一種快速深層液態發酵生產蟬擬青霉菌粉的方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于微生物技術領域，具體涉及一種快速利用深層液態發酵技術生產真菌 菌絲體的方法，更確切地說是一種快速深層液態發酵生產蟬擬青霉菌粉的方法。
【背景技術】
[0002] 微生物發酵可分為分批、補料分批、半連續、連續等多種模式。分批發酵的人力、物 力消耗較大，每批發酵都需要進行裝料、滅菌、接種、放料、清洗等操作，工序繁瑣，發酵周期 較長，生產效率較低;補料分批發酵雖可通過補料補充養分或前體的不足，但是由于有害代 謝產物的不斷積累，產物合成最終難免受到阻遏;連續發酵較分批發酵和補料分批發酵生 產強度大大提高，但容易遭受雜菌的污染，菌種易退化，設備投資較大，且發酵產物濃度較 低；半連續發酵過程中，通過放掉部分發酵液再補入新鮮培養基，不僅可以補充養分和前 體，而且代謝有害物被稀釋，從而有利于產物的繼續合成。
[0003] 半連續發酵工藝的應用可以起到緩解產物抑制和避免代謝副產物積累的作用，改 善了微生物的培養環境，有助于保持菌體活力的穩定，并且對于某些次級代謝產物，其最高 的生產速率僅在某些瞬態條件下才能達到。采用半連續發酵工藝不僅可以使這種瞬態條件 反復出現，而且還可以提高設備的利用率，因此半連續發酵工藝在次級代謝產物的生產方 面有著重要的應用。
[0004] 蟬花屬蟲生性藥用真菌，是我國傳統的一種名貴中藥，又名蟬茸，蟬蛹草，蟲花，是 由麥角菌科蟲草屬真菌蟬擬青霉寄生于蟬類若蟲形成的復合體，是我國傳統的中藥材之 一。蟬花與冬蟲夏草的無性型同屬，功效相近。兩者的菌株均為蟬擬青霉，且含有相近的化 學成分，目前在市場上流通的蟬花藥材基本上為無性型的蟬擬青霉藥材。
[0005] 現代醫學研究表明，蟬花所具有的活性物質和冬蟲夏草相當，其中腺苷和蟲草酸 的含量遠遠超于冬蟲夏草。實踐證明蟬花的藥用價值和保健價值主要可以歸納為增強機體 免疫調節功能、調節脂類代謝功能、抗腫瘤功能、解熱鎮痛功能、改善腎功能等。
[0006] 傳統蟬擬青霉液態發酵工藝多為間隙性的分批發酵工藝，而分批發酵工藝的人 力、物力消耗較大，每批發酵都需要進行裝料、滅菌、接種、放料、清洗等操作，工序繁瑣，非 發酵周期較長，生產效率較低;而后續的分離工藝傳統多用離心機進行分離，該方式因受制 于離心機分離因子影響，分離過程中菌絲體遭到剪切力破壞，部分有效成分流失到濾液中 導致產品質量和收率下降，分離所得濾液較渾濁，里面含有較多的碎菌絲，導致外排濾液 C0D偏高，該濾液若達到污水排放標準，需要經過復雜的污水處理，污水處理系統工作量太 大，給企業帶來了嚴重的經濟負擔。

【發明內容】

[0007] 本發明的目的是為了解決上述蟬擬青霉菌粉生產的不足，從而設計了一種快速深 層液態發酵生產蟬擬青霉菌粉的綠色新方法，該方法采用半連續發酵工藝既能減少了工藝 環節，縮短了非發酵時間，提高了設備利用率，降低了生產成本；同時又采用高效的陶瓷膜 過濾，提高菌絲體的收率，減少進入濾液的菌絲體，降低濾液的COD，降低污水處理量;又不 破壞細胞本身，保證胞內有效成分的全部回收。該發明不但能快速得到高品質的蟬擬青霉 的菌絲體，又提高了分離過程中菌絲體的收率，增加了經濟效益;又降低了廢水中C0D，減輕 了污水處理系統壓力，增加了社會效益。
[0008] 本發明目的主要是通過以下方式實現的：
[0009] -種快速深層液態發酵生產蟬擬青霉菌粉的方法，該方法按照下述步驟進行：
[0010] 1)蟬擬青霉半連續發酵液制備:將蟬擬青霉種子液接種到滅菌后的發酵培養基進 行深層液態發酵得到蟬擬青霉發酵培養液，所述的深層液態發酵接種量為體積含量的10~ 20%，通風比為1:0.1-1.(^￥111，罐壓0.02~0.051^^，在20~30°(：下發酵培養2-7天后，放出 培養器容積的10-50%的發酵液，補入同等滅菌后的發酵培養基，繼續發酵1-3天;如此不斷 放料、補料，操作周期為1-3天，得到蟬擬青霉發酵液;將蟬擬青霉種子液接種到滅菌后的發 酵培養基之前可以將蟬擬青霉菌株以常規方法活化后制備得到蟬擬青霉種子液；
[0011] 2)蟬擬青霉發酵液陶瓷膜過濾:將步驟2)中所得的蟬擬青霉發酵液通過微濾膜得 到微濾透析液和菌絲體，收集菌絲體；
