結合egfr和met的多功能抗體的制作方法
【專利摘要】提供多功能抗體和/或抗原結合片段，所述多功能抗體和/或抗原結合片段結合人表皮生長因子受體(EGFR)和MET并抑制其活性，并且在治療其中發病機理受EGFR和MET介導的癌癥和其他疾病、病癥或狀況中是有效的。
【專利說明】結合EGFR和MET的多功能抗體
[00011本發明涉及結合人表皮生長因子受體(EGFR)和MET的多功能抗體、其生產方法、包 含所述多功能抗體的藥物組合物及其用途。
[0002] EGFR是生長因子受體的1類酪氨酸激酶家族的成員，其在細胞生長、分化和存活中 起重要作用。這些受體的激活通常經特異性配體結合與酪氨酸激酶結構域的隨后自磷酸化 而發生。該激活引發涉及細胞增殖和存活的胞內信號傳導途徑的級聯。
[0003] 靶向EGFR并阻斷EGFR信號傳導途徑的癌癥療法的多種策略已經建立。小分子酪氨 酸激酶抑制劑例如吉非替尼和埃羅替尼阻斷胞內酪氨酸激酶區中EGFR的自磷酸化，由此抑 制下游信號傳導事件。面對抗EGFR酪氨酸激酶抑制劑的臨床使用的主要挑戰之一是癌癥對 這類療法的內在和獲得性抗性。另一方面，某些治療性單克隆抗體(mAb)靶向EGFR的胞外部 分，其導致阻斷配體結合并從而抑制導致細胞增殖的抑制的下游事件。已經批準嵌合小鼠/ 人抗EGFR單克隆抗體C225(或西妥昔單抗)和帕尼單抗(完全人抗EGFR mAb)用于治療轉移 性結腸直腸癌和頭頸癌，所述抗體靶向EGFR的外部。然而，其腫瘤含有KRAS突變的患者經常 無法從西妥昔單抗或帕尼單抗療法中獲益。KRAS突變通過持續發送生長信號（即使EGFR已 被阻斷)改變腫瘤細胞中的信號傳導特性。
[0004] MET，酪氨酸激酶超家族的一個成員，是人肝細胞生長因子(HGH的人受體。HGF結 合至MET導致受體二聚化或多聚化、胞內區中多個酪氨酸殘基的磷酸化、催化激活、和下游 信號傳導。MET還經不依賴于配體的機制進行激活，包括受體過表達、擴增和突變。MET激活 增強細胞增殖、迀移、形態發生和存活，其與侵襲性細胞表型和差的臨床結果相關。因此， MET也是抗癌療法的革E標。例如，onartuzumab，本領域中也稱為單臂（one-armed) 5D5、 0A5D5或MetMAb，已經開發用于癌癥的潛在治療，并且是衍生自MET激動性單克隆抗體的 人源化的、單價的、詰抗的抗MET抗體(參見，例如，Spigel, D.R.,等，Randomized Phase II Trial of Onartuzumab in Combination With Erlotinib in Patients With Advanced Non Small-Cell Lung Cancer, J. Clinical Oncology, 31(32):4105-4114 (November 2013)和Xiang H·，等，Onartuzumab (MetMAb):Using Nonclinical Pharmacokinetic and Concentration - Effect Data to Support Clinical Development, Clin Cancer Res·, (SOlSDeOnartuzumab結合MET并與MET保留在細胞表 面上，阻止HGF結合和隨后的MET磷酸化以及下游信號傳導活性和細胞應答。
[0005] WO 2010/059654描述了多種MET抗體，包括高親和力拮抗性抗體，所述抗體結合 MET的α-鏈內的表位并且在HGF存在或不存在的情況下并在通過獲得功能突變(其通常對已 知的MET拮抗劑是抗性的）表征的腫瘤中誘導MET內化和/或降解。公開于WO 2010/059654中 的MET抗體之一 LY2875358，已被報道不具有對MET的激動劑活性或另外具有對MET可忽略的 激動劑活性（參見，例如，Zeng, W·，等，104rd AACR Annual Meeting,海報#5465 (2013 年)）。
[0006] 美國專利號7，723，484描述了人源化和親合力優化的EGFR特異性抗體及其抗原結 合部分，其抑制EGFR的激活。更具體地，該專利尤其描述了全長單克隆抗體，其如通過在室 溫下進行的Sapidyne KINEXA所測量的，以亞皮摩爾結合親合力(Kd)結合人表皮生長因子 受體(EGFR)。
[0007] MET和EGFR共表達于許多腫瘤中。阻斷一種受體趨于上調另一種，頻繁地且經常迅 速導致對單一藥劑治療的抗性（Engelman, J.A.，等MET amplification leads to gef itinib resistance in lung cancer by activating ERBB3 signaling. Science , 2007; 316:1039-43)。相反地，暴露于抑制MET藥劑延長時期的MET擴增的肺癌細胞經EGFR 途徑發展抗性（McDermott，U ·，等，Acquired resistance of non-small cell lung cancer cells to MET kinase inhibition is mediated by a switch to epidermal growth factor receptor dependency, Cancer Res., 2010; 70(4):1625-34)〇 [0008] MET抗體和EGFR抗體的共施用需要注射兩種單獨的產品或單一注射兩種不同抗體 的共制劑。兩種注射允許劑量的量和時機的靈活性，但對于患者而言在依從性和疼痛上是 不便的。共制劑也可以提供劑量的量的一些靈活性，但通常是非常具有挑戰性的或不可能 發現允許兩種抗體的化學和物理穩定性的配制條件，這是由于兩種不同抗體的不同分子特 征。
[0009] WO 199509917公開了生產雙特異性、四價抗體的方法，其使用重組DNA技術，通過 產生融合至具有不同特異性的完整抗體的單鏈片段可變(scFv)抗體。這種基因融合體通過 轉染表達，產生具有雙特異性的四價抗體。然而，本領域中通常認為當遵循本領域中的教導 包括WO 199509917同時嘗試產生可用的雙特異性抗體時，技術人員通常會遇到與所產生的 雙特異性抗體的化學和物理穩定性相關的問題。常常是，在所產生的雙特異性抗體中需要 氨基酸改變以充分克服這些問題。本領域中既未說明對氨基酸改變的需要，也未說明將克 服所產生問題的實際改變。此外，需要的改變最經常地是非常規的或不是來源于公知常識。 同樣，通常發現，當相比于其親代抗體時，從已知抗體產生的雙特異性抗體在至少一種重要 的功能性藥代動力學或藥效動力學特性中是不那么令人滿意的。
[0010] PCT國際公開WO 2010/1 15551公開了三價、雙特異性抗人EGFR和MET抗體 (BsABOl)，其中單鏈Fab片段即單臂5D5融合至西妥昔單抗的兩個重鏈之一的羧基末端。已 報道相比于由單特異性、單價親代MET抗體誘導的MET的內化，BsABO 1降低MET的內化。在 0VCAR-8增殖測定中，相比于用西妥昔單抗和onartuzumab的組合的2%抑制，BsABO 1導致8% 抑制。在HGF存在的情況下，相比于用西妥昔單抗和onartuzumab的組合的10%抑制，BsABOl 導致15%抑制。
[0011] 另外地，已經公開了使用受控Fab臂交換(cFAE)，一種涉及在還原條件下混合兩種 親代抗體(在該情況下，具有對EGFR或MET的特異性）隨后再氧化的方法，生成靶向EGFR和 cMET的雙特異性抗體EMl-mAb (Moores, S·，等，EORTC Annual Meeting，海報 #B241 (2013年））。尤其報道了 EMl-mAb相比于單價對照抗體的組合在至少一種體外ERK磷酸化測 定中展示出優秀的活性。
[0012] 美國專利申請公開US 2014/0302029描述了生成靶向EGFR和CMET的雙特異性抗 體，其通過將基于西妥昔單抗序列的抗EGFR scFv與針對c-Met的小鼠抗體（即AbF46)的親 合力成熟且人源化的衍生物的IgG2 Fc的C末端融合而構建。
[0013] 因此，需要這樣的多功能抗體作為某些癌癥的有效藥物介入，所述多功能抗體以 高親合力結合MET和EGFR，有效中和通過HGF的MET激活和通過EGF家族配體的EGFR激活，和/ 或提供相比于單一藥劑的組合在內化和/或降解MET和EGFR(野生型和突變體兩者）中優秀 的活性。具體而言，期望的是這樣的抗MET/EGFR抗體，其i )可以更有效地治療特征在于具有 一個或多個KRAS突變的癌癥，ii)相比于單一藥劑的相關組合，證明在預防或延遲對其他 MET和/或EGFR抑制劑的抗性的發展中的優秀活性，所述其他MET和/或EGFR抑制劑包括但不 限于埃羅替尼、吉非替尼、拉帕替尼和維羅非尼，iii)引起最低的或不引起可測量的激動劑 活性，和/或iv)證明體內穩定性、物理和化學穩定性包括但不限于熱穩定性、溶解性、低自 結合和對于開發和/或用于治療癌癥可接受的藥代動力學特征。然而，盡管普遍按照WO 199509917中的教導，當嘗試產生包含WO 2010/059654的某些抗MET抗體和美國專利號7， 723，484的某些抗EGFR抗體的四價、多功能抗MET/EGFR抗體時，本發明人遇到與化學和物理 穩定性以及關于靶受體MET和EGFR之一或兩者的期望的結合特性的喪失相關的明顯的問 題。因此，需要涉及許多氨基酸改變的廣泛的工程化工作以足以克服這些問題。本領域中既 未暗示對實際改變的需求也未暗示實際改變。此外，若干改變不是常規的或不是來源于公 知常識。類似地，親本抗體本身不具有這些問題，表明關鍵區域周圍的局部環境與多功能抗 MET/EGFR抗體的環境并不同。
[0014]因此，本發明提供了結合EGFR和MET的四價多功能抗體。這些多功能抗體誘導EGFR 和MET在細胞表面上的共定位、MET的內化和/或降解、和令人驚奇的是，相比于西妥昔單抗 在具有高MET表達的腫瘤細胞中EGFR甚至更大的內化和降解。此外，這些抗MET/EGFR多功能 抗體展示在具有低至中等MET表達的腫瘤細胞中比親本抗MET抗體更高的結合MET的抗體親 抗原性。
[0015] 因此，本發明提供了結合EGFR和MET的四價多功能抗體。這些多功能抗體誘導EGFR 和MET在細胞表面上的共定位、MET的內化和/或降解、和令人驚奇的是，相比于西妥昔單抗 在具有高MET表達的腫瘤細胞中EGFR甚至更大的內化和降解。此外，這些抗MEG/EGFR多功能 抗體展示在具有低至中等MET表達的腫瘤細胞中比親本抗MET抗體更高的結合MET的抗體親 抗原性。此外，這些多功能抗MET/EGFR抗體相比于兩種單獨抗體的組合在抑制細胞培養物 中以及小鼠異種移植模型中的腫瘤細胞生長中展示出優秀的活性。它們還似乎在恢復對各 種靶療法包括埃羅替尼和PLX4032(即，B-Raf抑制劑)在HGF和/或EGF存在的情況下的腫瘤 細胞敏感性中比單獨的MET和EGFR抗體的組合具有優秀的活性。此類抗MET/EGFR抗體還可 以證實針對高EGFR表達的腫瘤、或對于一種或多種抗EGFR抗體(例如西妥昔單抗、帕尼單抗 等)和/或EGFR的一種或多種小分子抑制劑(例如埃羅替尼）具有抗性或已變得有抗性的腫 瘤(包括但不限于攜帶KRAS突變的腫瘤)是更有效的。在本發明的各種實施方案中，這些多 功能抗體同時結合MET和EGFR，中和MET通過HGF的激活和EGFR通過EGF的激活，抑制許多類 型的表達MET和EGFR的癌細胞的配體依賴性和配體不依賴性的細胞增殖，誘導EGFR和MET在 細胞表面上的共定位，誘導MET的內化和/或降解，和令人驚奇地，相比于西妥昔單抗在具有 高MET表達的腫瘤細胞中EGFR甚至更大的內化和降解。
[0016] 本發明的實施方案是多功能抗體，其包含： (a)抗體，所述抗體結合MET并包含： i) 重鏈，所述重鏈包含分別由GYTFTDYYMH (SEQ ID NO: 11)、RVNPNRRGTTYNQKFEG (SEQ ID NO: 12)和ARANWLDY (SEQ ID NO: 13)的氨基酸序列組成的重鏈互補性決定區域 (CDR)HCDRl、HCDR2和HCDR3;和 ii) 輕鏈，所述輕鏈包含分別由SVSSSVSSIYLH (SEQ ID NO: 14)、YSTSNLAS (SEQ ID NO: 15)和QVYSGYPLT (SEQ ID NO: 16)的氨基酸序列組成的輕鏈CDR LCDR1、LCDR2和 LCDR3;和 (b) scFv多肽，所述scFv多肽結合人EGFR并包含： i) HCVR結構域，所述HCVR結構域包含分別由氨基酸序列GFSLTNYGVH (SEQ ID NO: i)、vixiSggntdyntpfx2g (seq id no: 9)(其中Xi為Y或w且X2Skstmparaldyydydfay (SEQ ID NO: 3)組成的scFv CDR scFv-HCDR1、scFv-HCDR2和SCFV-HCDR3;和 ii) LCVR結構域，所述LCVR結構域包含分別由氨基酸序列RASYSIGTNIH (SEQ ID NO: 4)、XiYAX2X3SIS (SEQ ID NO: 10)(其中Xi為R或Y，X2為K或S，且X3為E或R)和QQNNAWPTT (SEQ ID NO: 6)組成的scFv CDR scFv-LCDRl、scFv-LCDR2和scFv-LCDR3,并且其中所述 s cFv多肽的C末端經肽接頭融合至MET抗體重鏈的N末端。
[0017] 本發明的另一實施方案是多功能抗體，其包含： (a) 抗體，所述抗體結合MET并包含： i) 第一重鏈和第二重鏈，其中每一重鏈包含分別由GYTFTDYYMH (SEQ ID NO: 11)、 RVNPNRRGTTYNQKFEG (SEQ ID NO: 12)和ARANWLDY (SEQ ID NO: 13)的氨基酸序列組成的 重鏈CDR HCDRUHCDR2和HCDR3;和 ii) 第一輕鏈和第二輕鏈，其中每一輕鏈包含分別由SVSSSVSSIYLH (SEQ ID NO: 14)、YSTSNLAS (SEQ ID NO: 15)和QVYSGYPLT (SEQ ID NO: 16)的氨基酸序列組成的輕鏈 CDR LCDRl、LCDR2和LCDR3;和 (b) 第一scFv多肽和第二scFv多肽，其中每一scFv多肽結合人EGFR并且其中每一scFv 多肽包含： i) HCVR結構域，所述HCVR結構域包含分別由氨基酸序列GFSLTNYGVH (SEQ ID NO: i)、vixiSggntdyntpfx2g (SEQ id no: 9)(其中Xi為Y或w且X2Skstmparaldyydydfay (SEQ ID NO: 3)組成的scFv CDR scFv-HCDR1、scFv-HCDR2和SCFV-HCDR3;和 ii) LCVR結構域，所述LCVR結構域包含分別由氨基酸序列RASYSIGTNIH (SEQ ID NO: 4)、XiYAX2X3SIS (SEQ ID NO: 10)(其中Xi為R或Y，X2為K或S，且X3為E或R)和QQNNAWPTT (SEQ ID NO: 6)組成的scFv CDR scFv-LCDRl、scFv-LCDR2和scFv-LCDR3,并且其中第一 scFv多肽的C末端經肽接頭融合至第一重鏈的N末端并且第二scFv多肽的C末端經肽接頭融 合至第二重鏈的N末端。
[0018] 本發明的進一步的實施方案為多功能抗體，其包含兩個第一多肽和兩個第二多 肽，其中兩個第一多肽包含SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 52或SEQ ID NO: 53的氨基酸序列；且兩個第二多肽包含 SEQ ID NO: 33的氨基酸序列，且其中所述多功能抗體結合EGFR和MET。
