽的制備方法，其步驟為a.原始出發菌株凝結芽孢桿菌劃線在牛肉膏蛋白胨瓊脂斜面培養基上，30°C，靜置 培養48h進行活化。b.從斜面上挑取一環菌體，接種到牛肉膏蛋白胨液體培養基中，30°C， 200-250rpm,培養12_16h，作為種子液。在液體擴大牛肉膏蛋白胨液體培養基中，以 5%的接種量接種種子液，30°C，200-250rpm,培養OD6tltlnm = 4時，作為發酵接種液。C.將b中的發酵接種液以10%的接種量接種到植物性餅粕(豆粕和棉粕)發酵基料中 (豆粕和棉粕粉碎過20目，豆粕棉粕麩皮=4 4 2，料水比=1 0.9)，混合均 勻，于30°C發酵48h。于60°C烘干，對發酵前后的豆粕進行營養成分分析。
2.根據權利要求1所述的小分子(<15KD)發酵飼用多肽的制備方法，其步驟a所 述的活化菌體的牛肉膏蛋白胨瓊脂斜面培養基，IOg蛋白胨，5g氯化鈉，3g牛肉膏，定 容至1L，加入20g瓊脂，加熱溶解后，分裝到試管中，蒸汽滅菌121°C，20min。
3.根據權利要求1所述的小分子(<15KD)發酵飼用多肽的制備方法，其步驟b所述 的菌體種子液和擴大培養液體培養基，IOg蛋白胨，5g氯化鈉，3g牛肉膏，定容至1L， 分裝到三角瓶，蒸汽滅菌121°C，20min。
4.根據權利要求1所述的小分子(<15KD)發酵飼用多肽的制備方法，其步驟a所 述的菌種為凝結芽孢桿菌(Bacillus Coagulans, CGMCC 1.2009) 1株。
5.根據權利1，2，3，4制作的發酵植物性餅粕(豆粕和棉粕)產品的8大關鍵指標 如下小于15kD的小分子肽質量比例> 60%，水解度>20%，真蛋白質表觀含量提高 2.55%,主要致敏蛋白降解率> 90%，胰蛋白酶抑制劑含量<0.20mg/g，蛋白酶酶活> 1000U/g,棉酚含量< 80mg/Kg，益生菌凝結芽孢桿菌活菌數量> 1.0 X 108CFU/g，是一 種在現代畜牧業和飼料工業中有著重要應用前途的高值飼料蛋白。
全文摘要
一種小分子(＜15KD)發酵飼用多肽的制備方法本發明涉及生物發酵技術領域，以豆粕、棉粕和麩皮為原料，利用微生物發酵技術有效去除豆粕中的大豆抗營養因子和棉粕中的棉酚，同時得到富含凝結芽孢桿菌的優質發酵植物性餅粕，尤其是一種固態發酵的制備分子量低于15KDa的飼用植物性多肽的工藝。原始出發菌株凝結芽孢桿菌(Bacillus coagulans)1株經過活化，擴大培養后，OD600nm達到4時的培養液，作為餅粕發酵接種液。以10％的接種量接種到植物性餅粕發酵基料中(豆粕和棉粕粉碎過20目，豆粕∶棉粕∶麩皮＝4∶4∶2，料水比＝1∶0.9)，混合均勻，于30℃發酵48h。于60℃烘干，對發酵前后的豆粕進行營養成分分析。
文檔編號A23K1/00GK102008006SQ20091016950
公開日2011年4月13日 申請日期2009年9月8日 優先權日2009年9月8日
發明者楊雅麟, 滕達, 王建華, 田子罡 申請人:中國農業科學院飼料研究所