一種新型優質n-糖酰胺酶d的異源表達及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物工程領域，具體涉及一種新型優質N-糖酰胺酶D的異源表達，生化 特性優化及其應用。
【背景技術】
[0002] 糖組學研究是繼基因組學和蛋白質組學之后的一個新的生物學研究熱點，其中糖 蛋白質聚糖是糖組學研究的重中之重。N-糖酰胺酶(PNGase)是N-連接糖基化研究中主要的 工具酶，它能夠將N-糖鏈完整地從其所連接的蛋白分子上釋放下來，能夠最大程度的保持 糖鏈和蛋白結構的完整性，并在蛋白的糖基化位點上留下標記，為相關的后續研究提供最 大化的信息。因此N-糖酰胺酶被廣泛用于N-連接糖鏈結構信息的研究，糖鏈結構與功能關 系的研究，糖鏈對糖蛋白功能的影響以及蛋白質結構分析等方面。
[0003]目前應用最廣泛的商業化N-糖酰胺酶主要有兩種:分別是從甜杏仁提取的N-糖酰 胺酶A(PNGase A)和大腸桿菌表達的重組N-糖酰胺酶F(PNGase F)，其反應過程如下式所 示：
[0004]
[0005] 但是這兩種酶在使用中都有各自不可克服的缺點:PNGase F不能酶切來源于植物 或昆蟲等核心結構上含有α?，3_巖藻糖的糖蛋白；PNGase A作為一種糖蛋白，在高濃度條件 下，會發生一定程度的自身去糖基化作用，在糖鏈分析中可能有影響實驗結果的風險性，同 時PNGase A由于自身空間結構復雜，尚未有文獻報道可以使用E.coli等原核表達系統對其 進行重組表達。
[0006] 綜上所述，現有的PNGase F和PNGase A兩種酶各有優缺點，其并不能完全滿足糖 組學研究的需要，因此對N-糖酰胺酶進行進一步開發和研究十分有必要。

【發明內容】

[0007] 本發明的主要目的在于提供N-糖酰胺酶D在酶解糖蛋白上的N-鏈寡糖中的應用。
[0008] 本發明的另一目的在于提供一種優質的N-糖酰胺酶D，實現N-糖酰胺酶D的異源表 達，相比于現有的商業N-糖酰胺酶，N-糖酰胺酶D具有更好的實用性。
[0009] 本發明的另一目的在于提供一種N-糖酰胺酶D的制備方法。
[0010] 本發明的目的可以通過以下技術方案實現：
[0011] N-糖酰胺酶D在酶解糖蛋白上的N-鏈寡糖中的應用。所述糖蛋白的來源包括動物、 植物和微生物。
[0012] 上述N-糖酰胺酶D的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0013] 一種用于酶解糖蛋白上N-鏈寡糖的N-糖酰胺酶D，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所 不。
[0014] 用于表達上所述N-糖酰胺酶D的重組表達載體、轉基因細胞系和轉基因重組菌。 [0015]所述的重組表達載體，采用以下方法制備：將如SEQ ID N0.2所示N-糖酰胺酶D編 碼基因雙酶切后連接至PRSF載體的Nde I和Κρη I之間；得到大腸重組表達載體pRSF-DjPNGase〇
[0016] 所述的轉基因重組菌是將上述的重組表達載體導入大腸桿菌中，篩選得到表達N-糖酰胺酶D的轉基因重組菌;所述的大腸桿菌優選為大腸桿菌BL21(DE3)。
[0017] -種制備N-糖酰胺酶D的方法，培養含有N-糖酰胺酶D編碼基因的轉基因細胞系或 培養上述重組表達載體轉化的轉基因重組菌，誘導其表達，收獲表達產物，得到粗酶，然后 進行純化得到純酶形式的目的蛋白。
[0018] 上述的N-糖酰胺酶D在酶解核心結構上含有al，3-巖藻糖的糖蛋白中的應用。
[0019] -種酶解糖蛋白制備Ν-鏈寡糖的方法，是用上述的Ν-糖酰胺酶D將糖鏈從所連接 的蛋白質分子上釋放下來，得到游離態Ν-鏈寡糖。
[0020] -種制備去糖基化蛋白的方法，是用上述的Ν-糖酰胺酶D將糖鏈從所連接的蛋白 質分子上釋放下來，得到去糖基化蛋白。
[0021] 上述Ν-糖酰胺酶D的異源表達，為如SEQ ID Ν0.2所示Ν-糖酰胺酶D的編碼基因在 大腸桿菌中異源可溶性表達。