[0019] 本發明的另一實施方案是藥物組合物，其包含任一前述的多功能抗體、或其MET和 EGFR結合片段、和藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。
[0020] 本發明的另一實施方案是任一前述的多功能抗體、或其MET和EGFR結合片段，其用 于治療。
[0021] 本發明的另一實施方案是任一前述的多功能抗體、或其MET和EGFR結合片段，其用 于治療癌癥。
[0022]本發明的另一實施方案是任一前述的多功能抗體、或其MET和EGFR結合片段，其用 于治療其中MET和EGFR兩者均由患者腫瘤表達的癌癥。
[0023]本發明的另一實施方案是任一前述的多功能抗體、或其MET和EGFR結合片段，其用 于治療其中MET和/或EGFR由患者腫瘤以低、中等、或高水平表達的癌癥和/或腫瘤或對于一 種或多種抗EGFR抗體(例如西妥昔單抗、帕尼單抗等）和/或EGFR的一種或多種小分子抑制 劑(例如埃羅替尼)具有抗性或已變得有抗性的腫瘤(包括但不限于攜帶KRAS突變的腫瘤）。 在本發明的多種實施方案中，多功能抗體或其MET和EGFR結合片段用于治療其中MET和/或 EGFR由患者腫瘤以低、中等、或高水平表達的癌癥和/或對于一種或多種抗EGFR抗體(例如 西妥昔單抗、帕尼單抗等)和/或EGFR的一種或多種小分子抑制劑(例如埃羅替尼)具有抗性 或已變得有抗性的腫瘤(包括但不限于攜帶一個或多個KRAS突變的腫瘤）的用途可以進一 步包括在向患者施用本發明的多功能抗體或其MET和EGFR結合片段的步驟前，鑒定需要癌 癥治療的患者的步驟。
[0024]本發明的另一實施方案是任一前述的多功能抗體或其MET和EGFR結合片段，其用 于治療NSCLC、SCLC、胃癌、結腸直腸癌、膽管癌、食道癌、黑素瘤包括但不限于葡萄膜黑素 瘤、腎癌、肝癌、膀胱癌、子宮頸癌、或頭頸癌。
[0025]本發明的另一實施方案是治療癌癥的方法，所述方法包括向有需要的人患者施用 有效量的任一前述多功能抗體、或其MET和EGFR結合片段。
[0026] 圖1說明顯示抗]\^1'/^6?1?多功能抗體順-￥1(和順-!19誘導癌細胞系!11993 (吧(^〇、 MKN45 (胃癌)和H441 (NSCLC)中EGFR和MET降解的western印跡結果。將癌細胞系用100 nM 抗體NH-YK、抗體NH-H9或對照抗體處理過夜。通過細胞裂解物的western印跡測定EGFR和 MET降解。抗MET/EGFR多功能抗體NH-YK和NH-H9觸發了顯著的EGFR降解，然而西妥昔單抗或 親本抗MET抗體和西妥昔單抗的組合卻不會觸發。泳道I: higG4;泳道2 :抗MET Ab;泳道3 : 西妥昔單抗;泳道4抗MET Ab +西妥昔單抗;泳道5: NH-YK;泳道6: NH-H9。
[0027]圖2是顯示相比于施用媒介物對照或親本抗Met抗體和西妥昔單抗的組合(86.1% 的17^%)，施用抗腿1^6?1?多功能抗體順-￥1(導致在!11993小鼠異種移植模型中的腫瘤體積 的顯著更大降低(28.5%的T/C% ;p〈0.001)的圖。
[0028]圖3是顯示相比于施用媒介物對照或親本抗Met抗體和西妥昔單抗的組合，施用抗 MET/EGFR多功能抗體NH-YK導致在H441小鼠異種移植模型中的腫瘤體積的顯著更大降低 (28 · 5% 的 T/C% ;ρ〈0·001)的圖。
[0029]圖4是顯示相比于施用媒介物對照，施用抗MET/EGFR多功能抗體NH-YK導致在EBC-1 NSCLC小鼠異種移植模型中的腫瘤體積的顯著更大降低(32.9%的T/C%; p〈0.001)的圖。
[0030] 圖5是顯示相比于施用親代MET抗體和西妥昔單抗的組合(分別T/C% = 17.4%，P 〈0.001和18.6%，P〈 0.001)或媒介物對照，施用抗MET/EGFR多功能抗體NH-YK導致在 MKN45胃異種移植模型中相當的抗腫瘤效力的圖。
[0031] 圖6是顯示以27 mg/kg施用抗MET/EGFR多功能抗體H9在攜帶H1993 NSCLC異種移 植物的免疫缺陷小鼠中導致比任何其他治療顯著更高的抗腫瘤效力的圖。利用媒介物對 照、抗MET/EGFR多功能抗體H9(4和27 mg/kg)、單獨抗MET(3和20 mg/kg)、西妥昔單抗（3 和20 mg/kg)或抗MET加西妥昔單抗的組合(3 mg/kg和20 mg/kg的每種抗體)每周一次處理 小鼠異種移植物，持續連續5周。
[0032] 圖7是顯示以27 mg/kg施用抗MET/EGFR多功能抗體H9在攜帶H441異種移植物的免 疫缺陷小鼠中導致比任何其他治療顯著更高的抗腫瘤效力的圖。利用媒介物對照、抗MET/ EGFR多功能抗體H9(4和27 mg/kg)、單獨抗MET(3和20 mg/kg)、西妥昔單抗（3和20 mg/ kg)或抗MET加西妥昔單抗的組合(3 mg/kg和20 mg/kg的每種抗體)每周一次處理小鼠異種 移植物，持續連續5周。
[0033] 術語"EGFR"、"ErbBΓ和"EGF受體"在本文中互換用于指EGFR蛋白（參見例如， UniProtKB/Swiss-Prot登錄P00533)。在本文中，"EGFR胞外結構域"或"EGFR ECD"指細胞外 的EGFR結構域，其錨定在細胞膜上，或處于循環中，包括其片段。在一個實施方案中，EGFR的 胞外結構域可以包含四個結構域："結構域Γ (從約1-158的氨基酸殘基）、"結構域II"（氨基 酸殘基159-336)、"結構域III"（氨基酸殘基337-470)，和"結構域IV"（氨基酸殘基471-645)，其中邊界是大概的，并且可以有約1-3個氨基酸的變異。
[0034] 術語"MET多肽"、"MET受體"、"MET"、"HGF受體"或"HGFR"在本文中互換使用，并且 除非另有說明，旨在指人受體酪氨酸激酶，以及其功能活性的突變形式，其結合人肝細胞生 長因子。MET的具體實例包括，例如GenBank登錄號NM_000245中提供的核苷酸序列編碼的人 多肽，或GenBank登錄號NP_000236中提供的多肽序列編碼的人蛋白質。將MET的結構圖示性 地描述為：
SEMA: S ema結構域 PSI: Plexin、信號素和整聯蛋白結構域 IPT: 4個免疫球蛋白、Plexins和轉錄因子結構域 TM: 跨膜區 JM: 近膜結構域 KD: 激酶結構域。
[0035] 人MET的胞外結構域(在本文中，MET-ECD)具有例如SEQ ID NO: 35中所示的氨基 酸序列。然而，SEQ ID NO: 35的氨基酸1-24包含信號序列。因此，除非另有說明，如本文所用 的術語"MET-ECD"表示分別以SEQ ID NO: 35的氨基酸25和932開始和結束的成熟蛋白 (即，SEQ ID NO: 36KSEMA結構域由MET的N末端的大概500個氨基酸殘基組成，并且含有<1-鏈（SEQ ID NO: 35的氨基酸殘基25-307(8卩，SEQ ID NO: 37)和β-鏈的部分（SEQ ID NO: 35的氨基酸殘基308-519(即，SEQ ID NO: 38))。
[0036]如本文所用，對于MET或EGFR對腫瘤或細胞系的細胞表面表達，術語"低"、"中等" 和"高"分別旨在表示每個細胞少于約30萬，高于約30萬，和高于約100萬個受體。
[0037] 如本文所用，"多功能抗體"指這樣的分子，其包含具有一種抗原結合特異性的抗 體和具有不同抗原結合特異性的抗原結合片段。優選地，多功能抗體指這樣的分子，其包含 i)對MET具有抗原結合特異性的抗體，和ii)對EGFR具有抗原結合特異性的單鏈可變片段 (ScFv)0
[0038] 除非另有說明，如本文所用，術語"抗體"旨在指包含通過二硫鍵互相連接的兩條 重鏈(HC)和兩條輕鏈(LC)的免疫球蛋白分子。每一條鏈的氨基末端部分包括經其中包含的 CDR主要負責抗原識別的約100-約110個氨基酸的可變區。每一條鏈的羧基末端部分確定主 要負責效應子功能的恒定區。
[0039] 除非另有說明，對于本發明的多功能抗體，如本文所用，術語"NH-YK"旨在指包含 兩個第一多肽和兩個第二多肽的多功能抗體，其中兩個第一多肽包含SEQ ID NO: 27的氨 基酸序列;并且兩個第二多肽包含SEQ ID NO: 33的氨基酸序列，并且其中所述多功能抗體 結合EGFR和MET。
[0040] 除非另有說明，對于本發明的多功能抗體，如本文所用，術語"NH-H9"旨在指包含 兩個第一多肽和兩個第二多肽的多功能抗體，其中兩個第一多肽包含SEQ ID NO: 29的氨 基酸序列;并且兩個第二多肽包含SEQ ID NO: 33的氨基酸序列，并且其中所述多功能抗體 結合EGFR和MET。
[0041] 除非另有說明，對于本發明的多功能抗體，如本文所用，術語"H9"旨在指包含兩個 第一多肽和兩個第二多肽的多功能抗體，其中兩個第一多肽包含SEQ ID NO: 52的氨基酸 序列;并且兩個第二多肽包含SEQ ID NO: 33的氨基酸序列，并且其中所述多功能抗體結合 EGFR和MET。
[0042] 除非另有說明，對于本發明的多功能抗體，如本文所用，術語"YK"旨在指包含兩個 第一多肽和兩個第二多肽的多功能抗體，其中兩個第一多肽包含SEQ ID NO: 31的氨基酸 序列;并且兩個第二多肽包含SEQ ID NO: 33的氨基酸序列，并且其中所述多功能抗體結合 EGFR和MET。
[0043] 如本文所用的術語"抗原結合片段"旨在表示保留結合其抗原的能力的任何抗體 片段。此類"抗原結合片段"可以選自？￥、80?￥、？&13、？(313'）2、？313'、8〇?￥-?(3片段和雙體。抗 體的抗原結合片段將通常包含至少一個可變區。優選地，抗原結合片段包含重鏈可變區 (HCVR)和輕鏈可變區（LCVR)。更優選地，抗原結合片段包含HCVRs和LCVRs，其賦予針對MET 和EGFR的抗原結合特異性（即，"MET和EGFR結合片段"）。
[0044]如本文所用的術語"互補性決定區域"和"CDR"旨在意指抗體或其抗原結合片段的 HC和LC多肽兩者的可變區內發現的非連續抗原結合位點（combining sites)。這些特定區 域已被其他人所描述，包括Kabat,等，Ann.NYAcad.Sci.l90:382-93 (1971); Kabat等， J. Biol.Chem.252:6609_6616 (1977); Kabat,等，Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242 (1991); Chothia，等，J. Mol.Biol.196: 901-917 (1987); MacCallum，等，J. Mol.Biol·，262:732-745 (1996);和 North,等，了· Mol.Biol.，406，228-256 (2011)，其中定義包括當彼此比較時氨基酸殘基的重疊或子 集。
[0045] CDR散布在更保守的名為框架區（"FR"）的區域中。每一LCVR和HCVR由三個CDR和四 個FR構成，從氨基端向羧基端按以下順序排列:FR I、CDRI、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。將輕鏈 的3個CDR稱為 "LCDR1、LCDR2和LCDR3" 并將重鏈的3個CDR稱為 "HCDR1、HCDR2和HCDR3" <XDR 包含大部分與抗原形成特異性相互作用的殘基。LCVR和HCVR區域內CDR氨基酸殘基的編號 和位置與已知的慣例一致(例如Kabat (1991) Chothia (1987)、和/或North (2011))。在 本發明的不同實施方案中，抗體和/或抗原結合片段(例如scFv)的FR可以與人種系序列一 致，或者可以是天然或人工修飾的。
[0046] "單鏈片段可變（single chain fragment variable)"或"scFv"或"scFv多肽"指 包含經接頭分子連接的抗體的LCVR結構域和HCVR結構域的單折疊的多肽。在此類scFv多肽 中，HCVR結構域和LCVR結構域可以以HCVR -接頭-LCVR或LCVR -接頭-HCVR次序。接 頭可以是柔性肽接頭，其使得HCVR結構域和LCVR結構域能夠折疊作為功能性單體單元用于 識別抗原。s cFv的LCVR結構域的三個CDR本文稱為"s cFv-LCDR I、s cFv-LCDR2和s cFv-LCDR3" 且scFv的HCVR結構域的三個CDR本文稱為 "scFv-HCDRl、scFv-HCDR2和scFv-HCDR3"。
[0047] 如本文所用，術語"表面等離子共振(SPR)"指通過檢測生物傳感器基質內的蛋白 質濃度改變來允許分析實時相互作用的光學現象，例如使用BIAcore TM系統(Biacore Life Sciences Division, GE Healthcare, Piscataway, NJ)〇
[0048] 如本文所用，術語"KD"旨在指具體抗體-抗原或抗體片段-抗原相互作用的平衡解 離常數。
[0049] 術語"特異性結合"等等表示抗體或其抗原結合片段與抗原形成在生理條件下相 對穩定的復合物。用于確定抗體是否特異性結合抗原的方法是本領域眾所周知的，并且包 括例如平衡透析、SPR等等。例如，如本發明上下文中所用的"特異性結合" MET或EGFR的抗體 包括如SPR測定中測量的以以下Kd結合MET-ECD (或其部分)和/或EGFR-E⑶(或其部分）的 抗體:小于約10 mM、小于約5 nM、小于約4 nM、小于約3 nM、小于約2 nM、小于約I nM、小于 約0.5 nM、小于約0.3 nM、小于約0.2 nM、或小于約0.1 nM。（參見，例如實施例1，本文）。優 選的，本發明的多功能抗體如SPR測定中測量的以以下Kd特異性結合MET-ECD (或其部分） 和EGFR-ECD(或其部分）：約10 nM至約0.1 nM、約5 nM至約0.1 nM、約2 nM至約0.1 nM、約1 nM至約0.1 nM、約0.75 nM至約0.1 nM、約0.5 nM至約0.1 nM。
[0050] 術語"表位"指與抗體分子可變區內的特定抗原結合位點（已知為互補位)相互作 用的抗原決定簇。單一抗原可以具有多于一個表位。因此，不同抗體可以結合抗原上的不同 區域并且可以具有不同的生物效應。表位可以是構象的或線性的。構象表位由線性多肽鏈 不同區段的空間上并列的氨基酸來產生。線性表位是由多肽鏈中相鄰的氨基酸殘基產生的 表位。在某些情況下，表位可以包括抗原上的糖、磷酰基或磺酰基部分。
[0051] 如本發明內所用的術語"接頭分子"或"接頭"優選表示肽接頭。使用本發明某些實 施方案中利用的肽接頭以將抗體、抗原結合位點，和/或包含不同抗原結合位點的抗體片段 (例如scFv、全長抗體、Vh結構域和/或Vii吉構域)連接在一起以形成本發明的多功能抗體。優 選地，肽接頭是富含甘氨酸的肽，其具有至少5個氨基酸，優選至少10個氨基酸，更優選10-50個氨基酸。在本發明的一些實施方案中，所述富含甘氨酸的肽接頭是(G xS)n,其中G=甘氨 酸，S=絲氨酸，（x=3并且n=3、4、5或6)或(x=4并且n=2、3、4或5)。例如，在本發明的一些實施 方案中，所述富含甘氨酸的肽接頭是(G xS)n，其中G=甘氨酸，S=絲氨酸，x=4并且n=2、3、4或5 (即分別是GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 47)、GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 48)、 ggggsggggsggggsggggs(seqidno:49)Sggggsggggsggggsggggsggggs(seqidno: 50 ))。在本發明的一些實施方案中，可以將額外的甘氨酸或蘇氨酸，例如GSTG、TG、GG或 GGGT添加到(GxS)n格式化的富含甘氨酸的肽接頭的任一末端。例如，在本發明的一些實施方 案中，所述富含甘氨酸的肽接頭是GGGSGGGGSGGGGSGSTG (SEQ ID NO: 51)。
