湖泊藻類中有機磷提取及組成分析方法

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湖泊藻類中有機磷提取及組成分析方法
【專利摘要】本發明公開了一種湖泊藻類中有機磷提取方法，包括樣品采集、磷的基本組成測定、有機磷(Po)的提取、樣品測試預處理、液態磷核磁(31P?NMR)分析和計算步驟。本發明采用0.5mol/L NaOH+25mmol/L EDTA提取劑，藻類粉末樣品與提取劑的固液比為1：60獲得最優的Po提取效果；31P?NMR分析測試過程中，設置延遲時間(D1)為5s，掃描分析時間為15h可獲得較好的譜圖。本發明的藻類Po提取方法，總磷(TP)和Po的平均提取率分別在95.0％和94.9％以上，能準確檢測出樣品中Po的具體種類及含量，真實準確的反映湖泊中藻類Po的組成結構特征。為研究湖泊藻類在水華暴發過程中所做的貢獻以及湖泊內源磷循環過程及其對政府決策具有重要科學依據。
【專利說明】
湖泊藻類中有機磷提取及組成分析方法
技術領域
[0001] 本發明涉及一種有機磷的提取及組成分析方法，特別是一種湖泊藻類中有機磷提取及組成分析方法。
【背景技術】
[0002] 磷作為淡水湖泊生態系統新陳代謝作用中關鍵的元素之一，過量的磷導致藻類大量生長繁殖，引起水質惡化并危害生態系統安全。外源輸入和內源循環是導致湖泊水體磷大幅度增加的主要因素。近年來，包括生活污水、工農業生產、土壤徑流等過程攜帶的外源磷輸入得到了一定的控制，湖泊內源磷的釋放成為引起湖泊水質進一步惡化的關鍵因素。沉積物釋放是湖泊內源磷污染重要的來源之一，但富營養化湖泊中廣泛存在著由于水華暴發產生的藻類，其死亡腐爛分解后的產物可能是湖泊內源磷另一個重要的來源。例如，在藻類暴發期間，太湖北部(如梅梁灣)水體表面將會覆蓋著大量藻類，且藻類暴發后，產生藻毒素危害生態系統健康，引起一系列環境問題。這些藻類死亡腐爛分解后，又會對水體造成二次污染，其中磷的釋放率遠高于碳和氮，半個月內磷的釋放量就可高達70%。因此，針對湖泊藻類來源磷的研究十分重要。有機磷(Organic Phosphorus，P。)是藻類中磷的重要組成部分。另外，已有研究表明P。在水生生態系統的磷循環中扮演重要角色，一些P。組分可通過酶水解轉化為生物可利用性活性磷酸鹽，進而成為富營養化湖泊藍藻水華持續暴發的重要磷源。
[0003] 目前，由于分析測試方法的限制，對湖泊藻類中P。化學結構和形態等的研究還十分有限，多數研究一般僅限于P。總量的分析。目前，關于P。的測試分析其組成結構和特征方面的研究主要集中于土壤、沉積物及腐殖質等物質的研究。如文獻CN102353567A公開了一種采用泡沫分離裝置進行底泥中P。的分離和富集的方法。該方法包括以下步驟：（1)底泥樣品采集；（2)泥樣的冷凍干燥；（3)底泥中P。的萃取；（4)去除混合溶液中的雜質；（5)濾液pH 調節；（6)濾液中P。的泡沫分離；（7)對泡沫分離收集的P。溶液再次進行真空冷凍干燥。該發明相比傳統方法，泡沫分離方法，富集P。的能力更強，用于底泥P。核磁共振分析的樣品中P。含量更高，且泡沫分離方法富集的P。檢測到了一個磷酸二脂信號峰，而傳統方法檢測不到，且測定所需時間縮短到傳統方法的2/3。文獻CN10558242A公開了一種水體中顆粒態P。的提取方法，其特征在于，包括以下步驟:采樣、過濾、凍干、研磨、H)TA-Na 2S204混合溶液中提取無機磷、NaOH溶液中提取P。