檢測葫蘆科種子攜帶黃瓜綠斑駁花葉病毒的樣品制備方法及用圖
【技術領域】
[0001] 本發明所屬領域為生物技術領域，涉及一種攜帶黃瓜綠斑駁花葉病毒的萌蘆科種 子樣品的處理，以及血清學和分子生物學檢測方法及應用。
【背景技術】
[0002] 黃瓜綠斑駁花葉病毒（Cucumber green mottle mosaic virus，CGMMV)于 1935 年 在英國首次報道，隨著萌蘆科作物在各國間的交流引種日益頻繁，隨后歐洲的德國、芬蘭、 丹麥、俄羅斯、希臘等多個國家和地區相繼報道出現該病毒的危害。
[0003] 黃瓜綠斑駁花葉病毒是蕪菁花葉病毒科（Tymoviridae)煙草花葉病毒屬 (Tobamovirus)的成員。主要侵染萌蘆科作物，可引起萌蘆、黃瓜、西瓜、南瓜等葉片黃化 畸形，生長緩慢，結果延時，果實大部分黃化變白并產生黑綠色水疤狀的壞死斑，產量下 降。CGMMV是世界上許多國家和地區萌蘆科作物上的重要檢疫性病毒，在一些地區已造成大 田瓜類作物的毀滅性損失，嚴重威脅萌蘆科作物安全生產。近年來，在我國一些地區出現 進口源性的黃瓜綠斑駁花葉病毒，引起農業部、質檢總局等相關部門的高度重視。2002年 我國口岸檢疫部門曾從日本引進的種苗中截獲到該病毒，目前該病毒主要分布在我國的河 北新樂、甘肅酒泉、北京平谷、遼寧蓋州以及廣西等部分地區。2006年12月21日，農業部 發布788號公告，將黃瓜綠斑駁花葉病毒確定為全國農業植物檢疫性有害生物。
[0004] CGMMV寄主范圍比較窄，自然侵染寄主主要是萌蘆科作物，通過人工汁液摩擦接 種可侵染蔓陀羅、莧色藜、昆諾藜、珊西煙、三生煙及矮牽牛。CGMMV是一種RNA病毒，典型 的種傳病毒，帶毒種子是該病毒遠距離傳播的主要侵染源。病毒粒子附于種子的表皮和內 種皮上，種植后形成初侵染源。種傳寄主有黃瓜、西瓜、甜瓜和瓠瓜等，新鮮黃瓜種子傳毒率 為8% ;西瓜種子傳毒率為1 %~5%，其中外表皮帶毒量是內表皮或胚乳的20倍；甜瓜種 傳毒率為10%~52%;瓠瓜種子帶毒率高達84%。此外，CGMMV也可通過病株的汁液接觸、 授粉和人工嫁接等方式傳播。
[0005] 種子帶毒是黃瓜綠斑駁花葉病毒遠距離傳播的主要途徑，一旦田間出現種子帶 毒的病苗，便會以此為初侵染源，通過非介體因素傳播開來，造成嚴重損失。此外，萌蘆 是我國很多西瓜產區用于嫁接防治枯萎病的主要砧木，萌蘆種子帶毒很容易通過嫁接傳 染接穗西瓜苗，從而擴散到大田引起嚴重的后果。
[0006] 建立健全的種子病毒檢測方法，對種傳傳播為主的CGMMV快速、準確、高靈敏度的 鑒定及檢疫檢測，加強進境萌蘆科種子的檢驗檢疫工作，以及防止該病毒的傳入具有十分 重要的意義，也對從源頭上控制該病毒的擴散蔓延有重要指導意義。
[0007] CGMMV早期的檢測方法主要依靠生物學鑒定和電鏡觀察，隨著分子生物學的發展， 該病毒的檢測技術逐漸從傳統的檢測方法向基于核酸的檢測技術發展。目前對CGMMV的檢 測方法有：生物學方法、電子顯微鏡技術、血清學技術、分子生物學技術等。其中比較常用的 檢測方法是血清學和分子生物學檢測。
[0008] 生物學鑒定方法雖然簡單易行，但所需時間長，工作量大，且僅靠肉眼觀察，穩定 性和可信性不高。
[0009] 利用電子顯微鏡技術可觀察受侵染細胞的結構變化以及病毒粒體的大小和形態。 由于電子顯微技術檢測需要很高的硬件要求，非專業人員難以完成，因而該方法只適合于 輔助鑒定。
[0010] 分子生物學技術是從病毒核酸水平來檢測病毒，常用的分子生物學技術主要是 RT-PCR檢測，RT-PCR技術快速、簡便、靈敏度高、特異性強且所需樣品少。但是由于帶毒萌 蘆科種子本身脂肪含量過高所以難于提取高質量的RNA或CGMMV的病毒含量太低不足以產 生足夠的模板，所以使用常規的液氮研磨方法提取帶毒的萌蘆科種子的RNA，并用RT-PCR 方法進行檢測，往往不能擴增到目的條帶。所以本發明對帶毒的萌蘆科種子樣品進行處理 能夠提高病毒模板的濃度。