[0052] 術語"C末端"及其語法變體，包括但不限于羧基（carboxyl)末端、羧基（carboxy) 末端、C末端(C-terminal)、C末端(C-terminal end)或C00H末端在本文中用于表示氨基酸 鏈(蛋白質或多肽)的末端，其可以以游離的羧基(-C00H)終止。當蛋白質從信使RNA翻譯時， 其從N-末端至C-末端產生。用于表示肽序列的慣例是在右邊描述C末端并從N至C末端列出 序列。
[0053]術語"N末端"及其語法變體，包括但不限于氨基末端、NH2末端、N末端或胺末端在 本文中用于表示氨基酸鏈(蛋白質或多肽）的開始，以具有游離胺基(-NH2)的氨基酸終止。 用于表示肽序列的慣例是將N末端放在左邊并從N至C末端列出序列。
[0054]短語"人改造的抗體"或"人源化抗體"指本文公開的抗體化合物和這樣的抗體及 其抗原結合片段，所述抗體及其抗原結合片段具有與本文公開的抗體化合物類似的結合和 功能性質，并且其具有來源于非人抗體的實質上人或完全人環繞（surrounding) CDR的構 架區。"構架區"或"構架序列"指構架區1-4的任何一個。本發明包括的人改造抗體和抗原結 合片段包括這樣的化合物，其中構架區1-4中的任何一個或更多個是實質上人的或完全人 的，即其中存在單個實質上或完全人構架區1-4的任何可能組合。例如，這包括抗原結合化 合物，其中構架區1和構架區2、構架區1和構架區3、構架區1、2和3等是實質上人的或完全人 的。實質上人構架是與已知的人種系構架序列具有至少約80%序列同一性的那些。優選地， 實質上人構架與已知人種系構架序列具有至少約85%、約90%或約95%的序列同一性。
[0055] 完全人構架是與已知人種系構架序列相同的那些。人構架種系序列為本領域所知 并且可以從多種來源，包括IMGT ?，國際ImMunoGeneTics信息系統（參見例如，Marie-Paule Lefranc,等，Nucleic Acid Research，第37卷，數據庫期號，D1006-D1012)，或 The Immunoglobulin Facts Book 由Marie-Paule Lefranc and Gerard Lefranc, Academic Press, 2001，ISBN 012441351 獲得。例如，種系輕鏈構架可以選自：A11、A17、 △ 18^19^20^27^30、1^、1^11、1^12、1^2、1^5、1^15、1^6、1^8、012、02和08;并且種系重鏈構架區 可選自：VH2-5、VH2-26、VH2-70、VH3-20、VH3-72、VHI-46、VH3-9、VH3-66、VH3-74、VH4-31、 VHI-18、VHI-69、VI-13-7、VH3-ll、VH3-15、VH3-21、VH3-23、VH3-30、VH3-48、VH4-39、VH4-59 和VH5-5I。
[0056] 可以使用若干不同方法產生展示與本文公開的抗體化合物類似功能性質的人改 造抗體。本文公開的具體抗體化合物可以用作模板或親本抗體化合物以制備額外的抗體化 合物。在一種方法中，將親本抗體化合物CDR移植到與親本抗體化合物構架具有高度序列同 一性的人構架中。新構架的序列同一性一般會與親本抗體化合物中的相應構架的序列具有 至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%，或至少約99%的同一性。該移植可以導致與 親本抗體相比結合親合力的降低。如果這是事實，那么可以基于Queen等（1991) Proc . Natl. Acad. Sci. USA 88: 2869公開的具體標準在某些位置將構架回復突變成親本構架。 描述用于人源化小鼠抗體的方法的額外參考文獻包括美國專利號4，816，397; 5，225，539和 5,693,761;Levitt, J. Mol. Biol. 168:595-620 (1983)中描述的計算機程序ABMOD和 ENCAD;Winter及同事的方法（Jones等 Nature 321:522-525 (1986);Riechmann等 Nature, 332:323-327 (1988);and,等 Science 239:1534-1536 (1988)〇
[0057] 應用本發明的教導，本領域技術人員可以使用常規技術，例如定點誘變來取代本 發明公開的CDR和構架序列內的氨基酸并由此產生來源于本發明序列的其他可變區氨基酸 序列。可以在具體取代位點上引入高達所有19個可變的天然存在的氨基酸。然后可以使用 本文公開的方法來篩選這些額外的可變區氨基酸序列以鑒定具有所示體內功能的序列。這 樣，可以鑒定根據本發明適合于制備人改造抗體及其抗原結合部分的其他序列。優選地，構 架內的氨基酸取代限制在本文公開的三個輕鏈和/或重鏈構架區任何一個或更多個內的一 個、兩個或三個位置中。優選地，CDR內的氨基酸取代限制在三個輕鏈和/或重鏈CDR任何一 個或更多個內的一個、兩個或三個位置中。本文中也涵蓋上述這些構架區和CDR內的多種改 變的組合。
[0058] 下文表1和2描述了本文公開的優選人改造抗體的CDR的氨基酸序列和共有氨基酸 序列，以及本文公開的優選人改造抗體或其抗原結合片段的HCVR和LCVR多肽的氨基酸序列 的SEQ ID N0。
[0059] 表 1
在上文表2中，乂:是!?或Y，X2是K或S，并且X3是E或R。
[0061]本發明的實施方案是多功能抗體，其包含： (a) 抗體，其結合MET的α鏈內選自以下的氨基酸序列上的表位： i) YVDTYYOLKii CSEQ ID Ν?； 39), Η) iSCXlSVN'RCIirORHVFPI'INIiTADIQS (SEQ10 KO: 40), Hi) Λ !,GA KVLSSVKORr IKF (SEQ S D NO: 41), tv) VRRlXBTKfXiFM (SE〇 iD NO: 42); |1! (b) scFv多肽，其結合EGFR并包含： i) HCVR結構域，所述HCVR結構域包含分別由氨基酸序列GFSLTNYGVH (SEQ ID NO: I)、vixiSggntdyntpfx2g (seq id no: 9)(其中Xi為Y或w且X2Skstmparaldyydydfay (SEQ ID NO: 3)組成的scFv CDR scFv-HCDR1、scFv-HCDR2和scFv-HCDR3;和 ii) LCVR結構域，所述LCVR結構域包含分別由氨基酸序列RASYSIGTNIH (SEQ ID NO: 4)、XiYAX2X3SIS (SEQ ID NO: 10)(其中Xi為R或Y，X2為K或S，且X3為E或R)和QQNNAWPTT (SEQ ID NO: 6)組成的scFv CDR scFv-LCDRl、scFv-LCDR2和scFv-LCDR3,其中多功能抗體 誘導細胞表面MET和EGFR的內化和/或降解。
[0062]在本發明的多個實施方案中，多功能抗體結合MET的α鏈內氨基酸序列i) VVDTYYDDQL (SEQ ID NO: 39)、ii) ISCGSVNRGTCQRHVFPHNHTADIQS (SEQ ID NO: 40)、 iii) ALGAKVLSSVKDRFINF (SEQ ID NO: 41)和/或iv) VRRLKETKDGFM (SEQ ID NO: 42)上 的表位。在本發明的多個實施方案中，多功能抗體可以結合MET的α鏈內選自以下的氨基酸 序列上的表位： \i DTYVDD (StQ m NO; 43), ?Π .HVFPHNifFADiQS UTNO： 44), 遍她 F :_EC|:r:D:翁 ?ν) Κ?ΤΠα..Κ:?『..Μ Π) NO: 46)。
[0063] 在本發明的多個實施方案中，多功能抗體可以結合特征在于包括氨基酸序列 DTYYDD (SEQ ID NO: 43)、HVFPHNHTADIQS (SEQ ID NO: 44)、FINF (SEQ ID NO: 45)和 KETKDGFM (SEQ ID NO: 46)的構象表位。此外，在本發明的多個實施方案中，多功能抗體分 別誘導不依賴HGF和不依賴EGF的細胞表面MET和EGFR的內化和/或降解。在本發明的其他實 施方案中，結合EGFR的scFv多肽包含： i) HCVR結構域，所述HCVR結構域包含分別由氨基酸序列GFSLTNYGVH (SEQ ID NO: 1)、VIYSGGNTDYNTPFKG (SEQ ID NO: 2)和ARALDYYDYDFAY (SEQ ID NO: 3)組成的scFv CDR scFv-HCDRl、scFv-HCDR2和scFv-HCDR3，和ii) LCVR結構域，所述LCVR結構域包含分別 由氨基酸序列RASYSIGTNIH (SEQ ID NO: 4)、RYAKESIS (SEQ ID NO: 5)和 QQNNAWPTT (SEQ ID NO: 6)組成的scFv CDR scFv-LCDRl、scFv-LCDR2和scFv-LCDR3。在本發明的其他 實施方案中，結合EGFR的scFv多肽包含:i )HCVR結構域，所述HCVR結構域包含分別由氨基酸 序列GFSLTNYGVH (SEQ ID NO: 1)、VIYSGGNTDYNTPFKG (SEQ ID NO: 2)和ARALDYYDYDFAY (SEQ ID NO: 3)組成的scFv CDR scFv-HCDRl、scFv-HCDR2和scFv-HCDR3;和ii) LCVR結構 域，所述LCVR結構域包含分別由氨基酸序列RASYSIGTNIH (SEQ ID NO: 4)、RYAKESIS (SEQ ID NO: 5)和 QQNNAWPTT (SEQ ID NO: 6)組成的scFv CDR scFv-LCDRl、scFv-LCDR2和 scFv-IXDR3，并且其中scFv多肽的C末端經肽接頭融合至MET抗體重鏈的N末端。
[0064] 本發明的實施方案是多功能抗體，其包含： (a)抗體，所述抗體結合MET并包含： i) 重鏈，所述重鏈包含分別由GYTFTDYYMH (SEQ ID NO: 11)、RVNPNRRGTTYNQKFEG (SEQ ID NO: 12)和ARANWLDY (SEQ ID NO: 13)的氨基酸序列組成的重鏈CDR HCDRl、 HCDR2 和 HCDR3;和 ii) 輕鏈，所述輕鏈包含分別由SVSSSVSSIYLH (SEQ ID NO: 14)、YSTSNLAS (SEQ ID NO: 15)和QVYSGYPLT (SEQ ID NO: 16)的氨基酸序列組成的輕鏈CDR LCDR1、LCDR2和 LCDR3;和 (b) scFv多肽，所述scFv多肽結合EGFR并包含： i) HCVR結構域，所述HCVR結構域包含分別由氨基酸序列GFSLTNYGVH (SEQ ID NO: i)、vixiSggntdyntpfx2g (seq id no: 9)(其中Xi為Y或w且X2Skstmparaldyydydfay (SEQ ID NO: 3)組成的scFv CDR scFv-HCDR1、scFv-HCDR2和SCFV-HCDR3;和 ii) LCVR結構域，所述LCVR結構域包含分別由氨基酸序列RASYSIGTNIH (SEQ ID NO: 4)、XiYAX2X3SIS (SEQ ID NO: 10)(其中Xi為R或Y，X2為K或S，且X3為E或R)和QQNNAWPTT (SEQ ID NO: 6)組成的scFv CDR scFv-LCDRl、scFv-LCDR2和scFv-LCDR3。
[0065] 在本發明的其他實施方案中，結合EGFR的scFv多肽包含： i) HCVR結構域，所述HCVR結構域包含分別由氨基酸序列GFSLTNYGVH (SEQ ID NO: 1)、VIYSGGNTDYNTPFKG (SEQ ID NO: 2)和ARALDYYDYDFAY (SEQ ID NO: 3)組成的scFv CDR scFv-HCDRl、scFv-HCDR2和scFv-HCDR3;和 ii) LCVR結構域，所述LCVR結構域包含分別由氨基酸序列RASYSIGTNIH (SEQ ID NO: 4)、RYAKESIS (SEQ ID NO: 5)和QQNNAWPTT (SEQ ID NO: 6)組成的scFv CDR scFv-LCDRl、scFv-LCDR2和scFv-LCDR3。
[0066] 在本發明的其他實施方案中，結合EGFR的scFv多肽包含HCVR結構域(其包含SEQ ID NO: 17的氨基酸序列）和LCVR結構域(其包含SEQ ID NO: 18的氨基酸序列）。在本發明 的其他實施方案中，結合EGFR的scFv多肽包含： i) HCVR結構域，所述HCVR結構域包含分別由氨基酸序列GFSLTNYGVH (SEQ ID NO: 1)、VIYSGGNTDYNTPFKG (SEQ ID NO: 2)和ARALDYYDYDFAY (SEQ ID NO: 3)組成的scFv CDR scFv-HCDRl、scFv-HCDR2和scFv-HCDR3;和 ii) LCVR結構域，所述LCVR結構域包含分別由氨基酸序列RASYSIGTNIH (SEQ ID NO: 4)、RYAKESIS (SEQ ID NO: 5)和 QQNNAWPTT (SEQ ID NO: 6)組成的scFv CDR scFv-LCDRl、scFv-LCDR2和scFv-LCDR3，并且其中scFv多肽的C末端經肽接頭融合至MET抗體重鏈 的N末端。
[0067] 在本發明的其他實施方案中，多功能抗體包含： i) 包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列的重鏈;和 ii) 包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的輕鏈。
[0068] 本發明的實施方案是多功能抗體，其包含： (a) 抗體，所述抗體結合MET并包含： i) 重鏈，所述重鏈包含分別由GYTFTDYYMH (SEQ ID NO: 11)、RVNPNRRGTTYNQKFEG (SEQ ID NO: 12)和ARANWLDY (SEQ ID NO: 13)的氨基酸序列組成的重鏈CDR HCDRl、 HCDR2 和 HCDR3;和 ii) 輕鏈，所述輕鏈包含分別由SVSSSVSSIYLH (SEQ ID NO: 14)、YSTSNLAS (SEQ ID NO: 15)和QVYSGYPLT (SEQ ID NO: 16)的氨基酸序列組成的輕鏈CDR LCDR1、LCDR2和 LCDR3;和 (b) scFv多肽，其結合EGFR并包含： i) HCVR結構域，所述HCVR結構域包含分別由氨基酸序列GFSLTNYGVH (SEQ ID NO: I)、vixiSggntdyntpfx2g (seq id no: 9)(其中Xi為Y或w且X2Skstmparaldyydydfay (SEQ ID NO: 3)組成的scFv CDR scFv-HCDR1、scFv-HCDR2和scFv-HCDR3;和 ii) LCVR結構域，所述LCVR結構域包含分別由氨基酸序列RASYSIGTNIH (SEQ ID NO: 4)、XiYAX2X3SIS (SEQ ID NO: 10)(其中Xi為R或Y，X2為K或S，且X3為E或R)和QQNNAWPTT (SEQ ID NO: 6)組成的scFv CDR scFv-LCDRl、scFv-LCDR2和scFv-LCDR3。