的步驟；同時還公開了基于該提取方法的核磁共振測定方法。該發明的有益之處在于:能夠檢測出樣品中具體P。的種類;通過現場過濾，減少了樣品運輸過程中P。形態的變化;分析需求的樣品量少，減少了現場過濾的工作量;分析提取步驟少，不僅減少了提取過程中的磷損失，而且節省了分析樣品的時間；利用相對回收率計算后發現，該發明的測定方法其分析測試的精度較高。上述文獻主要公開了水體中底泥或顆粒態中P。的提取過程，且P。的提取效率不高，這對準確理解水生態系統的生物地球化學循環具有一定的影響。

【發明內容】

[0004] 本發明的目的在于提供一種湖泊藻類中有機磷提取及組成分析方法，優化其有機磷的提取方法和31p-nmr測定過程中的參數設置，并分析藻類中磷的組成結構特征。
[0005] 本發明的技術方案如下：
[0006] -種湖泊藻類中有機磷提取方法，包括以下步驟：
[0007] (1)樣品采集:采集富營養化湖泊水體表層漂浮藻類，裝入密封袋冷藏保存，運回實驗室進行冷凍干燥，冷干后充分研磨，過2_篩，得到藻類粉末樣品，-20°c冷凍保存備用；
[0008] (2)磷的基本組成測定:取藻類粉末樣品兩份，一份于馬弗爐中煅燒，樣品降至室溫后加入HC1振蕩，離心分離后分析其中磷濃度，即總磷TP含量;另一份樣品置于離心管中，加入HC1振蕩，離心后測定磷濃度，即無機磷Pi含量;藻類中有機磷P。的含量由1?和? 1相減得到；
[0009] (3)P。的提取:取藻類粉末樣品加入提取劑，室溫下振蕩、離心后，留取上清液，冷凍干燥形成粉末樣品，冷凍保存備用；
[0010] ⑷樣品測試預處理:將步驟⑶得到的粉末樣品用NaOH溶解，離心，加入D20鎖定信號；
[0011] (5)3中-匪1?分析:采用81?1]1^財示準腔5111111880探頭， 3中的共振頻率為161.98他，測定溫度為20°C，譜峰寬度為5Hz，獲取時間AQ為0.2102s;
[0012] (6)計算:通過步驟(5)中得到的波譜進行積分及對各磷組分進行定性分析，并根據步驟(2)得到的TP含量計算藻類中各磷組分的含量。
[0013]優選的，所述TP的測定為:準確稱取0.5g藻類粉末樣品一份，3個平行樣，于馬弗爐中450°C煅燒3h，降至室溫后轉移至離心管中，加入20mL3.5mol/L HC1振蕩16h，離心分離后，上清液用〇.45wii濾膜過濾得提取液，利用5%過硫酸鉀121°C消解30min，分析其中磷濃度，g卩TP含量。
[0014]優選的，所述Pi的測定為:準確稱取0.5g藻類粉末樣品一份，3個平行樣，置于離心管中，加入20mLlmol/L HC1振蕩提取16h，離心分離后，上清液用0.45mi濾膜過濾得提取液，測定磷濃度，即Pi含量。
[0015]優選的，所述了?和?1采用磷鉬藍法進行測定。
[0016]優選的，所述(3)P。的提取為:取藻類粉末樣品0.5g加入提取劑，室溫下振蕩提取 16h，4°C條件下，8000 X g離心30min后留取上清液，冷凍干燥形成粉末樣品，冷凍保存備用。 [0017] 優選的，所述步驟（4)中NaOH為0.6mL 10mol/LNa0H;所述離心為8000 X g離心 151^11;所述〇2〇為0.21111。
[0018] 優選的，所述藻類為微囊藻、小球藻和螺旋藻。
[0019] 優選的，所述步驟（3)中，提取劑為（0.1，0.25,0.5)111〇1/1他011+(0，10,25,50)111 mol/L EDTA相互組合。提取劑的選擇對于在不破壞樣品結構的前提下最大程度的提取藻類中的P。十分重要。不同樣品研究中采用的提取劑或提取劑組合也存在差異。
