一種人類糞便甲基化dna的pcr檢測引物體系的制作方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于分子生物學領域，涉及醫學和分子生物學技術，即人類糞便甲基化DNA的PCR檢測引物體系。
【背景技術】
[0002]DNA甲基化是指DNA鏈上CpG位點的胞嘧啶(C)殘基的5’碳上被修飾了一個甲基。DNA甲基化是最早發現的DNA修飾之一，是表觀遺傳學的重要組成部分。DNA甲基化特征性地發生在DNA鏈上的CpG 二核苷酸的胞嘧啶(C)殘基上，這常見于基因5’端表達調控序列。DNA甲基化在基因表達的調控中具有重要作用，參與了動物胚胎發育、基因印記和X染色體失活等過程。研究表明，DNA甲基化的改變能引起染色質結構、DNA構象、DNA穩定性及蛋白質互相作用方式的改變，從而控制基因表達。
[0003]人類異常的DNA甲基化多發生在基因的轉錄調控區，引起相應基因轉錄的關閉，使基因喪失功能。多種癌癥的發生與DNA異常甲基化有關，通過對DNA甲基化的檢測，可以提供體內是否存在癌細胞的信息。一般的，糞便中甲基化DNA的存在，可能與大腸癌的發生有關。目前已發現許多個與大腸癌發生有關的甲基化基因。這些甲基化基因的改變，發生在細胞癌變的早期，其中一些基因的甲基化只發生在癌變的細胞，因而可用于檢測癌癥的基因標志。對糞便中這些甲基化基因的檢測，將有助于發現大腸癌的早期信號。

【發明內容】

[0004]為了克服現有技術的不足，本發明旨在提供一種人類糞便甲基化DNA的PCR檢測引物體系，該引物體系及用該引物體系進行的鑒定方法可快速準確的檢測人類糞便的DNA
是否發生變化。
[0005]為了解決上述問題，本發明提供的一種人類糞便甲基化DNA的PCR檢測引物體系采用了如下的技術方案:
一種人類糞便甲基化DNA的PCR檢測引物體系，其特征在于:所述的引物體系由以下12個甲基化DNA的PCR擴增引物對組成:
(1)SNCA基因引物對1:
正向引物:5 ’ -TGCGGGTTGTAGCGTAGATTTCG-3 ’
反向引物:5’ -CCGCTATAAACCGACGACGC-3’ ；
(2)SPG20基因引物對I1:
正向引物:5 ’ -TGACGCGAAGCGTTCGAGAG-3 ’
反向引物:5’ -ACGCTCGCCGAAAACCGATC-3’ ；
(3)ADAMTSI基因引物對II1:
正向引物:5 ’ -AGGATCGTTCGGTTGTTCGGT-3 ’
反向引物:5’ -AAACGCTCTAAAACGCCTCCG-3’ ；
(4)SFRP5基因引物對IV:正向引物:5 ’ -GCGTACGGCGAGGTTCGGGT-3 ’
反向引物:5’ -CTCGATACCCGACGACCCAAAT-3’ ；
(5)SLC5A8基因引物對V:
正向引物:5 ’ -TAGCGGGTCGATTTTTCGAGG-3 ’
反向引物:5’ -CTAACGCGCAAACGTAACGTC-3’ ；
(6)IGFBP3基因引物對VI:
正向引物:5’ -GTTTTCGTAGTCGTGTTTGCGT-3’
反向引物:5’ -ACTCGCATCTAAACGACCCGA-3’ ；
(7)GALR2基因引物對VII:
正向引物:5 ’ -GATTTCGGATTTTGCGTGTGCG-3 ’
反向引物:5’ -CTCGACGATCCCGAAATATCC-3’ ；
(8)SLC16A12基因引物對VID:
正向引物:5 ’ -AGTTTTCGGCGGAGTTGGCG-3 ’
反向引物:5’ -CGAACTAAACGAAAACGCCGAC-3’ ；
(9)SP0CK2基因引物對IX:
正向引物:5 ’ -TGCGGATTTACGTTTCGGAAGCG-3 ’
反向引物:5’ -TAACCGCGACAACCCTAACCGA-3’ ；
(10)TLX2基因引物對X:
正向引物:5 ’ -TGTATTCGGAGTAGTCGCGTTCG-3 ’
反向引物:5’ -ACCCGAACCGATCCGTCAATCA-3’ ；
(11)HLTF基因引物對XI:
正向引物:5 ’ -GTTTTTGATTCGGCGTTCGGAA-3 ’
反向引物:5’ -TCCAAACCGTTAAACCGAACGC-3’ ；
(12)HPPl基因引物對XII:
正向引物:5 ’ -GTTTTTCGCGTTTTCGGCGTAG-3 ’
反向引物:5 ’ -AACATCCCGCGAACGACGAC-3 ’。
[0006]優選的，所述的每條引物序列中包含2-3個CpG位點。
[0007]優選的，所述的引物體系的基因的每個引物序列的長度，呈梯度分布。
[0008]優選的，所述的每條引物PCR擴增產物的變性溫度在82-84°C。
[0009]優選的，提供了一種人類糞便甲基化DNA的PCR檢測試劑盒，其特征在于:包括一組甲基化DNA的PCR擴增引物和相應的PCR擴增體系。
[0010]本發明的有益效果在于:本發明設計獨特的甲基化基因PCR擴增引物，克服目前的甲基化基因檢測技術靈敏度不夠高、檢測穩定性差缺點，提供一種人類糞便甲基化DNA的PCR檢測引物體系，該引物體系及用該引物體系進行的鑒定方法可快速準確的檢測人類糞便的DNA是否發生變化。本發明在甲基化DNA特異性多重PCR擴增技術的基礎上，通過對引物序列的選擇，使設計的引物不僅保證PCR產物的長度呈梯度分布；各？0?產物的退火溫度保持接近，實現多重PCR條件下的非甲基化DNA的PCR產物在特定溫度下的部分變性，從而可以被單鏈DNA特異性外切核酸酶消化移除，使甲基化DNA的檢測靈敏度得到提高；通過使用毛細管電泳檢測PCR產物，有效提高甲基化DNA檢測的穩定性和重復性；多重PCR —次性檢測多個甲基化基因，提高檢測效率；本試劑盒包括一組甲基化DNA的PCR擴增引物和相應的PCR擴增體系。由于人糞便DNA含有大量人類腸道細菌DNA，一般的PCR擴增體系不能滿足人源性DNA的PCR擴增的條件需要，所以本試劑盒的檢測體系是為檢測人糞便甲基化DNA所優化的。
【附圖說明】
[0011 ] 圖1大腸癌患者糞便中甲基化DNA檢測實例。
【具體實施方式】
[0012]為了更清楚的理解本發明提供的技術方案，下面結合具體的實施例對技術方案做進一步的說明。
實施例
[0013]近年來的研究發現，細胞癌變與基因的異常甲基化改變有關，通過對樣品中甲基化基因的檢測，可以提示相應樣品中癌細胞的存在。對甲基化基因的檢測，通常是用重亞硫酸鹽處理樣品DNA，將DNA鏈上所有不發生甲基化的C堿基轉變為U，而一般DNA聚合酶識別U為T。根據重亞硫酸鹽處理過的DNA序列，可以設計甲基化DNA特異的PCR擴增引物。本發明設計獨特的甲基化基因PCR擴增引物，克服目前的甲基化基因檢測技術靈敏度不夠高、檢測穩定性差缺點，提供一種人類糞便甲基化基因檢測新方法和相應的試劑盒。
[0014]本發明旨在提供一種人類糞便甲基化DNA的PCR檢測引物體系，該引物體系及用該引物體系進行的鑒定方法可快速準確的檢測人類糞便的DNA是否發生變化。甲基化基因PCR擴增引物的設計，是根據相應基因的序列，經重亞硫酸鈉處理轉化后的DNA序列。
[0015]本發明的技術方案具體方案如下:
篩選出一組12個基因，根據目標檢測區域甲基化DNA經重亞硫酸鹽處理轉化后是的序列，設計PCR引物。使每條引物序列中包含2-3個CpG位點，以提高引物對甲基化DNA的偏向性擴增；使這一組基因的每個PCR擴增產物的長度，呈梯度分布；使每個PCR擴增產物的變性溫度在82-84度。各個基因啟動子區域的甲基化DNA擴增PCR引物序列如下:
(1)SNCA基因引物對1:
正向引物:5 ’ -TGCGGGTTGTAGCGTAGATTTCG-3 ’
反向引物:5’ -CCGCTATAAACCGACGACGC-3’ ；
(2)SPG20基因引物對I1:
正向引物:5 ’ -TGACGCGAAGCGTTCGAGAG-3 ’
反向引物:5’ -ACGCTCGCCGAAAACCGATC-3’ ；
(3)ADAMTSI基因引物對II1:
正向引物:5 ’ -AGGATCGTTCGGTTGTTCGGT-3 ’
反向引物:5’ -AAACGCTCTAAAACGCCTCCG-3’ ；