[0069] 在本發明的其他實施方案中，結合EGFR的scFv多肽包含： i) HCVR結構域，所述HCVR結構域包含分別由氨基酸序列GFSLTNYGVH (SEQ ID NO: 1)、VIWSGGNTDYNTPFTG (SEQ ID NO: 7)和ARALDYYDYDFAY (SEQ ID NO: 3)組成的scFv CDR scFv-HCDRl、scFv-HCDR2和scFv-HCDR3;和 ii) LCVR結構域，所述LCVR結構域包含分別由氨基酸序列RASYSIGTNIH (SEQ ID NO: 4)、YYASRSIS (SEQ ID NO: 8)和QQNNAWPTT (SEQ ID NO: 6)組成的8。卩￥〇01?8。卩￥-LCDRl、scFv-LCDR2、scFv-LCDR3 〇
[0070] 在本發明的其他實施方案中，結合EGFR的scFv多肽包含： i) HCVR結構域，所述HCVR結構域包含分別由氨基酸序列GFSLTNYGVH (SEQ ID NO: 1)、VIWSGGNTDYNTPFTG (SEQ ID NO: 7)和ARALDYYDYDFAY (SEQ ID NO: 3)組成的scFv CDR scFv-HCDRl、scFv-HCDR2和scFv-HCDR3;和 ii) LCVR結構域，所述LCVR結構域包含分別由氨基酸序列RASYSIGTNIH (SEQ ID NO: 4)、YYASRSIS (SEQ ID NO: 8)和 QQNNAWPTT (SEQ ID NO: 6)組成的8。卩丫0)1?8。卩￥-LCDRl、scFv-LCDR2、scFv-LCDR3，并且其中scFv多肽的C末端經肽接頭融合至MET抗體重鏈 的N末端。
[0071] 在本發明的其他實施方案中，多功能抗體包含： i) 包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列的重鏈;和 ii) 包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的輕鏈。
[0072] 本發明的另一實施方案是多功能抗體，其包含： (a) 抗體，所述抗體結合MET并包含： i) 第一重鏈和第二重鏈，其中每一重鏈包含分別由GYTFTDYYMH (SEQ ID NO: 11)、 RVNPNRRGTTYNQKFEG (SEQ ID NO: 12)和ARANWLDY (SEQ ID NO: 13)的氨基酸序列組成的 重鏈CDR HCDRUHCDR2和HCDR3;和 ii) 第一輕鏈和第二輕鏈，其中每一輕鏈包含分別由SVSSSVSSIYLH (SEQ ID NO: 14)、YSTSNLAS (SEQ ID NO: 15)和QVYSGYPLT (SEQ ID NO: 16)的氨基酸序列組成的輕鏈 CDR LCDRl、LCDR2和LCDR3;和 (b) 第一scFv多肽和第二scFv多肽，其中每一scFv多肽結合人EGFR并且其中每一scFv 多肽包含： i) HCVR結構域，所述HCVR結構域包含分別由氨基酸序列GFSLTNYGVH (SEQ ID NO: i)、vixiSggntdyntpfx2g (SEQ id no: 9)(其中Xi為Y或w且X2Skstmparaldyydydfay (SEQ ID NO: 3)組成的scFv CDR scFv-HCDR1、scFv-HCDR2和SCFV-HCDR3;和 ii) LCVR結構域，所述LCVR結構域包含由氨基酸序列RASYSIGTNIH (SEQ ID NO: 4)， X1YAX2X3SIS (SEQ ID NO: 10)(其中Xi為R或Y，X2為K或S，且X3為E或R)和QQNNAWPTT (SEQ ID NO: 6)組成的scFv CDR scFv-LCDRl、scFv-LCDR2和scFv-LCDR3,并且其中第一scFv多 肽的C末端經肽接頭融合至第一重鏈的N末端并且第二SCFv多肽的C末端經肽接頭融合至第 二重鏈的N末端。
[0073] 在本發明的多個實施方案中，多功能抗體結合MET的α鏈內選自以下的氨基酸序列 上的表位： ?) V VOITVDDQ], (S^Q ?Ο NO： 39? si) iSCOSV'NROTCQRi'iVFFHN'H'I'ADlQS (SEQ ID NO： 40), ?〇 AtGAKVLSsSVKBRFINf (SEQ ID M)： 41), ：|SI ?ν) VRRLICBTICrXiFy (SEQ ID NO: 42) 0
[0074] 在本發明的多個實施方案中，多功能抗體可以結合MET的α鏈內氨基酸序列i) VVDTYYDDQL (SEQ ID NO: 39)、ii) ISCGSVNRGTCQRHVFPHNHTADIQS (SEQ ID NO: 40)、 iii) ALGAKVLSSVKDRFINF (SEQ ID NO: 41)和/或iv) VRRLKETKDGFM (SEQ ID NO: 42)上 的表位。在本發明的多個實施方案中，多功能抗體可以結合特征在于包括氨基酸序列 DTYYDD (SEQ ID NO: 43)、HVFPHNHTADIQS (SEQ ID NO: 44)、FINF (SEQ ID NO: 45)和 KETKDGFM (SEQ ID NO: 46)的構象表位。在本發明的其他實施方案中，多功能抗體包含： i) 第一重鏈和第二重鏈，其中兩條重鏈均包含SEQ ID NO: 53的氨基酸序列;和 ii) 第一輕鏈和第二輕鏈，其中兩條輕鏈均包含SEQ ID NO: 33的氨基酸序列。
[0075]此外，在本發明的多個實施方案中，多功能抗體分別誘導不依賴HGF和不依賴EGF 的細胞表面MET和EGFR的內化和/或降解。
[0076]本發明的另一實施方案是多功能抗體，其包含： (a) 抗體，所述抗體結合MET并包含： i) 第一重鏈和第二重鏈，其中每一重鏈包含分別由GYTFTDYYMH (SEQ ID NO: 11)、 RVNPNRRGTTYNQKFEG (SEQ ID NO: 12)和ARANWLDY (SEQ ID NO: 13)的氨基酸序列組成的 重鏈CDR HCDRUHCDR2和HCDR3;和 ii) 第一輕鏈和第二輕鏈，其中每一輕鏈包含分別由SVSSSVSSIYLH (SEQ ID NO: 14)、YSTSNLAS (SEQ ID NO: 15)和QVYSGYPLT (SEQ ID NO: 16)的氨基酸序列組成的輕鏈 CDR LCDRl、LCDR2和LCDR3;和 (b) 第一scFv多肽和第二scFv多肽，其中每一scFv多肽結合人EGFR并且其中每一scFv 多肽包含： i) HCVR結構域，所述HCVR結構域包含分別由氨基酸序列GFSLTNYGVH (SEQ ID NO: i)、vixiSggntdyntpfx2g (seq id no: 9)(其中Xi為Y或w且X2Skstmparaldyydydfay (SEQ ID NO: 3)組成的scFv CDR scFv-HCDR1、scFv-HCDR2和SCFV-HCDR3;和 ii) LCVR結構域，所述LCVR結構域包含分別由氨基酸序列RASYSIGTNIH (SEQ ID NO: 4)，X1YAX2X3SIS (SEQ ID NO: 10)(其中Xi為R或Y，X2為K或S，且X3為E或R)和QQNNAWPTT (SEQ ID NO: 6)組成的scFv CDR scFv-LCDRl、scFv-LCDR2和scFv-LCDR3,并且其中第一 scFv多肽的C末端經肽接頭融合至第一重鏈的N末端并且第二scFv多肽的C末端經肽接頭融 合至第二重鏈的N末端。
[0077]在本發明的其他實施方案中，結合EGFR的每一第一和第二scFv多肽包含：i) HCVR 結構域，所述HCVR結構域包含分別由氨基酸序列GFSLTNYGVH ( SEQ ID NO: 1)、 VIYSGGNTDYNTPFKG (SEQ ID NO: 2)和ARALDYYDYDFAY (SEQ ID NO: 3)組成的scFv CDR scFv-HCDRl、scFv-HCDR2和scFv-HCDR3;和i i )LCVR結構域，所述LCVR結構域包含分別由氨 基酸序列RASYSIGTNIH (SEQ ID NO: 4)、RYAKESIS (SEQ ID NO: 5)和 QQNNAWPTT (SEQ ID NO: 6)組成的scFv CDR scFv-LCDRl、scFv-LCDR2和scFv-LCDR3。或者，結合EGFR的每一 第一和第二scFv多肽包含：i)HCVR結構域，所述HCVR結構域包含分別由氨基酸序列 GFSLTNYGVH (SEQ ID NO: 1)、VIWSGGNTDYNTPFTG(SEQ ID NO: 7)和ARALDYYDYDFAY (SEQ ID NO: 3)組成的scFv CDR scFv-HCDRl、scFv-HCDR2和scFv-HCDR3;和ii)LCVR結構域，所 述LCVR結構域包含分別由氨基酸序列RASYSIGTNIH (SEQ ID NO: 4)、YYASRSIS (SEQ ID NO: 8)和 QQNNAWPTT (SEQ ID NO: 6)組成的scFv CDR scFv-LCDRl、scFv-LCDR2和scFv-LCDR3〇
[0078]本發明的另一實施方案是多功能抗體，其包含： (a) 抗體，所述抗體結合MET并包含： i) 第一重鏈和第二重鏈，其中兩條重鏈均包含SEQ ID NO: 53的氨基酸序列;和 ii) 第一輕鏈和第二輕鏈，其中兩條輕鏈均包含SEQ ID NO: 33的氨基酸序列;和 (b) 第一scFv多肽和第二scFv多肽，其中兩條scFv多肽均結合EGFR并且兩條scFv多肽 均包含： i) HCVR結構域，所述HCVR結構域包含分別由氨基酸序列GFSLTNYGVH (SEQ ID NO: i)、vixiSggntdyntpfx2g (seq id no: 9)(其中Xi為Y或w且X2Skstmparaldyydydfay (SEQ ID NO: 3)組成的scFv CDR scFv-HCDR1、scFv-HCDR2和SCFV-HCDR3;和 ii) LCVR結構域，所述LCVR結構域包含分別由氨基酸序列RASYSIGTNIH (SEQ ID NO: 4)，X1YAX2X3SIS (SEQ ID NO: 10)(其中Xi為R或Y，X2為K或S，且X3為E或R)和QQNNAWPTT (SEQ ID NO: 6)組成的scFv CDR scFv-LCDRl、scFv-LCDR2和scFv-LCDR3,并且其中第一 scFv多肽的C末端經肽接頭融合至第一重鏈的N末端并且第二scFv多肽的C末端經肽接頭融 合至第二重鏈的N末端。
[0079]在本發明的其他實施方案中，第一和第二scFv多肽包含：i) HCVR結構域，所述 HCVR結構域包含分別由氨基酸序列GFSLTNYGVH (SEQ ID NO: 1)、VRSGGNTDYNTPFKG (SEQ ID NO: 2)和ARALDYYDYDFAY (SEQ ID NO: 3)組成的scFv CDR scFv-HCDRl、scFv-HCDR2和 scFv-HCDR3 ;和i i ) LCVR結構域，所述LCVR結構域包含分別由氨基酸序列RASYSIGTNIH (SEQ ID NO: 4)、RYAKESIS (SEQ ID NO: 5)和 QQNNAWPTT (SEQ ID NO: 6)組成的scFv CDR scFv-LCDRl、scFv-LCDR2和scFv-LCDR3。或者，兩個scFv多肽包含：i)HCVR結構域，所述 HCVR結構域包含分別由氨基酸序列GFSLTNYGVH (SEQ ID NO: 1)、VIWSGGNTDYNTPFTG(SEQ ID NO: 7)和ARALDYYDYDFAY (SEQ ID NO: 3)組成的scFv CDR scFv-HCDRl、scFv-HCDR2和 scFv-HCDR3;和ii)LCVR結構域，所述LCVR結構域包含分別由氨基酸序列RASYSIGTNIH (SEQ ID NO: 4)、YYASRSIS (SEQ ID NO: 8)和 QQNNAWPTT (SEQ ID NO: 6)組成的scFv CDR scFv-LCDRl、scFv-LCDR2和scFv-LCDR3。
[0080]在一個實施方案中，本發明提供多功能四價抗體，其包含： (a)抗體，其包含兩條重鏈和兩條輕鏈并能夠結合MET的α鏈內選自以下的氨基酸序列 上的表位： j) VVDITYDDQl. (SbQ iO NO' 3? ii) iSCGSVN RG'rCQRiiVFPHNIfi AOIQS (SBQ JD NO： 40), i?) ALOAKVLSSViCDRFiNF (SEQIO NO; 41). rv) VRRLXBTKOCirM ?SEQ JD NO:42j; .{u (b)兩個scFv多肽，其能夠結合EGFR，其包含SEQ ID NO: 17或SEQ ID NO: 19的重鏈 可變區和SEQ ID NO: 18或SEQ ID NO: 20的輕鏈可變區，其中所述多功能抗體誘導細胞表 面MET和EGFR的內化和/或降解。在本發明的多個實施方案中，多功能抗體可以結合MET的α 鏈內氨基酸序列i) VVDTYYDDQL (SEQ ID NO: 39)、ii) ISCGSVNRGTCQRHVFPHNHTADIQS (SEQ ID NO: 40)、iii) ALGAKVLSSVKDRFINF (SEQ ID NO: 41)和/或iv) VRRLKETKDGFM (SEQ ID NO: 42)上的表位。在本發明的多個實施方案中，多功能抗體可以結合特征在于包 括氨基酸序列DTYYDD (SEQ ID NO: 43)、HVFPHNHTADIQS (SEQ ID NO: 44)、FINF (SEQ ID NO: 45)和KETKDGFM (SEQ ID NO: 46)的構象表位。此外，在本發明的多個實施方案中，多 功能抗體分別誘導不依賴HGF和不依賴EGF的細胞表面MET和EGFR的內化和/或降解。
[0081] 在本發明的一個實施方案中，提供多功能四價抗體，其包含：（a)各自能夠結合 EGFR的兩個相同的scFv多肽;和(b)抗體或其抗原結合片段，其特異地結合由如SEQ ID NO: 36中的氨基酸序列組成的MET-ECD，抗體或其抗原結合片段，其包含： 分別由氨基酸序列SVSSSVSSIYLH (SEQ ID NO: 14)、YSTSNLAS (SEQ ID NO: 15)和 QVYSGYPLT (SEQ ID NO: 16)組成的輕鏈CDR LCDRULCDR2和LCDR3,和 分別由氨基酸序列GYTFTDYYMH (SEQ ID NO: 11)、RVNPNRRGTTYNQKFEG (SEQ ID NO: 12)和ARANWLDY (SEQ ID NO: 13)組成的重鏈CDR HCDR1、HCDR2和HCDR3。
[0082] 在本發明的一個實施方案中，提供多功能四價抗體，其包含：（a)各自能夠結合 EGFR的兩個相同的scFv多肽;和(b)MET抗體，其包含兩條重鏈和兩條輕鏈并能夠結合MET， 其中能夠結合EGFR的兩個相同的scFv多肽通過肽接頭在所述全長抗體的各重鏈的C末端經 過C末端融合MET抗體。在本發明的一些實施方案中，SEQ ID NO: 21的重鏈可變區和SEQ ID NO: 22的輕鏈可變區（其均來源于在WO 2010/059654中詳細描述的抗MET克隆C8-H241)可 以用于形成特異地結合MET的MET抗體的抗原結合位點。