[0022] 上述的N-糖酰胺酶D在酶解多種標準糖蛋白上的N-鏈寡糖中的應用。所述標準糖 蛋白為核糖核酸酶(RNaseB)、乳鐵蛋白（Lactoferrin)和辣根過氧化物酶(HRP)。
[0023] 本發明涉及從一種粳稻(Dyella japonica)中克隆的N-糖酰胺酶D基因。所述編碼 序列如SEQ N0.2所示。本發明還涉及包含所述N-糖酰胺酶D編碼序列的重組表達載體，N-糖 酰胺酶D編碼基因的核苷酸序列雙酶切后連接至pRSF載體的Nde I和Κρη I之間；得到大腸 重組表達載體pRSF-DjPNGase。本發明還制備包含Ν-糖酰胺酶D編碼基因的轉基因重組菌， 將重組好的表達載體pRSF-DjPNGase轉化到大腸桿菌BL21(DE3)，構成表達pRSF-DjPNGase 的轉基因重組菌。
[0024]將轉基因重組菌通過正常的振蕩培養，用IPTG誘導大腸桿菌表達目的蛋白，通過 超聲裂解細胞，收獲表達產物，表達產物利用Ni-NTA瓊脂糖凝膠進行親和純化。對得到的純 化形式的N-糖酰胺酶D的活性使用不同類型標準糖蛋白：核糖核酸酶(RNaseB)、乳鐵蛋白 (1^(：1:〇1^1'1'；[11)和辣根過氧化物酶(!11^)進行測試。
[0025]本發明還將N-糖酰胺酶D運用到釋放多種植物糖蛋白N-鏈寡糖中，利用酸沉淀植 物蛋白后加入N-糖酰胺酶D，得到多種不同類型的N-鏈寡糖，其結果如圖1所示。
[0026]本發明通過利用已經非常成熟的基因工程技術，通過基因搜索，克隆，重組表達和 生化特性研究等獲得了一種新型優質N-糖酰胺酶D。其能作用于糖蛋白和糖肽，并最大限度 酶切不同類型的N-糖鏈結構，無自身糖基化污染，兼具了PNGase F和PNGase A兩者優點的 同時摒棄了它們的缺點。本發明的酶具有酶切含有1，3-核心巖藻糖的結構，PNGase F卻不 能。本發明的酶可以在大腸桿菌中表達，不是糖蛋白，PNGase A卻不能。
[0027]本發明的有益效果：
[0028]本技術方案可以通過生物工程技術得到一種優質的N-糖酰胺酶D，其兼具了 PNGase F和PNGase A兩者優點的同時摒棄了它們的缺點，將為植物、昆蟲糖組學N-糖鏈研 究提供更經濟實用的新工具，也為動物細菌等生物的糖組學研究提供更多的選擇。
【附圖說明】
[0029] 圖1為N-糖酰胺酶D酶切植物糖蛋白所得N-鏈寡糖結構圖及N-鏈寡糖色譜圖
[0030] 圖2為N-糖酰胺酶D的Western blot圖 [0031 ]圖3為N-糖酰胺酶D底物特異性分析
【具體實施方式】
[0032]結合以下具體實施例，對本發明作進一步詳細說明，本發明的保護內容不局限于 以下實例。
[0033] 實驗材料和試劑
[0034] 1、菌株和載體：
[0035] 常規菌種Dyella japonica購自德國微生物菌種保藏中心（DSMZ)，保藏號：DSM_ 16301。大腸桿菌ToplO、BL21 (DE3)級表達載體pRSF購自Novagen公司。
[0036] 2、酶類及其他生化試劑：
[0037] 限制性內切酶、DNA Marker、Protein Marker購自TaKaRa公司；AxyPrep質粒提取 試劑盒為Axygen公司產品。其他常規試劑為上海生工或南京壽德公司。
[0038] 3、本發明中所使用的生物化學技術均為本領域中的常規技術：
[0039] 在以下實施例中，除非特殊說明，所有實驗操作均按照以下實驗手冊或文獻中的 部分進行，包括：[美]J.沙姆布魯克等，分子克隆實驗指南;趙永芳等，生物化學技術原理及 其應用（第二版）；朱檢等，生物化學實驗[M]，本發明中所有相關的酶或酶活性均指N-糖酰 胺酶D。
[0040] 實施例1N-糖酰胺酶D基因的獲得
[0041 ]將N-糖酰胺酶D基因 （SEQ ID N0.2)送至南京金斯瑞公司進行合成。具體方法為采 用基于PAS(PCR_based Accurate Synthesis)的方法合成N-糖酰胺酶D的基因，設計全長拼 接引物，在引物的兩端各設計了保護性堿基，通過克隆位點Nde I和Κρη I連入表達載體