[0020] 優選的，所述提取劑為0.5mol/L Na0H+25m mol/LEDTA。
[0021]優選的，所述步驟(3)中，藻類粉末樣品與提取劑的固液比為1:30或1:60。固液比的選擇對于提取藻類中的P。組分及提取效果十分重要。不同樣品研究中所采用的固液比也存在差異。
[0022]優選的，所述步驟(3)中，藻類粉末樣品與提取劑的固液比為1:60。
[0023] 優選的，所述步驟(5)中，31P_NMR參數中延遲時間0:的設置為2s、5s或15s，分析測試時間為12_15h。樣品31P-NMR分析過程中參數設置，如延遲時間D1、分析測試時間等對于譜圖分辨率以及樣品中各磷的組分的的定性和定量十分重要。不同樣品研究中所采用的參數也存在差異。
[0024]優選的，所述步驟(5)中，31P_匪R參數中延遲時間設置為5s，分析測試時間為 15h〇
[0025]分析得到，藻類中磷由正磷酸鹽、單酯磷、二酯磷以及焦磷酸鹽組成，P。占TP的 31.27%~72.96%，單酯磷為藻類中P。重要組分，其平均含量占P。的83%。
[0026] 本發明應用不同的提取劑和固液比提取湖泊藻類中P。，并進一步采用液態核磁共振
[0027] (31P-NMR)技術分析其組成特征。在采用0.5mol/L Na0H+25m mol/LEDTA提取劑，并控制藻類粉末樣品與提取劑的固液比為1:60可獲得最優的P。提取效果;31P-NMR分析測試過程中，設置延遲時間DiS5 S，掃描分析時間為15h可獲得較好的譜圖，出峰效果好。本發明的藻類P。的提取方法，TP和P。的平均提取率分別在95.0%和94.9%以上，能準確檢測出樣品中 P。的具體種類和含量，準確的反映湖泊藻類P。的組成結構特征。為研究湖泊藻類在水華爆發過程中所做的貢獻以及湖泊內源磷循環過程及其對政府決策具有重要科學依據
【附圖說明】
[0028]圖1.實施例1-12磷組分的提取率(A-L依次代表實施例1-12)。
[0029] 圖2.本發明的提取方法對藻類磷提取的31P_NMR圖譜。
[0030] 圖3.湖泊藻類磷組分不同延遲時間的液態31P-NMR圖譜。
【具體實施方式】
[0031] 湖泊藻類有機磷提取方法，包括以下步驟：
[0032] (1)樣品采集:采集富營養化湖泊水體表層漂浮藻類，裝入密封袋冷藏保存，運回實驗室進行冷凍干燥，冷干后充分研磨，過2_篩，得到藻類粉末樣品，-20°C冷凍保存備用； [0033] (2)磷的基本組成測定:總磷TP、無機磷Pi和P。的測定，
[0034]準確稱取0.5g藻類粉末樣品兩份，每份3個平行樣，一份于馬弗爐中450°C煅燒3h，降至室溫后轉移至離心管中，加入20mL3.5mol/L HC1振蕩16h，離心分離后，上清液用0.45y m濾膜過濾得提取液，利用5%過硫酸鉀121°C消解30min，分析其中磷濃度，即TP含量；
[0035]另一份樣品置于離心管中，加入20mLlmol/L HC1振蕩提取16h，離心分離后，上清液用0.45mi濾膜過濾得提取液，測定磷濃度，SPPi含量；
[0036]由TP和Pi相減獲得藻類P。含量；
[0037] 采用磷鉬藍法在Agilent8453紫外分光光度計上測定TP和Pi;
[0038] (3)P。的提取:取藻類粉末樣品0.5g加入提取劑，室溫下振蕩提取16h，4°C條件下， 8000 X g離心30min后留取上清液，冷凍干燥形成粉末樣品，冷凍保存備用；