[0083] 通過基因合成和重組分子生物學技術，SEQ ID NO: 17的HCVR和SEQ ID NO: 18的 LCVR，或SEQ ID NO: 19的HCVR和SEQ ID NO: 20的LCVR通過公式(GxS)n，x =4，n=5的富含甘 氨酸的接頭連接以形成特異地結合EGFR的scFv。結合EGFR的scFv然后通過另一富含甘氨 酸的接頭附著到抗MET抗體C8-H241 (人IgG4亞型）的重鏈的N或C末端，產生多功能抗體 NH-YK(包含抗EGFR YKn-scFv和抗Met HC融合物（即，SEQ ID NO: 27))、NH-H9 (包含抗 EGFR H9n-scFv和抗Met HC 融合物（即，SEQ ID NO: 29))、YK (包含抗Met HC和抗EGFR YK-scFv融合物（即，SEQ ID NO: 31))和H9 (包含抗Met HC和抗EGFR H9-scFv融合物（即， SEQ ID NO: 52))〇
[0084]本發明的另一實施方案是結合MET和EGFR的多功能抗體，其包含：（a)兩條第一多 肽，其中所述兩條第一多肽均包含SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 52或 SEQ ID NO: 53的氨基酸序列；和（b)兩條第二 多肽，其中所述兩條第二多肽包含SEQ ID NO: 33的氨基酸序列。
[0085] 本發明的另一實施方案是包含結合MET和EGFR的多功能抗體和藥學上可接受的載 體、稀釋劑或賦形劑的藥物組合物，所述多功能抗體包含：（a)兩條第一多肽，其中所述兩條 第一多肽均包含SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 52或SEQ ID NO: 53的氨基酸序列；和(b)兩條第二多肽，其中所述兩 條第二多肽包含SEQ ID NO: 33的氨基酸序列。
[0086] 本發明的另一實施方案是治療癌癥的方法，所述方法包括向有需要的患者施用有 效量的結合MET和EGFR的多功能抗體，其包含：（a)兩條第一多肽，其中所述兩條第一多肽均 包含SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 52或SEQ ID NO: 53的氨基酸序列；和(b)兩條第二多肽，其中所述兩條第二多肽 包含SEQ ID NO: 33的氨基酸序列。在本發明的一些實施方案中，癌癥是NSCLC、SCLC、胃癌、 結腸直腸癌、膽管癌、食道癌、黑素瘤、葡萄膜黑素瘤、腎癌、肝癌、膀胱癌、子宮頸癌、或頭頸 癌。在本發明的一些實施方案中，所述癌癥患者是人。在本發明的其他實施方案中，患者腫 瘤的特征在于包含具有一個或多個KRAS突變的細胞。本發明的其他實施方案提供治療癌癥 (其中MET和/或EGFR由患者腫瘤以低、中等、或高水平表達)和/或腫瘤或對于一種或多種抗 EGFR抗體(例如西妥昔單抗、帕尼單抗等)和/或EGFR的一種或多種小分子抑制劑(例如埃羅 替尼)具有抗性或已變得有抗性的腫瘤(包括但不限于攜帶KRAS突變的腫瘤）的方法，所述 方法包括向需要其的患者施用藥學上有效量的一種前述的多功能抗體、或其MET和EGFR結 合片段。在本發明的多個實施方案中，治療癌癥的方法可以進一步包括在向患者施用多功 能抗體或其MET和EGFR結合片段的步驟前，通過測量患者腫瘤表達的MET和EGFR的水平和/ 或評估患者的腫瘤是否包含具有一個或多個KRAS突變的細胞來鑒定需要癌癥治療的患者 的步驟，在所述癌癥中MET和/或EGFR由患者腫瘤以低、中等、或高水平表達和/或其中腫瘤 對于一種或多種抗EGFR抗體(例如西妥昔單抗、帕尼單抗等）和/或EGFR的一種或多種小分 子抑制劑(例如埃羅替尼)具有抗性或已變得有抗性，包括但不限于攜帶KRAS突變的腫瘤。
[0087] 下文表3描述了本發明的scFv和scFv融合物的氨基酸序列的SEQ ID N0。
當在本文中用于參考scFv并包括上文表3時，下標"η"表示抗EGFR YK scFv或抗EGFR H9 scFv融合MET抗體重鏈的N末端。
[0089] 本發明的其他實施方案是包含兩條相同的第一多肽和兩條相同的第二多肽的多 功能抗體，其中第一多肽的氨基酸序列是SEQ ID NO: 27或SEQ ID NO: 29并且第二多肽的 氨基酸序列是SEQ ID NO: 33,其中所述多功能抗體結合EGFR和MET。此外，在本發明的多個 實施方案中，多功能抗體分別誘導不依賴HGF和不依賴EGF的細胞表面MET和EGFR的內化和/ 或降解。
[0090] 標準的分子生物學技術用于制備重組表達載體、轉染宿主細胞、選擇轉化體、產生 本發明多功能抗體的分離的宿主細胞系、培養這些宿主細胞并從培養基中回收抗體。
[0091] 本發明也涉及表達本發明的多功能抗體的宿主細胞。本領域已知的多種宿主表達 系統可以用于表達本發明的抗體，其包括原核(細菌)和真核表達系統（如酵母、桿狀病毒、 植物、哺乳動物和其他動物細胞、轉基因動物，和雜交瘤細胞）。
[0092]可以通過在宿主細胞中重組表達免疫球蛋白制備本發明的多功能抗體。為了在宿 主細胞中重組表達抗體，利用攜帶編碼多功能抗體的輕鏈和/或scFv-重鏈融合物的DNA片 段的一個或多個重組表達載體轉化、轉導、感染等宿主細胞。可以從在一個載體中它們可操 作地連接的不同啟動子獨立表達重鏈和輕鏈，或，或者，可以從在兩個載體(一個表達重鏈， 一個表達輕鏈）中它們可操作地連接的不同啟動子獨立表達重鏈和輕鏈。任選地，可以在不 同的宿主細胞中表達重鏈和輕鏈。優選地，重組抗體可以分泌到培養基中，在所述培養基中 培養宿主細胞，從所述培養基中回收或純化抗體。
[0093]可以通過將編碼HCVR的DNA可操作地連接編碼重鏈恒定區的另一 DNA分子來將編 碼HCVR區的分離的DNA轉化成全長重鏈基因。人以及其他哺乳動物重鏈恒定區基因的序列 為本領域所知。可以例如通過標準的PCR擴增獲得包括這些區域的DNA片段。重鏈恒定區可 以是任何類型（例如，IgG、IgA、IgE、IgM或IgD)、種類(例如，IgGi、IgG2、IgG3和IgG4)或亞類 恒定區和Kabat (上文）中描述的其任何同種異型變體。
[0094]可以通過將編碼LCVR的DNA可操作地連接編碼輕鏈恒定區的另一 DNA分子來將編 碼LCVR區的分離的DNA轉化成全長輕鏈基因（以及Fab輕鏈基因）。人以及其他哺乳動物輕鏈 恒定區基因的序列為本領域所知。可以通過標準的PCR擴增獲得包括這些區域的DNA片段。 輕鏈恒定區可以是κ或λ恒定區。
[0095] 除了抗體重鏈和/或輕鏈基因，本發明的重組表達載體攜帶在宿主細胞中控制抗 體鏈基因表達的調節序列。術語"調節序列"旨在包括啟動子、增強子和其他表達控制元件 (例如，多腺苷酸化信號），需要時其控制抗體鏈基因的轉錄或翻譯。表達載體的設計，包括 調節序列的選擇可以取決于這樣的因素，如待轉化的宿主細胞的選擇、所希望的蛋白的表 達水平。用于哺乳動物宿主細胞表達的優選的調節序列包括指導在哺乳動物細胞中高水平 的蛋白表達的病毒元件，諸如來源于巨細胞病毒(CMV)的啟動子和/或增強子、猿猴病毒40 (SV40)、腺病毒(例如腺病毒主要晚期啟動子(AdMLP))和/或多瘤病毒。
[0096] 此外，本發明的重組表達載體可以攜帶額外序列，諸如在宿主細胞中調節載體復 制的序列（例如，復制起點）和一個或多個可選標志物基因。所述可選標志物基因利于其中 已經引入載體的宿主細胞的選擇。例如，通常可選標記物基因賦予其中已引入載體的宿主 細胞對藥物諸如G418、潮霉素或甲氨蝶呤的抗性。優選的可選標志物基因包括二氫葉酸還 原酶(dhfr)基因（用于具有甲氨蝶呤選擇/擴增的dhfr-宿主細胞中）、neo基因（用于G418選 擇），和在GS陰性細胞系(如NS0)中用于選擇/擴增的谷氨酰胺合成酶(GS)。
[0097]為了表達輕鏈和/或重鏈，通過標準技術，例如電穿孔、磷酸鈣沉淀、DEAE-葡聚糖 轉染、轉導、感染等將編碼重鏈和/或輕鏈的表達載體引入到宿主細胞中。盡管理論上可以 在原核或真核宿主細胞中表達本發明的抗體，但是優選真核細胞，并最優選哺乳動物宿主 細胞，因為該細胞更可能裝配和分泌正確折疊和免疫活性的抗體。用于表達本發明的重組 抗體的優選哺乳動物宿主細胞包括中國倉鼠卵巢(CH0細胞）[包括dhfr- CHO細胞，描述于 Urlaub和Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-20，1980中，與DHFR可選標記 物使用，例如如描述于Kaufman和Sharp，J. Mol. Biol. 159:601-21，1982中]，NSO骨髓 瘤細胞、COS細胞和SP2/0細胞。當將編碼抗體基因的重組表達載體引入哺乳動物宿主細胞 中時，通過培養宿主細胞足以允許在宿主細胞中表達抗體，或更優選地，將抗體分泌到其中 在本領域已知的適當條件下生長宿主的培養基中一段時間來產生抗體。可以使用標準的純 化方法從宿主細胞和/或培養基中回收抗體。
[0098] 也可以通過常規技術使用宿主細胞來產生完整抗體的部分或片段，例如Fab片段 或scFv分子。例如，希望利用編碼本發明的輕鏈或重鏈的DNA轉染宿主細胞。重組DNA技術也 可以用于去除對結合EGFR和MET非必需的編碼輕鏈和重鏈任一者或兩者的一些或所有DNA。 從該截短的DNA分子表達的分子也包括在本發明的抗體中。
[0099] 本發明提供包含本發明的核酸分子的宿主細胞。優選地，本發明的宿主細胞包含 一個或多個這樣的載體或構建體，其包含本發明的核酸分子。例如，本發明的宿主細胞是其 中已經引入本發明的載體的細胞，所述載體包含編碼本發明的抗體的LCVR的多核苷酸和/ 或編碼本發明的HCVR的多核苷酸。本發明還提供其中已經引入本發明的兩個載體的宿主細 胞;一個包含編碼本發明的抗體的LCVR的多核苷酸，一個包含編碼本發明的抗體中存在的 HCVR的多核苷酸，并且各自可操作地連接增強子/啟動子調節元件(例如，來源于SV40、CMV、 腺病毒等，如CMV增強子/AdMLP啟動子調節元件或SV40增強子/AdMLP啟動子調節元件）以驅 動基因的高水平轉錄。
[0100] 一旦表達，可以根據本領域的標準方法，包括硫酸銨沉淀、離子交換、親合力(例如 蛋白A)、反相、疏水性相互作用柱層析、羥磷灰石層析、凝膠電泳等純化本發明的完整抗體、 單條輕鏈和重鏈，或其他免疫球蛋白形式。對于藥物用途，優選至少約90%、約92%、約94%或 約96%同質性的實質上純的免疫球蛋白，并且最優選約98%-約99%或更高同質性。一旦純化 (部分地或至期望的同質性的），則無菌抗體可以隨后治療性使用，如本文所指示。
[0101]如本文所用的術語"分離的多核苷酸"應表示基因組、cDNA、或合成來源或其一些 組合的多核苷酸，其由于其起源，所述分離的多核苷酸（1)不伴隨其中在自然界中發現所述 分離的多核苷酸的多核苷酸的全部或一部分，（2)與其在自然界中不相連的多核苷酸連接， 或(3)不作為更大序列的一部分存在于自然界中。
[0102] "分離的"多功能抗體是已經從它的天然環境的組分中鑒定和分離和/或回收的抗 體。其天然環境的污染組分是會干擾抗體的診斷或治療用途的物質，并且可以包括酶、激素 和其他蛋白質性質的或非蛋白質性質的溶質。在優選的實施方案中，抗體將被純化至（1)如 通過Lowry法所測定，大于95重量%抗體，并最優選大約99重量％，（ 2)通過使用旋轉杯測序儀 足以獲得N末端或中間氨基酸序列的至少15個殘基的程度，或（3)在還原或非還原條件下 使用考馬斯亮藍、SimplyBlue ? SafeStain (Life Technologies)或，優選銀染通過SDS-PAGE的同質性。分離的抗體包括重組細胞內的原位抗體，因為抗體的天然環境的至少一種 組分將不存在。
[0103]如本文所用，"實質上純的"或"實質上純化的"表示存在的主要種類的化合物或種 類（即，在摩爾基礎上，其比組合物中任何其他個體種類更豐富）。在某些實施方案中，實質 上純化的組合物是這樣的組合物，其中所述種類占至少約50%(在摩爾基礎上）的所有存在 的大分子種類。在某些實施方案中，實質上純的組合物將包含多于約80%、85%、90%、95%或 99%的組合物中存在的所有大分子種類。在某些實施方案中，種類純化至實質的同質性(污 染物種類在組合物中通過常規檢測方法無法檢測到），其中組合物基本上由單一大分子種 類組成。
[0104]在另一實施方案中，本發明提供分離的多核苷酸，其編碼選自SEQ ID NOs: 27、29 和33的氨基酸序列。
[0105] 在另一實施方案中，本發明提供包含多核苷酸的重組表達載體，所述多核苷酸編 碼選自SEQ ID NOs: 27、29和33的氨基酸序列。
[0106] 本發明也提供任一前述的抗MET/EGFR多功能抗體、或其MET和EGFR結合片段，其用 于治療。
[0107] 本發明也提供任一前述的抗MET/EGFR多功能抗體、或其MET和EGFR結合片段，其用 于治療癌癥。
[0108] 本發明也提供任一前述的抗MET/EGFR多功能抗體、或其MET和EGFR結合片段，其用 于治療其中表達MET和EGFR的癌癥。
[0109] 本發明也提供任一前述的抗MET/EGFR多功能抗體，或其MET和EGFR結合片段，其用 于治療NSCLC、SCLC、胃癌、結腸直腸癌、膽管癌、食道癌、黑素瘤包括但不限于葡萄膜黑素 瘤、腎癌、肝癌、膀胱癌、子宮頸癌、或頭頸癌。
[0110]本發明也提供治療癌癥的方法，其包括向需要治療的人患者施用有效量的任一前 述的多功能抗體、或其MET和EGFR結合片段。
[0111] 術語"治療"（或"治療"或"治療"）指減緩、中斷、阻止、控制、終止、減少或反轉癥 狀、病癥、狀況或疾病的進程或嚴重性，但并不必須涉及所有疾病相關癥狀、狀況或病癥的 總體消除。
[0112] 術語"癌癥"（或"癌癥"）指增生性疾病，諸如肺癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、小細胞 肺癌(SCLC )、頭頸癌、直腸癌、肛門區癌、胃癌、胃癌、結腸癌、結腸直腸癌(CRC )、食道癌、黑 素瘤包括但不限于葡萄膜黑素瘤、肝癌、子宮頸癌、膀胱癌、腎癌或輸尿管癌、腎細胞癌、腎 盂癌，包括任何上述癌癥的難治性形式，或一種或多種上述癌癥的組合。
[0113] 如本文所用的短語"有效量"指達到希望的治療結果所必需的量(劑量和時期和施 用手段）。多功能抗體的有效量可以根據這樣的因素，諸如疾病狀態、年齡、性別，和個體體 重，以及抗體的能力，或其MET和EGFR結合片段而變化，以在個體中引發所希望的響應。有效 量也是這樣的量，其中抗體、或其MET和EGFR結合片段的治療有益效果超過其任何有害效 果。
[0114] 有效量是活性劑的至少最小量，但低于總體有害量，其為向主體傳遞治療益處所 必需。換言之，本發明的抗體的有效量或治療有效量是這樣的量，其在哺乳動物，優選人中 減少癌細胞的數量;減小腫瘤大小;抑制（即，減緩至一定程度或終止)癌細胞浸潤到外周組 織器官中；抑制（即，減緩至一定程度或終止)腫瘤轉移;抑制腫瘤生長至一定程度;和/或緩 解與癌癥相關的一種或多種癥狀至一定程度。可以以單次劑量或多次劑量施用有效量的本 發明的抗MET/EGFR多功能抗體。此外，可以以多次劑量的量施用有效量的本發明的抗MET/ EGFR多功能抗體，所述多次劑量如果不是多于一次施用，那么將會低于有效量。