[0012] 3)低溫真空烘干:將步驟2)中所得的菌絲體在真空度為-0.065~-0.095Mpa，65~ 85°C條件下進行干燥。
[0013] 所述的蟬擬青霉種子液是通過以下方法制備得到的：蟬擬青霉種子培養基組成為 葡萄糖1-3%、麩皮0.5-1.5%、蛋白胨0.5-1.5%、酵母粉0.1-1%、磷酸二氫鉀0.1-0.5%、 絲氨酸〇. 1-0.5 %、七水硫酸鎂0.1-0.5 %、豆油0.01-0.05 % ;調節pH值5.0-6.5;培養條件 為:通風比為1:0 · 1-1 · Ovvm，罐壓0 · 02~0 · 05Mpa，培養溫度25~30°C，培養周期2-6天；
[0014] 上述蟬擬青霉種子液優選通過以下方法制備得到的:將經活化搖瓶蟬擬青霉菌種 接入種子培養基，種子培養基組成為葡萄糖2 %、麩皮1 %、蛋白胨1.5 %、酵母粉0.5 %、絲 氨酸0.2 %、磷酸二氫鉀0.3 %、七水硫酸鎂0.2 %、豆油0.02 % ;調節pH值5.5。培養條件為： 通風比為1:0.5vvm，罐壓0.03Mpa，培養溫度26-28°C，培養5天。
[0015] 蟬擬青霉發酵培養基組成為葡萄糖1-3 %、麩皮0.5-1.5 %、蛋白胨0.5-1.5 %、酵 母粉0.1-1 %、磷酸二氫鉀0.1-0.5 %、絲氨酸0.1-0.5%、七水硫酸鎂0.1-0.5%、豆油0.01-0.05% ;調節pH值5.0-6.5;
[0016]上述微濾膜為陶瓷膜或有機膜，其孔徑在0.05~0.5μπι，操作溫度為50~60°C，工 作壓力:進壓為2~4bar，出壓為0~5bar。
[0017]優選步驟2)所述的微濾膜為陶瓷膜或有機膜，其孔徑在50nm，操作溫度為50~60 °C，工作壓力:進壓為3bar，出壓為lbar。
[0018] 本發明適用于任何蝴擬青霉菌種(Paecilomyces cicadae)，如保藏于云南大學微 生物資源中心，保藏號YUMCCc359等均可以使用。
[0019] 本發明所采用的蟬擬青霉菌株不限于某個具體生產廠家，市售均可使用。
[0020] 本發明為快速深層液態發酵生產蟬擬青霉菌粉提供了一種新的方法。該方法具有 以下幾個突出的優點：
[0021] 1、發酵周期短：傳統的分批發酵工藝，每批發酵都需要進行裝料、滅菌、接種、放 料、清洗等操作，工序繁瑣，非發酵周期長，而采用半連續發酵工藝減少了工藝環節，縮短了 非發酵時間和發酵時間，提高了設備利用率和發酵強度，降低了生產成本。
[0022] 2、提高收率:采用微濾膜孔徑0.05~0.5μπι，顯著提高了菌絲體得率。
[0023] 3、提高產品質量:傳統離心機分離過程中蟬擬青霉菌絲體遭到剪切力破壞，部分 有效成分流失到濾液中導致菌絲體有效成分降低，該工藝采用微濾膜過濾，操作過程中不 會產生剪切力，有效保證菌絲體有效成分。
[0024] 3、降低濾出液C0D，減輕環保壓力：傳統臥螺分離由于菌絲體截留率低，部分菌絲 體進入濾液，導致濾液中C0D含量增高，本方法分離因子高，對菌絲體截留率大大增加，濾液 澄清，濾液中菌絲體少，得到的透析液C0D大大降低，其C0D指標可以達到直接排放標準，僅 污水處理每天就為企業減少30噸處理量，大大降低了污水處理費用。
[0025] 4、清潔連續生產，能耗低:本發明方法可連續生產，膜及其配套設備使用壽命長， 裝置維護方便，投資少，操作過程無噪聲污染，易清潔。
【附圖說明】 圖1實施例1所述傳統工藝圖。
[0026] 以下通過具體實施例進一步說明本發明。但實施例的具體細節僅用于解釋本發 明，不應理解為對本發明總的技術方案的限定。
[0027] 實施例1
[0028] 1)蝴擬青霉菌(Paecilomyces cicadae)，保藏于云南大學微生物資源中心，保藏 號YUMCCc359。將培養好的蝴擬青霉菌株種子液種到種子培養基，接種量是10%，種子培養 基組成為葡萄糖2 %、麩皮1 %、蛋白胨1.5 %、酵母粉0.5 %、絲氨酸0.2%、磷酸二氫鉀 0.3 %、七水硫酸鎂0.2%、豆油0.02% ;調節pH值5.5。培養條件為:通風比為1:0.5vvm，罐壓 0.03Mpa，培養溫度26-28Γ，培養5天左右即可得到種子液。將培養好種子液接種到滅菌后 50L發酵培養基，按體積百分含量接種量