[0039] (4)樣品測試預處理:將步驟(3)得到的粉末樣品用0.6mL 10m〇l/LNa0H重新溶解，以8000 X g離心15min，加入0 ? 2mL D20鎖定信號；
[0040] (5)31P-NMR分析:采用BRUKER標準腔5mm BB0探頭，31P的共振頻率為161.98Hz，測定溫度為20°C，譜峰寬度為5Hz，AQ為0.2102s;
[0041] (6)計算:通過步驟(5)中得到的波譜進行積分及對各磷組分進行定性分析，并根據步驟(2)得到的TP含量計算藻類中各磷組分的含量。
[0042] 提取劑組成和提取比例對P。提取率的影響的研究。表1列出實施例1-12的所采用的提取劑和提取比例，按上述步驟進行實驗。其中， 31P_NMR參數中延遲時間0:的設置為5s，分析測試時間為15h。表2為實施例11藻類中TP和P。的提取率。表3為實施例11藻類中各個磷組分的含量及占TP的百分比。
[0043] 表1實施例1-12所采用的提取劑和提取比例
[0045]表2.實施例11藻類中磷的提取率
[0047] 如圖1所示，實施例1-3采用1:30提取比例，提取劑分別為0.25，0.5mol/L NaOH，藻類中TP和P。提取率高于提取劑為O.lmol/L NaOH時藻類中TP和P。的提取率，表明采用 0.25mol/L和0.5mol/L NaOH作為提取劑，更有利于藻類中TP和P。的提取。
[0048] 實施例4-6采用1:60提取比例，提取劑分別為0.1，0.25，0.5mol/L NaOH，則TP提取率分別高于1:30提取比例下的TP提取率，P。提取率也分別高于于1:30提取比例下的P。提取率。尤其，實施例5-6的TP提取率明顯高于實施例2-3的TP提取率，實施例5-6的P。提取率明顯高于實施例2-3的P。提取率。
[0049] 另外，藻類粉末樣品與提取劑的固液比為1:30的提取比例會導致提取液過于黏稠，固液分離效果差，當提取比例為1:90,1:100時，稀釋倍數過大導致樣品濃度過低，提取率也差，而提取比例為1:60時，提取液既能充分與樣品粉末融合又不會過于黏稠且易分離，提取率更高，這表明采用固液比為1:60的提取比例更適合磷組分的提取。因此，湖泊藻類P。的提取比例為1:60。
[0050] 進一步地，從實施例7-12表明NaOH與EDTA同時作為提取劑藻類中的TP和P。的提取率明顯高于NaOH單獨作為提取劑藻類中TP和P。的提取率。實施例11中，當提取劑為0.5mol/ L Na0H+25mmol/L EDTA時，水體中藻類的TP和P。的提取率最高。如表2所示，實施例11中藻類中的TP和P。的提取率分別高達95.0 %和94.9%。
[0051] 如圖2所示，采用本發明的提取方法，得到藻類中磷組分的組成特征，表明藻類磷組分由正磷酸鹽、單酯磷、二酯磷、焦磷酸鹽組成，其中，P。以單酯磷為主要組成部分。
[0052] 表3.實施例11藻類中各個磷組分的含量(mg/kg)及占總磷的百分比（％)
[0053]
[0054] 從表3可以看出，藻類Pi占TP的27.04%~68.73 %，而P。甚至可達TP總量的31.27 % ~72.96%。藻類單酯磷占TP的28.73%~56.27%，平均含量高達P。的83%。因此，單酯磷是藻類中P。的主要組分。