[0115] 如醫學領域所熟知，用于任一主體的劑量取決于許多因素，包括患者的大小、體表 面積、年齡、待施用的具體化合物、性別、施用時間和途徑、一般健康，和同時施用的其他藥 物。劑量根據疾病的類型和嚴重性可以進一步變化。典型劑量可以是例如以下范圍，約I mg -約100 mg;優選約2 mg -約100 mg;更優選約5 mg -約100 mg;甚至更優選約5 mg -約50 mg，甚至更優選約5 mg -約25 mg;甚至更優選約5 mg -約20 mg;甚至更優選 約5 mg -約15 mg;然而，考慮低于或高于該示例性范圍的劑量，尤其考慮上述因素時。每 日腸胃外劑量方案可以從約10 yg/kg-約10 mg/kg。可以通過周期評估監測進程，并因此調 節劑量。
[0116] 在本發明的一些實施方案中，可以經靜脈內施用單次劑量的本發明的多功能抗體 用于在成年患者中治療癌癥。用于靜脈內施用的典型的單次劑量可以是例如，約IOOmg-約 1250mg的范圍內；優選，約200 mg -約1250 mg;更優選，約500 mg -約1250 mg;甚至 更優選，約750 mg -約1250 mg，甚至更優選，約800 mg -約1250 mg;甚至更優選，或 最優選約800 mg -約1000 mg;然而，考慮低于或高于該示例性范圍的劑量，尤其考慮上 述因素時。或者，用于靜脈內施用本發明的多功能抗體的典型的單次劑量可以是例如，約10 mg/kg -約20 mg/kg體重，更優選約12 mg/kg -約15 mg/kg，或甚至更優選約12 mg/ kg -約13 mg/kg。例如，可以每周一次，每兩周一次，每三周一次，或每月一次靜脈內施用 該劑量。可以通過周期評估監測進程，并因此調節劑量。
[0117] 這些提示量的抗體進行了大量的治療判斷。選擇合適劑量和方案中的關鍵因素是 所獲得的結果。在該上下文中的考慮因素包括所治療的具體病癥、個體患者的臨床狀況、病 癥起因、抗體的遞送位點、抗體的具體類型、施用方法、施用方案，和醫學技術人員已知的其 他因素。
[0118] 本發明的抗MET/EGFR多功能抗體在人醫學中用作藥物，其通過多種途徑施用。因 此，本發明還提供包含任一上述多功能抗體，或其MET和EGFR結合片段，和藥學上可接受的 載體，稀釋劑或賦形劑的藥物組合物。最優選地，該組合物用于腸胃外施用。如本文所用的 術語腸胃外包括靜脈內、肌內、皮下、直腸、陰道，或腹膜內施用。優選通過靜脈內或腹膜內 或皮下施用的腸胃外遞送。最優選靜脈內施用。用于該施用的合適的媒介物為本領域所熟 知。
[0119] 藥物組合物在所提供的容器，包括例如密封瓶、注射器或其他遞送裝置，例如筆 (pen)中，在制造和儲存條件下通常必須是無菌且穩定的。因此，藥物組合物在制備制劑后 必須無菌過濾，或以其他方式在無微生物污染下制備。
[0120] 本發明的抗體可以單獨或與藥學上可接受的載體和/或稀釋劑一起以單次或多次 劑量向人主體施用。可以將該藥物組合物設計適用于所選的施用模式，并且適當使用藥學 上可接受的稀釋劑、載體和/或賦形劑，諸如分散劑、緩沖液、表面活性劑、防腐劑、增溶劑、 等滲劑，包括但不限于氯化鈉、穩定劑等。可以根據例如Remington, The Science and Practice of Pharmacy,第19版，Gennaro，編輯，Mack Publishing Co. , Easton, PA (1995)(其提供技術人員一般已知的配制技術的摘要）中公開的常規技術設計該組合物。用 于藥物組合物的合適載體包括任何材料，當與本發明的抗體組合時，其保留分子活性并不 與主體免疫系統反應。
[0121] 以下非限制性實施例闡明了本發明多功能抗體的多種性質。 實施例
[0122] 參考實施例1 1.1.表達和純化多功能抗體NH-YK 可以基本如下表達和純化多功能抗體NH-YK。使用含有SEQ ID NO: 28 (編碼具有SEQ ID NO: 27的氨基酸序列的第一多肽）和SEQ ID NO: 34 (編碼SEQ ID NO: 33的輕鏈氨基 酸序列）的DNA的谷氨酰胺合成酶(GS)表達載體通過電穿孔來轉染中國倉鼠細胞系CH0K1SV (Lonza Biologies PLC，Slough, United Kingdom)。表達載體編碼SV早期（猿猴病毒40E) 啟動子和GS的基因。GS的表達允許谷氨酰胺(CH0K1SV細胞需要的一種氨基酸）的生物化學 合成。轉染后，將細胞用50μΜ L-甲硫氨酸磺基肟(MSX)進行大量選擇。利用MSX對GS的抑制 來增加選擇的嚴格性。將整合表達載體cDNA入宿主細胞基因組的轉錄活性區內的細胞對 CH0K1SV野生型細胞選擇，其表達內源水平的GS。以低密度鋪板轉染的庫(pool)以允許穩定 表達細胞的接近克隆的生長暈（close-to-clonal outgrowth)。可以篩選主孔的多功能抗 體表達，然后根據需要在無血清懸浮培養物中按比例放大。或者，批量選擇的轉染子可以進 行單細胞克隆程序，如熒光激活細胞分選(FACS)或有限稀釋并篩選多功能抗體表達。一旦 鑒定到合適的細胞系，那么根據需要在無血清懸浮培養物中將其按比例放大。將多功能抗 體已經分泌其中的澄清培養基應用到蛋白A親和柱上，其已經利用相容緩沖液，諸如磷酸緩 沖鹽溶液(pH 7.4)或Tris緩沖液(pH 7.4)進行了平衡。洗滌該柱以去除非特異性結合的 組分。例如通過pH梯度(諸如0.1 M磷酸鈉緩沖液pH 6.8-0.1 M檸檬酸鈉緩沖液pH 2.5-3.0)洗脫結合的多功能抗體。諸如通過280 nm處切割(cutting)的吸光度、SDS-PAGE或分析 大小排阻檢測和/或收集多功能抗體級分。通過常見技術包括尺寸排阻、疏水相互作用、離 子交換或羥基磷灰石層析可以將可溶的聚集體或多聚體有效去除。可以使用常見技術將多 功能抗體濃縮和/或無菌過濾。這些層析步驟后多功能抗體的純度高于90%，優選高于98%。 可以在-70 °C立即冰凍多功能抗體或儲存在4 °C數月。
[0123] 1.2.表達和純化多功能抗體NH-H9 可以基本如參考實施例1.1中上述表達和純化多功能抗體NH-H9,例外是使用含有SEQ ID NO: 30 (編碼具有SEQ ID NO: 29的氨基酸序列的第一多肽）和SEQ ID NO: 34 (編碼 SEQ ID NO: 33的輕鏈氨基酸序列）的DNA的谷氨酰胺合成酶(GS)表達載體通過電穿孔來轉 染中國倉鼠細胞系CH0K1SV (Lonza Biologies PLC, Slough, United Kingdom)。
[0124] 1.3.表達和純化多功能抗體H9 可以基本如參考實施例1.1中上述表達和純化多功能抗體H9,例外是使用含有編碼具 有SEQ ID NO: 52的氨基酸序列的第一多肽的DNA和SEQ ID NO: 34的DNA(編碼SEQ ID NO: 33的輕鏈氨基酸序列）的谷氨酰胺合成酶(GS)表達載體通過電穿孔來轉染中國倉鼠細胞系 CHOKISV (Lonza Biologies PLC, Slough, United Kingdom)〇
[0125] 1.4.表達和純化多功能抗體YK 可以基本如參考實施例1.1中上述表達和純化多功能抗體H9,例外是使用含有編碼具 有SEQ ID NO: 31的氨基酸序列的第一多肽的DNA和SEQ ID NO: 34的DNA(編碼SEQ ID NO: 33的輕鏈氨基酸序列）的谷氨酰胺合成酶(GS)表達載體通過電穿孔來轉染中國倉鼠細胞系 CHOKISV (Lonza Biologies PLC, Slough, United Kingdom)〇
[0126] 實施例1:多功能抗體與MET和EGFR的結合分析 可以根據本領域已知的方法，使用表面等離子體共振生物傳感器，諸如BIAcore ? 2000、BIAcore? 3000或BIAcore? TlOO (Biacore Life Sciences Division, GE Healthcare, Piscataway，NJ)來測量抗體，諸如本文公開的抗體的結合動力學和親合力。 除非另有說明，可以從BIAcore ? AB (Upsala, Sweden)購買所有試劑和材料，并且可以在 25°C下進行測量。簡言之，可以將樣品溶解在HBS-EP緩沖液中（150 mM氯化鈉，3 mM EDTA， 0.005% (w/v)表面活性劑P-20,和10 mM N-2-羥乙基-哌嗪-N'-2-乙磺酸（HEPES)，pH 7.4)。可以使用在所有四層流動室(Fe)上含有固定蛋白A(其可以使用標準的NHS-EDC胺偶 聯產生）的CM5芯片來采用捕獲方法學。開始可以通過稀釋到運行緩沖液中以I meg/mL制備 抗體樣品，然后可以以流速10 Ul/分鐘測試其捕獲30秒。基于所捕獲的量，因而可以調整抗 體濃度以靶定約70 RU-90 RU的捕獲量。可以通過稀釋到運行緩沖液中以100、50、25、12.5、 6·25、3· 13、1 ·56、0·78、0·39和0 (空白）nM的終濃度來制備MET-ECD或人EGFR-ECD。每個分 析周期可以由以下組成：（1)在分隔開的流動室(Fc2、Fc3和Fc4)上捕獲抗體樣品，（2)在所 有Fe以50 mcL/分鐘注射250 mcL (300-sec)的MET-ECD或EGFR-ECD，（3)返回緩沖液流20分 鐘以監測解離相，（4)利用25 mcL (30-sec)注射甘氨酸，pH 1.5再生芯片表面，（5)利用25 mcL (30-sec)注射HBS-EP+緩沖液（即，具有0.05% (w/v)而非0.005%的表面活性劑P-20的 HBS-EP緩沖液)平衡芯片表面。可以使用標準雙參考處理數據并使用Biacore TlOO評估軟 件，2.0版本或Biacore T200評估軟件，1.0版本擬合成1:1結合模型，來測定結合速率(k〇n， ifY1單位）、解離速率(Wf，S+1單位)和Rmax (RU單位）。可以從關系Kd= koff/U+算平衡 解離常數(Kd)。
[0127] 基本如上所述測試本發明的四個抗MET/EGFR多功能抗體以測定其與MET-ECD和 EGFR-ECD的結合動力學和結合親合力并在下文表4和5中概述結果。抗體NH-YK、NH-H9、H9和 YK以高結合親合力(Kd )結合MET-E⑶(表4)和EGFR-E⑶（表5)。
[0128] 表4:多功能抗體與MET-E⑶的結合動力學和親合力
[0130] 實施例2: NH-YK與細胞表面MET和EGFR兩者的結合 NSCLC細胞系H441 (ATCC, Manassas, VA;目錄號HTB-174)在表面上表達MET和EGFR 兩者。可以將H441細胞（6 X IO6)鋪板到100 mm聚-D-賴氨酸包被的組織培養皿上并在37 。(：，5% CO2下孵育2天。然后在4°C，利用100 nM對照IgG4、100 nM西妥昔單抗和100 nM抗 MET抗體的組合，或100 nM NH-YK處理細胞20分鐘。可以利用冰冷的DPBS洗滌細胞并使用具 有HALT蛋白酶和磷酸酶抑制劑(Thermo Scientific, Rockford, IL)的CHAPS裂解緩沖液 進行裂解。可以使用抗MET瓊脂糖(agarose)或抗EGFR瓊脂糖（sepharose)在600 yg各細胞 裂解物樣品上進行免疫沉淀（IP)并在4 °C下進行孵育。可以洗滌樹脂并從樹脂上洗滌所結 合的蛋白，然后裝載到4-20% SDS-PAGE上并印跡到硝酸纖維素膜上用于Western印跡。可以 探測膜的總MET或總EGFR。
[0131] 基本如上所述進行的免疫沉淀實驗證明在利用抗MET/EGFR多功能抗體NH-YK處理 后，而不是利用抗MET抗體、西妥昔單抗，或甚至抗MET抗體和西妥昔單抗的組合處理后MET 和EGFR共免疫沉淀。這些數據表明NH-YK可以結合MET和EGFR(數據未顯示）。
[0132] 實施例3:多功能抗體NH-YK和NH-H9顯示與細胞表面MET的增強的抗體親抗原性結 合 NSCLC癌細胞系HCC827具有高水平的MET表達。簡言之，可以使用無酶的解離緩沖液從 細胞培養瓶中取出HCC827細胞并以大約5 X IO5細胞/孔將其添加到96孔板中。然后在4°C 下，利用未標記抗體（以500 nM開始）與5 nM Alexa488-標記的抗MET抗體的組合劑量滴定 處理細胞1小時，以測定未標記抗體與標記的抗MET抗體競爭結合細胞表面MET的能力。最 終，可以通過FACS檢測標記的抗MET抗體的結合。
[0133] 如通過基本如本實施例中所述進行的測定所證明，抗MET/EGFR多功能抗體NH-YK 和NH-H9比其親本抗MET抗體具有明確較高的抗體親抗原性結合(表6 )。
[0134] 表6:抗MET/EGFR多功能抗體具有與HCC827細胞增加的抗體親抗原性結合
MFI =通過與Alexa 488-標記的抗MET Ab競爭表明的平均熒光強度。
[0135] 實施例4:抗MET/EGFR多功能抗體NH-YK和NH-H9對于內化和降解細胞表面EGFR比 西妥昔單抗顯示更好的活性 A部分:NSCLC細胞系H441在其細胞表面上表達中等水平的MET和EGFR。可以測試抗MET/ EGFR多功能抗體其耗盡來自H441細胞的細胞表面MET和EGFR的能力。簡言之，可以將2 mL培 養基中的1.5 X IO5個細胞每孔鋪板到6孔板中并在37°C，5% C〇2下孵育過夜。可以以50 nM 向H441細胞中加入抗體NH-YK、NH-H9或對照抗體。過夜處理后，可以利用無酶的解離緩沖液 從孔中取出細胞、洗滌，然后利用標記的EGFR或MET抗體(其識別來自多功能抗體或對照抗 體處理的不同表位)染色1小時。洗滌細胞并通過FACS測量標記的抗體染色。
[0136] 為了評估抗MET/EGFR多功能抗體NH-YK和NH-H9在體內促進MET和EGFR降解的能 力，基本如該實施例的A部分中所述進行測定。來自這些研究的結果證明，與其親本抗MET抗 體類似，抗MET/EGFR多功能抗體NH-YK和NH-H9能夠耗盡來自H441細胞的細胞表面MET。令人 驚奇的是，盡管抗MET/EGFR多功能抗體NH-YK和NH-H9觸發了顯著的EGFR降解，然而西妥昔 單抗或抗MET抗體和西妥昔單抗的組合卻不會觸發(表7)。
[0137] B部分:NSCLC細胞系H1993表達高水平的MET和中等水平的EGFR;胃癌細胞系MKN45 表達高水平的MET和低水平的EGFR;NSCLC細胞系H441在其細胞表面上表達中等水平的MET 和EGFR。簡言之，可以將2 mL培養基中的5 X IO5個細胞每孔鋪板到6孔板中并在37°C，5% CO2下孵育過夜。可以以100 nM向細胞中加入抗MET/EGFR多功能抗體NH-YK、NH-H9或對照抗 體。過夜處理后，可以裂解細胞，可以將15 Hg各樣品在4-12% BisTris凝膠上跑膠，然后印 跡至IjPVDF膜上。可以通過western印跡探測膜的總EGFR、總MET和GAPDH。
[0138] 為了評估抗腿1'/^6?1?多功能抗體順-￥1(和順-!19在體外促進腿1^陽6?1?降解的能 力，基本如該實施例的B部分中所述進行測定。來自這些研究的結果證明，與親本抗MET抗體 類似，抗體NH-YK和NH-H9降解來自H1993、MKN45和H441細胞的MET。然而，令人驚奇的是，抗 MET/EGFR多功能抗體NH-YK和NH-H9觸發了顯著的EGFR降解，然而西妥昔單抗或親本抗MET 抗體和西妥昔單抗的組合卻不會觸發(圖1)。
[0139] 表7.抗MET/EGFR多功能抗體對H441細胞上的EGFR具有增加的內化活性
MFI =平均熒光強度;AVG =平均數;Std. Err =標準誤差。