[0011] 血清學方法是利用專化性抗血清來檢測該病毒，具有靈敏度高、特異性強、操作 簡單等優點，可檢測1~10ng/mL病毒.血清學檢測方法有許多形式，目前也常用ELISA 檢測技術來檢測萌蘆科種子的帶毒情況。
[0012] 防止CGMMV通過種子貿易和遠距離調運而擴散是控制該病毒傳入的前提，加強萌 蘆科作物種子的檢測，是防止該病害從種子源頭擴散流行的關鍵。從源頭控制該病害的蔓 延，對保護西瓜、甜瓜產業的安全生產具有重要意義。

【發明內容】

[0013] 本發明的目的是克服現有技術的不足，提供檢測萌蘆科種子攜帶黃瓜綠斑駁花葉 病毒的樣品制備方法及其應用。
[0014] 一種檢測萌蘆科種子攜帶黃瓜綠斑駁花葉病毒的樣品制備方法，包括如下步驟：
[0015] 1)種子樣品種仁和種殼的分離：將每顆萌蘆科種子用眼科剪刀沿側面剖開，剝除 種仁部分，收集剩余的種殼；
[0016] 2)樣品的研磨：以1粒種子分離的種殼作為1個樣品放入已放3-5顆直徑 2. 5mm實心鋼珠的I. 5-2ml印pendorf離心管中，蓋上離心管蓋子，在離心管上做好標記 后將其丟入液氮中冷凍處理1分鐘后撈出，然后放入上海凈信實業發展有限公司貨號為 TissueIyser-48的全自動樣品快速研磨儀中以頻率60HZ研磨60秒，使樣品呈粉末狀，如果 樣品沒有呈粉末狀可重復研磨一次；
[0017] 3)該步驟包括黃瓜綠斑駁花葉病毒的粗提取或黃瓜綠斑駁花葉病毒RNA的提取 兩種處理：
[0018] 黃瓜綠斑駁花葉病毒的粗提取步驟為：研磨好的樣品中加入0.1 -Iml ρΗ7· 40. 01mol/L PBS 磷酸鹽緩沖液，在 Scientific Industries 公司的 VortexGenie2 禍旋 混合器上混勻0. 5-5分鐘，然后5000rpm離心3分鐘后取上清液作為黃瓜綠斑駁花葉病毒 的粗提取液進行血清學方法檢測黃瓜綠斑駁花葉病毒；
[0019] 或黃瓜綠斑駁花葉病毒RNA的提取步驟為：研磨好的樣品中加入lmlTRIzol試劑 后用常規TRIzoI試劑法提取病毒RNA，提取的病毒RNA用于黃瓜綠斑駁花葉病毒的分子檢 測。
[0020] 在上述樣品制備方法基礎上，本發明還公開了一種使用該方法制備的樣品的用 途，具體為將該方法制備的黃瓜綠斑駁花葉病毒的粗提取液和RNA分別用于萌蘆科種子中 黃瓜綠斑駁花葉病毒的血清學和分子方法檢測。
[0021] 所述的血清學方法包括 dot-ELISA、ACP-ELISA、DAS-ELISA 和 TAS-ELISA。
[0022] 所述的dot-ELISA血清學檢測方法，包括如下步驟：
[0023] 1)吸取權利要求書1中獲得黃瓜綠斑駁花葉病毒的粗提取液2. 5 μ 1，點樣于硝酸 纖維素膜，并設置陽性陰性對照，室溫靜置晾干10分鐘；
[0024] 2)硝酸纖維素膜浸入到含5%脫脂奶粉的PBST封閉液中37°C封閉30分鐘；
[0025] 3)上述硝酸纖維素膜放入含1:5000倍稀釋的抗黃瓜綠斑駁花葉病毒鼠單抗中， 37°C孵育1-2小時；
[0026] 4)硝酸纖維素膜用PBST緩沖液搖動洗滌3次，每次3-5分鐘；
[0027] 5)硝酸纖維素膜放入含1:8000倍稀釋的Sigma公司貨號為A3562的堿性磷酸酶 標記的羊抗鼠 IgG二抗中，37°C孵育1-2小時；
[0028] 6)硝酸纖維素膜用PBST緩沖液搖動洗滌4次，再用PBS洗1次，每次3-5分鐘；
[0029] 7)在IOml的顯色緩沖液中加入Promega公司貨號為S3771的BCIP 33ul，NBT 66ul，將其混勻，硝酸纖維素膜晾干后浸入其中室溫避光顯色5-15分鐘；
[0030] 8)待陽性樣品呈現紫色而陰性對照未顯色時，再將顯色完全的硝酸纖維素膜移至 去離子水中漂洗終止顯色反應，記錄結果。
[0031 ] 所述的分子方法檢測包括RT-PCR和定量RT-PCR。
[0032] 所述的RT-PCR檢測