[0140] 實施例5:抗MET/EGFR多功能抗體NH-YK和NH-H9阻斷MET和EGFR激活 A部分：已經顯示在存在HGF的情況下NSCLC癌細胞系H596對EGFR抑制劑的生長抑制作 用具有抗性。因此，該細胞系可以用于測定在存在HGF的情況下抗體是否可以抑制H596的增 殖。簡言之，可以將100 yL培養基中的3 X IO3個細胞/孔鋪板到96孔板中并在37°C，5% CO2 下孵育過夜。可以從100 nM(最終)開始在無血清培養基中以1:3稀釋抗MET/EGFR多功能抗 體NH-YK和NH-H9或對照抗體并將其與50 yL中的50 ng/mL HGF(最終）組合以4x濃度加入 到H596細胞中。在細胞額外生長6天結束時，可以將平板平衡到室溫30分鐘并且可以加入 100 yL/孔的CellTiter-Glo ? 試劑（Promega Corp.，Fitchburg, WI )。可以通過測量發 光來測定細胞活力。
[0141] 基本如該實施例所述進行的測定證明抗MET/EGFR多功能抗體順-￥1(和順-!19比西 妥昔單抗或親本抗MET抗體和西妥昔單抗的組合更好地抑制HGF刺激的H596的體外增殖。
[0142] 表8:抗MET/EGFR多功能抗體在存在HGF的情況下在抑制H596增殖中顯示比單個抗 體的組合持高的活件
縮寫:AVG =細胞活力的平均％; Std .Err =標準誤差。
[0143] B部分：其他腫瘤細胞系也可以用于測定抗MET/EGFR多功能抗體在體外測定中抑 制腫瘤細胞的增殖中是否具有比兩個單獨抗體的組合較高的活性。例如，盡管具有中等水 平的MET表達，但是已經顯示結腸癌細胞系GEO受EGFR配體自分泌激活的驅動。肺癌細胞系 H1666具有EGFR基因擴增并且已經顯示其增殖受EGFR激活的驅動。NSCLC細胞系H1993和 EBC-I均表達高水平的MET(由于MET基因擴增），和中等水平的EGFR。
[0144] 基本如該實施例所述進行的測定證明抗MET/EGFR多功能抗體順-￥1(和順-!19比西 妥昔單抗更好地抑制結腸癌細胞系GEO的體外增殖，并且令人驚奇的是，甚至比其親本抗 MET抗體和西妥昔單抗的組合更有效(表9)。
[0145] 表9:抗MET/EGFR多功能抗體在抑制GEO增殖中顯示比單個抗體的組合較高的活性
縮寫:AVG =細胞活力的平均％; Std .Err =標準誤差。
[0146] 類似地，表10中顯示的結果證明抗MET/EGFR多功能抗體NH-YK、NH-H9和H9各自比 西妥昔單抗更好地抑制H1666增殖，并且比親本抗MET抗體和西妥昔單抗的組合更有效。
[0147] 表10:抗MET/EGFR多功能抗體在抑制H1666增殖中顯示比單個抗體的組合較高的 活性
縮寫:AVG =細胞活力的平均％; Std .Err =標準誤差。
[0148] 類似地，表11中顯示的結果證明抗MET/EGFR多功能抗體NH-YK和NH-H9各自與其親 本抗MET抗體和西妥昔單抗的組合一樣好地抑制H1993(表11)和EBC-I (表12)增殖，或比其 親本抗MET抗體和西妥昔單抗的組合更好地抑制H1993(表11)和EBC-I (表12)增殖。
[0149] 表11:抗MET/EGFR多功能抗體在抑制H1993增殖中顯示比單個抗體的組合較高的 活性
縮寫:AVG =細胞活力的平均％; Std .Err =標準誤差。
[0150]表12:抗MET/EGFR多功能抗體在抑制EBC-I增殖中顯示比單個抗體的組合較高的 活性
縮寫:AVG =細胞活力的平均％; Std .Err =標準誤差。
[0151 ] 實施例6:抗MET/EGFR多功能抗體NH-YK和NH-H9誘導細胞凋亡 胃癌細胞系MKN45可以用于測定抗體誘導的細胞凋亡。簡言之，可以將80 yL培養基中 的3 X IO3細胞/孔鋪板到96孔板中并在37°C，5%⑶2下孵育過夜。可以在細胞培養基中稀 釋CellEvent TM 試劑（Life Technologies, Carlsbad, CA)并以每孔 10 yL進行添加。為了 100 nM的終濃度，以10 uL的IOx濃度向MKN45細胞中加入NH-YK、NH-H9或對照抗體。在37°C， 5% C〇2下，可以通過INCUCYTE? Kinetic Imaging System (Essen Bioscience, Ann Arbor，MI)以3小時的間隔實時測量胱天蛋白酶-3/7陽性細胞，持續總計120小時。
[0152] 如通過基本如該實施例中所述進行的測定所測定，抗MET/EGFR多功能抗體NH-YK 和NH-H9各自在MKM5中比親本MET Ab和西妥昔單抗的組合誘導更多的體外細胞凋亡（表 13)。此外，在基本如該實施例中所述進行的測定中，NH-YK比單臂f5D5和埃羅替尼的組合誘 導更高程度的MKN45細胞凋亡(數據未顯示）。
[0153] 表13:MKN45細胞凋亡測定
縮寫:AVG =細胞凋亡的平均%增加； Std. Err =標準誤差。
[0154] 實施例7:抗MET/EGFR多功能抗體NH-YK在存在HGF的情況下恢復腫瘤細胞的埃羅 替尼敏感性 NSCLC癌細胞系HCC827具有EGFR基因擴增和高的MET表達。HCC827細胞對埃羅替尼處理 敏感，但是在存在HGF的情況下對埃羅替尼處理變得有抗性。簡言之，可以將100 uL培養基 中的3 X IO3細胞/孔鋪板到96孔板中并在37°C，5% CO2下孵育過夜。為了50 nM抗體、50 ng/mL HGF和1 μΜ埃羅替尼的終濃度，可以向細胞中加入NH-YK或對照抗體(hIgG4)l小時， 隨后加入埃羅替尼和/或HGF。細胞在37°C，95%相對濕度和5% (v/v) CO2下額外生長3天結 束時，可以將平板平衡至室溫30分鐘并加入100 uL/孔CellTiter-Glo ?試劑（Promega Corp.)。可以在定軌振蕩器上振蕩平板2分鐘以混合內容物，然后將其在室溫下孵育10分鐘 以穩定發光信號。可以通過測量發光來測定細胞活力。
[0155]如通過進行基本如該實施例所述的測定所測定，抗體NH-YK在存在HGF的情況下能 夠比親本抗MET抗體與西妥昔單抗的組合更好地恢復體外HCC827細胞的埃羅替尼敏感性 (表 14)〇
[0156] 表14:抗MET/EGFR多功能抗體順-￥1(在存在邪?的情況下在恢復!10：827對埃羅替尼 的敏感性中具有比單個抗體的組合較高的活性
縮寫:AVG =細胞活力的平均％; Std .Err =標準誤差;H = HGF。
[0157] 實施例8:抗MET/EGFR多功能抗體NH-YK恢復利用HGF和EGF處理的HT-29細胞的B-Raf抑制劑PLX4032敏感性 結腸癌細胞系HT-29具有B-Raf突變并對B-Raf抑制劑PLX4032敏感。HT-29細胞在HGF和 EGF刺激后變得對PLX4032或泛(pan)-Raf抑制劑處理有抗性。可以測試抗MET/EGFR多功能 抗體其恢復利用HGF和EGF處理的HT-29細胞的PLX4032抑制劑敏感性的能力。簡言之，可以 將100 UL培養基中的3 X IO3細胞/孔鋪板到96孔板中并在37°C，5% CO2下孵育過夜。在無 血清培養基中稀釋抗體順-￥1(、？1^4032、邪？46?、陽性對照和陰性對照并將其以知濃度加 入到50 nL中的HT-29細胞中。試劑的終濃度可以是:抗體為50 nM，HGF和EGF為50 ng/mL， PLX4032從1 μΜ開始1:5的稀釋。在細胞生長額外5天結束時，可以將平板平衡到室溫30分鐘 并且可以加入100 yL/孔的CellTiter-Glo ?試劑(Promega Corp.)。可以通過測量發光來 測定細胞活力。
[0158] 如通過進行基本如該實施例所述的測定所測定，抗體NH-YK能夠恢復利用HGF和 EGF處理的ΗΤ-29細胞的PLX4032敏感性(表15)。此外，抗體NH-YK在恢復FaDu細胞中的拉帕 替尼（即，EGFR/HER-2抑制劑)敏感性中優于親本抗MET抗體和西妥昔單抗的組合(表16)。
[0159] 表15:抗體NH-YK在存在HGF和EGF的情況下在恢復HT-29對B-Raf抑制劑PLX4032的 敏感性中具有比單個抗體的組合較高的活性
縮寫:PLX = PLX4032;AVG =細胞活力的平均％; Std.Err =標準誤差；H = HGF (50 ng/mL); E = EGF (50 ng/mL) 所有抗體均為50 nM。
[0160] 表16:抗MET/EGFR多功能抗體NH-YK和NH-H9在存在HGF的情況下在恢復FaDu對拉 帕替尼的敏感性中具有比單個抗體的組合較高的活性
[0161 ] 實施例9:小鼠異種移植模型中的MET和EGFR降解 可以根據本領域所熟知的方法，在攜帶H441 (NSCLC)和MKN45(胃癌）異種移植腫瘤的 小鼠中評估抗MET/EGFR多功能抗體在體內促進MET和EGFR降解的能力。
[0162] 在H441異種移植物中給藥后48小時施用兩個不同劑量水平（10和27mg/kg)的抗體 NH-YK誘導與親本抗MET抗體和西妥昔單抗（均以20 mg/kg給藥）的組合相當水平的MET降 解。相反，當與相同異種移植模型中的PBS處理的對照動物相比時，親本抗MET抗體和西妥昔 單抗(均以20 mg/kg給藥）的組合不能誘導EGFR降解。令人驚奇的是，當與PBS處理的或親本 抗MET抗體和西妥昔單抗(均以20 mg/kg給藥)處理的小鼠相比時，施用抗體NH-YK觸發顯著 的EGFR降解。類似地，在攜帶MKN45胃異種移植物的動物中，當與親本抗MET抗體和西妥昔單 抗(均以20 mg/kg給藥）的組合相比時，抗體NH-YK促進MET的同等降解，但是令人驚奇地顯 著更高的EGFR降解。
[0163] 實施例10:在NSCLC (!11993、!144148(：-1)和胃癌的小鼠異種移植模型中抑制腫瘤 生長 可以通過商業途徑獲得，包括從Harlan Laboratories (Indianapolis, IN)獲得年齡 6-7周的雌性無胸腺裸鼠。允許小鼠適應一周并以正常低脂肪(4.5%)飲食隨意飼喂，其可以 在研究期間持續進行。可以從ATCC購買獲得腫瘤細胞并可以在細胞培養基，如具有L-谷氨 酰胺、25 mM HEPES的補充有 10% FBS和I mM丙酮酸鈉的RPMI 1640 (Life Technologies) 中進行培養。可以利用無血清培養基剝離洗滌細胞，然后在無血清RPMI 1640中以50 x IO6細胞/mL的終濃度進行重懸浮。可以在主體小鼠的后脅腹經皮下注射無血清生長培養 基和Matrigel (Becton Dickinson, Bedford, MA)的1:1混合物中的大約 5 X IO6 腫瘤 細胞。每周兩次進行腫瘤和體重測量。在處理前，可以使用隨機算法基于腫瘤大小將小鼠隨 機化。可以當平均腫瘤體積達到100 mm3時開始處理。將隨機化的小鼠分到不同組中并且每 周一次通過尾靜脈注射以抗體進行給藥。
[0164] 在給藥前，在磷酸緩沖鹽溶液(PBS)中制備所有測試或對照抗體。可以通過卡尺測 量測定腫瘤大小。可以從公式A2 X B X 0.536估計腫瘤體積(mm3)，其中A是較小的垂直直 徑，B是較大的垂直直徑。可以將腫瘤體積數據轉換成對數標尺(log scale)以等于跨時間 和處理組的變量。可以使用SAS PROC MIXED軟件（SAS Institutes Inc, Cary, NC)，利用 雙向重復測量ANOVA通過時間和處理分析對數體積數據。在每個時間點上將處理組與規定 的對照組進行比較。
[0165] A部分:如該實施例中上述產生攜帶H1993 NSCLC異種移植物的免疫缺陷小鼠并利 用媒介物對照、抗體NH-YK或親本MET抗體加西妥昔單抗的組合每周一次進行處理，持續連 續5周。親本MET抗體和西妥昔單抗(均以20 mg/kg給藥）的組合導致平均處理腫瘤體積除以 平均媒介物對照腫瘤體積(T/C%)值的百分比為86.1%，而等摩爾劑量的抗體NH-YK (27 mg/ kg)導致腫瘤體積顯著更高的降低(T/C%為28.5%，p〈0.001)(圖2)。當在H441異種移植物 中測試時，與媒介物對照或親本MET抗體和西妥昔單抗的組合相比時，抗體NH-YK也顯示較 高的功效（圖3)。
[0166] B部分：在EBC-I NSCLC異種移植模型中，利用抗體NH-YK的處理（10 mpk)導致 32·9%的T/C%(p〈0·001)(圖4)。
[0167] C部分：胃癌細胞系MKN45具有高水平的MET基因擴增并且對MET抑制劑高度敏感。 在MKN45胃異種移植模型中，抗體NH-YK顯示與親本MET抗體和西妥昔單抗的組合相當的抗 腫瘤功效(分別為T/C% = 17.4%, p〈 0.001和 18.6%, p〈 0.001)(圖5)。
[0168] D部分:在H1993 NSCLC異種移植模型中，利用媒介物對照、抗MET/EGFR多功能抗體 H9(4和27 mg/kg)、單獨抗MET(3和20 mg/kg)、西妥昔單抗（3和20 mg/kg)或抗MET加西妥 昔單抗的組合(3 mg/kg和20 mg/kg的每種抗體)每周一次處理攜帶異種移植物的免疫缺陷 小鼠，持續連續5周。27 mg/kg的抗MET/EGFR多功能抗體H9導致比任何其他處理顯著更高的 抗腫瘤功效(P〈〇. 001)(圖6)。
[0169] 當在H441異種移植物中測試時，當與單個處理或親本MET抗體和西妥昔單抗的組 合相比時，抗體H9也顯示較高的功效（圖7 )。
[0170] 實施例11:在結腸直腸癌患者來源的異種移植(PDX)模型中抑制腫瘤生長 可以獲得患者來源的結腸直腸癌樣品并且可以將來源于單個患者的腫瘤片段植入單 只缺乏免疫的小鼠中并允許其生長直至達到大概100-200 mm3的體積。可以每周一次施用 以27 mg/kg的抗體NH-YK或媒介物對照，持續連續3-4周。可以每周兩次通過電子卡尺測量 腫瘤。也可以定期評估體重。可以利用以每周一次的安排通過腹膜內（i.p.)注射施用的磷 酸緩沖鹽溶液(PBS)來處理媒介物對照組，進行4個周期。可以使用公式計算腫瘤體積:A 2 X B X 0.536,其中A是較小的垂直直徑，B是較大的垂直直徑。
[0171] 基本如該實施例11中上述將來自兩個患者的結腸直腸癌樣品單獨植入到兩只不 同的缺乏免疫的小鼠中。如表17和18中所示，當與攜帶rox腫瘤的媒介物處理的動物進行比 較時，每周施用抗體NH-YK顯著減少rox腫瘤各自的體積。
[0172] 表17
[0174] 實施例12:在頭頸部鱗狀細胞癌（SCCHN)患者來源的異種移植(PDX)模型中抑制腫 瘤生長 可以獲得患者來源的頭頸部鱗狀細胞癌(SCCHN)樣品并且可以將來源于單個患者的腫 瘤片段植入單只缺乏免疫的小鼠中并允許其生長直至達到大概100-200 mm3的體積。可以 每周兩次施用以27 mg/kg的抗體NH-YK或媒介物對照，持續連續4周。可以每周兩次通過電 子卡尺測量腫瘤。也可以定期評估體重。可以如下處理媒介物對照組:利用以每周一次的安 排通過腹膜內注射施用的PBS，進行4個周期，和以每周一次的安排通過口服飼喂(p.o.)施 用的20% PEG 400/80% [蒸餾去離子水中的20% captisol]，進行28個周期。可以使用公式 計算腫瘤體積:腫瘤體積(mm3)=寬度2 X長度X 0.52。
[0175] 基本如該實施例12中上述將來自兩個患者的頭頸部鱗狀細胞癌樣品單獨植入到 兩只不同的缺乏免疫的小鼠中。如表19中所示，當與攜帶rox腫瘤的媒介物處理的動物進行 比較時，每周兩次施用抗體NH-YK顯著減少rox腫瘤的體積。
[0176] 表19
均值的標準誤差(SEM)。
[0177] 實施例13:在埃羅替尼抗性NSCLC (埃羅替尼抗性HCC-827)的小鼠異種移植模 型中抑制腫瘤生長 可以通過商業途徑獲得，包括從Harlan Laboratories獲得年齡6-7周的雌性無胸腺裸 鼠。允許小鼠適應一周并以正常低脂肪(4.5%)飲食隨意飼喂，其可以在研究期間持續進行。 可以從ATCC購買獲得HCC-827腫瘤細胞并可以在細胞培養基諸如具有L-谷氨酰胺、25 mM HEPES的補充有10% FBS和I mM丙酮酸鈉的RPMI 1640中進行培養。可以利用無血清培養基 剝離洗滌細胞，然后在無血清RPMI 1640中以50 X IO6細胞/mL的終濃度進行重懸浮。可 以在雌性無胸腺裸鼠的后脅腹經皮下植入無血清生長培養基和Matrigel的1:1混合物中的 大約5 X IO6活的腫瘤細胞。一旦腫瘤建立，那么利用25 mg/kg埃羅替尼的每日劑量處 理小鼠，直至即使在存在埃羅替尼的情況下抗性腫瘤也開始重新生長。一旦抗性腫瘤達到 大概1000 mm3的平均體積，可以將它們切除，分成50 mm3的片段并重新植入到主體雌性無胸 腺裸鼠中。為了監測重新生長，可以每周兩次進行腫瘤和體重的測量。一旦平均腫瘤體積達 到100 mm3,使用隨機算法將動物隨機化并分到處理組中。在PBS中稀釋抗體并通過尾靜脈 注射每周一次施用。為了保證腫瘤是埃羅替尼抗性的，對照組中的動物接受PBS媒介物和25 mg/kg埃羅替尼。通過電子卡尺測定并可以從公式A2 X B X 0.536估計腫瘤體積(mm3)，其 中A是較小的垂直直徑，B是較大的垂直直徑。
[0178] 如該實施例中上述產生攜帶埃羅替尼抗性的HCC-827 NSCLC異種移植物的免疫缺 陷小鼠并利用以下進行處理：（A)媒介物加25 mg/kg埃羅替尼（即，對照組），（B) 25 mg/ kg埃羅替尼和27 mg/kg抗體NH-YK的組合，（C)25 mg/kg埃羅替尼和20 mg/kg西妥昔單 抗的組合，（D)以20 mg/kg給藥的親本MET抗體和25 mg/kg埃羅替尼的組合，或（E)以20 mg/kg給藥的親本MET抗體、以20 mg/kg給藥的西妥昔單抗和25 mg/kg埃羅替尼的組合。與 所有其他處理組相比，在相同或更長的時期后，抗體NH-YK和埃羅替尼的組合（即，處理組 (B))導致絕對腫瘤體積的顯著減少（表20)。因此，利用抗體NH-YK和埃羅替尼的組合處理 后，特別是當與利用組合有PBS媒介物、西妥昔單抗或親本MET抗體的埃羅替尼處理的動物 相比時，攜帶埃羅替尼抗性的腫瘤的小鼠中的腫瘤生長被顯著減小。當與埃羅替尼、西妥昔 單抗和親本MET抗體的組合(E)相比時，抗體NH-YK和埃羅替尼(B)的組合也顯示較高的抗腫 瘤功效。
[0179] 表20
【主權項】
1. 多功能抗體，其包含 (a) 抗體，所述抗體結合MET并包含： i) 重鏈，所述重鏈包含分別由GYTFTDYYMH (SEQ ID NO: 11)、RVNPNRRGTTYNQKFEG (SEQ ID NO: 12)和ARANWLDY (SEQ ID NO: 13)的氨基酸序列組成的重鏈CDR HCDR1、 HCDR2 和 HCDR3;和 ii) 輕鏈，所述輕鏈包含分別由SVSSSVSSIYLH (SEQ ID NO: 14)、YSTSNLAS (SEQ ID NO: 15)和QVYSGYPLT (SEQ ID NO: 16)的氨基酸序列組成的輕鏈CDR LCDR1、LCDR2和 LCDR3;和 (b) scFv多肽，所述scFv多肽結合EGFR并包含： i) HCVR結構域，所述HCVR結構域包含分別由氨基酸序列GFSLTNYGVH (SEQ ID NO: 1)、VIXiSGGNTDYNTPFX2G (SEQ ID NO: 9)和ARALDYYDYDFAY (SEQ ID NO: 3)組成的scFv CDR scFv-HCDRl、scFv-HCDR2和scFv-HCDR3，其中Xi為Y或W且X2為K或T;和 ii) LCVR結構域，所述LCVR結構域包含分別由氨基酸序列RASYSIGTNIH (SEQ ID NO: 4)、XiYAX2X3SIS (SEQ ID NO: 10)和QQNNAWPTT (SEQ ID NO: 6)組成的scFv CDR scFv-LCDR1、scFv-LCDR2 和 scFv-LCDR3，其中 Xi 為 R或 Y，X2 為K或 S，且X3 為E或 R。2. 權利要求1的多功能抗體，其中結合EGFR的scFv包含： i) HCVR結構域，所述HCVR結構域包含分別由氨基酸序列GFSLTNYGVH (SEQ ID NO: 1)、VIYSGGNTDYNTPFKG (SEQ ID NO: 2)和ARALDYYDYDFAY (SEQ ID NO: 3)組成的scFv CDR scFv-HCDRl、scFv-HCDR2和scFv-HCDR3;和 ii) LCVR結構域，所述LCVR結構域包含分別由氨基酸序列RASYSIGTNIH (SEQ ID NO: 4)、RYAKESIS (SEQ ID NO: 5)和QQNNAWPTT (SEQ ID NO: 6)組成的scFv CDR scFv-LCDR1、scFv-LCDR2和scFv-LCDR3。3. 權利要求1或2的多功能抗體，其中所述scFv多肽包含： (a) 包含SEQ ID NO: 17的氨基酸序列的HCVR結構域;和 (b) 包含SEQ ID NO: 18的氨基酸序列的LCVR結構域。4. 權利要求1-3中任一項的多功能抗體，其中所述重鏈包含SEQ ID NO: 53的氨基酸序 列并且所述輕鏈包含SEQ ID NO: 33的氨基酸序列。5. 權利要求1 - 3中任一項的多功能抗體，其中所述s c F v多肽的C末端經肽接頭融合至 MET抗體重鏈的N末端。6. 權利要求1-5中任一項的多功能抗體，其包含SEQ ID NO: 25的氨基酸序列。7. 權利要求1-6中任一項的多功能抗體，其中所述重鏈包含SEQ ID NO: 27的氨基酸序 列并且所述輕鏈包含SEQ ID NO: 33的氨基酸序列。8. 權利要求1-7中任一項的多功能抗體，其中結合MET的抗體包含： (a) 第一重鏈和第二重鏈，其中每一重鏈包含分別由GYTFTDYYMH (SEQ ID NO: 11)、 RVNPNRRGTTYNQKFEG (SEQ ID NO: 12)和ARANWLDY (SEQ ID NO: 13)的氨基酸序列組成的 重鏈CDR HCDR1、HCDR2和HCDR3;和 (b) 第一輕鏈和第二輕鏈，其中每一輕鏈包含分別由SVSSSVSSIYLH (SEQ ID NO: 14)、YSTSNLAS (SEQ ID NO: 15)和QVYSGYPLT (SEQ ID NO: 16)的氨基酸序列組成的輕鏈 CDR LCDR1、LCDR2和LCDR3。9. 權利要求8的多功能抗體，其中所述第一 scFv多肽和第二scFv多肽各自包含： i) HCVR結構域，所述HCVR結構域包含分別由氨基酸序列GFSLTNYGVH (SEQ ID NO: 1)、VIYSGGNTDYNTPFKG (SEQ ID NO: 2)和ARALDYYDYDFAY (SEQ ID NO: 3)組成的scFv CDR scFv-HCDRl、scFv-HCDR2和scFv-HCDR3;和 ii) LCVR結構域，所述LCVR結構域包含由氨基酸序列RASYSIGTNIH (SEQ ID NO: 4)、 RYAKESIS (SEQ ID NO: 5)和QQNNAWPTT (SEQ ID NO: 6)組成的scFv CDR scFv-LCDRl、 scFv-LCDR2和scFv-LCDR3。10. 權利要求9的多功能抗體，其中所述第一 scFv多肽和第二scFv多肽各自包含： (a) 包含SEQ ID NO: 17的氨基酸序列的HCVR結構域;和 (b) 包含SEQ ID NO: 18的氨基酸序列的LCVR結構域。11. 權利要求10的多功能抗體，其中所述第一和第二scFv多肽各自包含SEQ ID NO: 23 的氨基酸序列。12. 權利要求11的多功能抗體，其中結合MET的抗體包含： i) 第一重鏈和第二重鏈，其中每一重鏈包含SEQ ID NO: 53的氨基酸序列;和 ii) 第一輕鏈和第二輕鏈，其中每一輕鏈包含SEQ ID NO: 33的氨基酸序列。13. 權利要求12的多功能抗體，其中第一 scFv多肽的C末端經肽接頭融合至第一重鏈的 N末端并且第二scFv多肽的C末端經肽接頭融合至第二重鏈的N末端。14. 權利要求13的多功能抗體，其包含兩條第一多肽和兩條第二多肽，其中兩條第一多 肽的氨基酸序列是SEQ ID NO: 27和兩條第二多肽的氨基酸序列是SEQ ID NO: 33。15. 權利要求1-14中任一項的多功能抗體，其中所述多功能抗體誘導細胞表面MET和 EGFR的內化和/或降解。16. 權利要求1的多功能抗體，其中結合EGFR的scFv包含： i) HCVR結構域，所述HCVR結構域包含分別由氨基酸序列GFSLTNYGVH (SEQ ID NO: 1)、VIWSGGNTDYNTPFTG (SEQ ID NO: 7)和ARALDYYDYDFAY (SEQ ID NO: 3)組成的scFv CDR scFv-HCDRl、scFv-HCDR2和scFv-HCDR3;和 ii) LCVR結構域，所述LCVR結構域包含分別由氨基酸序列RASYSIGTNIH (SEQ ID NO: 4)、YYASRSIS (SEQ ID NO: 8)和QQNNAWPTT (SEQ ID NO: 6)組成的8。卩￥〇01?8。卩￥-LCDR1、scFv-LCDR2、scFv-LCDR3 〇17. 權利要求16的多功能抗體，其中所述scFv多肽包含： (a) 包含SEQ ID NO: 19的氨基酸序列的HCVR結構域;和 (b) 包含SEQ ID N0:20的氨基酸序列的LCVR結構域。18. 權利要求16-17中任一項的多功能抗體，其中結合MET的抗體包含： i) 包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列的重鏈;和 ii) 包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的輕鏈。19. 權利要求16-18中任一項的多功能抗體，其中所述scFv多肽的C末端經肽接頭融合 至MET抗體重鏈的N末端。20. 權利要求16-19中任一項的多功能抗體，其包含SEQ ID NO: 26的氨基酸序列。21. 權利要求16-20中任一項的多功能抗體，其包含 i) SEQ ID NO:29的氨基酸序列；和 ii)SEQIDN0:33的氨基酸序列。22. 權利要求21的多功能抗體，其中結合MET的抗體包含： (a) 第一重鏈和第二重鏈，其中兩條重鏈均包含分別由GYTFTDYYMH (SEQ ID NO: 11)、RVNPNRRGTTYNQKFEG (SEQ ID NO: I2)和ARANWLDY (SEQ ID NO: I3)的氨基酸序列組 成的重鏈CDR HCDR1、HCDR2和HCDR3;和 (b) 第一輕鏈和第二輕鏈，其中兩條輕鏈均包含分別由SVSSSVSSIYLH (SEQ ID NO: 14)、YSTSNLAS (SEQ ID NO: 15)和QVYSGYPLT (SEQ ID NO: 16)的氨基酸序列組成的輕鏈 CDR LCDR1、LCDR2和LCDR3。23. 權利要求22的多功能抗體，其中所述第一 scFv多肽和第二scFv多肽各自包含： i) HCVR結構域，所述HCVR結構域包含分別由氨基酸序列GFSLTNYGVH (SEQ ID NO: 1)、VIWSGGNTDYNTPFTG (SEQ ID NO: 7)和ARALDYYDYDFAY (SEQ ID NO: 3)組成的scFv CDR scFv-HCDRl、scFv-HCDR2和scFv-HCDR3;和 ii) LCVR結構域，所述LCVR結構域包含分別由氨基酸序列RASYSIGTNIH (SEQ ID NO: 4)、YYASRSIS (SEQ ID NO: 8)和QQNNAWPTT (SEQ ID NO: 6)組成的8。卩￥〇01?8。卩￥-LCDR1、scFv-LCDR2、scFv-LCDR3 〇24. 權利要求23的多功能抗體，其中所述第一 scFv多肽和第二scFv多肽各自包含： i) 包含SEQ ID NO: 19的氨基酸序列的HCVR結構域;和 ii) 包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的LCVR結構域。25. 權利要求24的多功能抗體，其中所述第一和第二scFv多肽各自包含SEQ ID NO: 24 的氨基酸序列。26. 權利要求25的多功能抗體，其中結合MET的抗體包含： i) 第一重鏈和第二重鏈，其中兩條重鏈均包含SEQ ID NO: 53的氨基酸序列;和 ii) 第一輕鏈和第二輕鏈，其中兩條輕鏈均包含SEQ ID NO: 33的氨基酸序列。27. 權利要求26的多功能抗體，其中第一 scFv多肽的C末端經肽接頭融合至第一重鏈的 N末端并且第二scFv多肽的C末端經肽接頭融合至第二重鏈的N末端。28. 權利要求27的多功能抗體，其包含兩條第一多肽和兩條第二多肽，其中兩條第一多 肽的氨基酸序列是SEQ ID NO: 29和兩條第二多肽的氨基酸序列是SEQ ID NO: 33。29. 藥物組合物，其包含權利要求1-28中任一項的多功能抗體，或其MET和EGFR結合片 段，以及藥學上可接受的載體、稀釋劑、或賦形劑。30. 權利要求1-28中任一項的多功能抗體、或其MET和EGFR結合片段，其用于治療。31. 權利要求1-28中任一項的多功能抗體、或其MET和EGFR結合片段，其用于治療癌癥。 3 2.權利要求1 - 2 8中任一項的多功能抗體、或其Μ E T和E G F R結合片段，其用于治療 NSCLC、SCLC、胃癌、結腸直腸癌、膽管癌、食道癌、黑素瘤、葡萄膜黑素瘤、腎癌、肝癌、膀胱 癌、子宮頸癌、或頭頸癌。 3 3.權利要求1 - 2 8中任一項的多功能抗體、或其Μ E T和E G F R結合片段，其用于治療 NSCLC、SCLC、胃癌、結腸直腸癌、膽管癌、食道癌、黑素瘤、葡萄膜黑素瘤、腎癌、肝癌、膀胱 癌、子宮頸癌、或頭頸癌，其中所述癌癥的特征在于包含具有一個或多個KRAS突變的細胞。34.治療癌癥的方法，其包括向有需要的患者施用有效量的權利要求1-28中任一項的 多功能抗體、或其MET和EGFR結合片段。35. 權利要求34的方法，其中所述癌癥是人中的NSCLC、SCLC、胃癌、結腸直腸癌、膽管 癌、食道癌、黑素瘤、葡萄膜黑素瘤、腎癌、肝癌、膀胱癌、子宮頸癌、或頭頸癌。36. 權利要求34或35的方法，其中所述腫瘤的特征在于包含具有一個或多個KRAS突變 的細胞。 37. DNA分子，其包含編碼具有SEQ ID NO: 27的氨基酸序列的多肽的多核苷酸。 38. DNA分子，其包含編碼具有SEQ ID NO: 23的氨基酸序列的多肽的多核苷酸。 39. DNA分子，其包含： (a) 編碼具有SEQ ID NO: 27的氨基酸序列的多肽的多核苷酸;和 (b) 編碼具有SEQ ID NO: 33的氨基酸序列的多肽的多核苷酸。40. 哺乳動物細胞，其轉化有權利要求37-39中任一項的DNA分子，所述細胞能夠表達包 含具有SEQ ID NO: 27的氨基酸序列的第一多肽和具有SEQ ID NO: 33的氨基酸序列的第 二多肽的多功能抗體。41. 權利要求40的哺乳動物細胞，其中所述哺乳動物細胞是CH0。42. 用于產生多功能抗體的方法，所述多功能抗體包含其氨基酸序列是SEQ ID NO: 27 的第一多肽和其氨基酸序列是SEQ ID NO: 33的第二多肽，所述方法包括：（1)在使得所述 多功能抗體表達的條件下培養權利要求40或41的哺乳動物細胞，和(2)回收表達的多功能 抗體。43. 結合MET和EGFR的多功能抗體，其通過權利要求42的方法產生。
【文檔編號】C07K16/46GK105829345SQ201480070368
【公開日】2016年8月3日
【申請日】2014年12月17日
【發明人】H.阿爾達斯, B.艾倫, 劉玲, 唐鷹, S-H.R.張, P.P.亞基, 呂繼蓉
【申請人】伊萊利利公司