[0055] 31P_NMR分析及其延遲時間的設定研究。實施例13-15中31P_NMR的參數設置見表4。按上述步驟進行實驗。表4為不同延遲時間的藻類磷組分含量。表5為不同延遲時間口:的藻類磷組分積分比例。
[0056] 表4.不同延遲時間(m)的藻類磷組分含量(mg/kg)
[0058] 表5.不同延遲時間的藻類磷組分積分比例（％ )
[0060] 如圖3和表4-5所示，隨著測試時間的增長，單酯磷和二酯磷含量及積分比例均降低，正磷酸鹽和焦磷酸鹽含量及積分比例均上升。DdA2s到5s時，單酯磷含量降低4.71%，二酯磷含量降低不足〇. 5%，而相應的正磷酸鹽和焦磷酸鹽分別上升6.36%和1.10%。口以人 5s到15s導致分析結果的變化較為明顯，其單酯磷含量降低6.08%，二酯磷分解的更為劇烈，從424mg/kg降低到107mg/kg，約有75%二酯磷分解了，相應的正磷酸鹽和焦磷酸鹽含量分別上升14.55%和7.08%。因此，為防止P。在分析過程中造成大量的降解，延遲時間不宜過長，測試時間盡量控制在12~15h之間。進一步比較Di = 2s和5s的圖譜，Di = 5s時焦磷酸鹽的峰信號更加尖銳些，而Di = 2s的焦磷酸鹽譜峰相對較寬，D1 = 2s時單酯磷區域出現6個詳細尖峰，而Di = 5s時檢測出來8個尖峰。因此，從31P-NMR圖譜分辨率的角度考慮，對于藻類樣品，選擇Di = 5s時相對較優。綜上分析，對湖泊藻類樣品NaOH-EDTA提取液的31P-NMR分析時，選擇Di = 5s，測試時間在15h。
[0061] 以上對本發明實施例所提供的一種湖泊藻類中有機磷提取及組成分析方法，進行了詳細介紹，本文中應用了具體個例對本發明的原理及實施方式進行了闡述，以上實施例的說明只是用于幫助理解本發明的方法及其核心思想；同時，對于本領域的一般技術人員，依據本發明的思想，在【具體實施方式】及應用范圍上均會有改變之處，綜上所述，本說明書內容不應理解為對本發明的限制。
【主權項】
1. 一種湖泊藻類中有機磷提取方法，其特征在于包括以下步驟： (1) 樣品采集:采集富營養化湖泊水體表層漂浮藻類，裝入密封袋冷藏保存，運回實驗室進行冷凍干燥，冷干后充分研磨，過2_篩，得到藻類粉末樣品，-20°c冷凍保存備用； (2) 磷的基本組成測定：取藻類粉末樣品兩份，一份于馬弗爐中煅燒，樣品降至室溫后加入HC1振蕩，離心分離后分析其中磷濃度，即總磷TP含量;另一份樣品置于離心管中，加入 HC1振蕩，離心后測定磷濃度，即無機磷Pi含量;藻類中有機磷P。的含量由1?和?1相減得到； (3) P。的提取:取藻類粉末樣品加入提取劑，室溫下振蕩、離心后，留取上清液，冷凍干燥形成粉末樣品，冷凍保存備用； (4) 樣品測試預處理:將步驟(3)得到的粉末樣品用NaOH溶解，離心，加入D20鎖定信號； (5) 31P-NMR分析:采用BRUKER標準腔5mm BB0探頭，31P的共振頻率為161.98Hz，測定溫度為20°C，譜峰寬度為5Hz，獲取時間AQ為0.2102s; (6) 計算:通過步驟(5)中得到的波譜進行積分及對各磷組分進行定性分析，并根據步驟(2)得到的TP含量計算藻類中各磷組分的含量。2. 根據權利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述藻類為微囊藻、小球藻和螺旋藻。3. 根據權利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述TP的測定具體為:準確稱取0.5g 藻類粉末樣品一份，3個平行樣，于馬弗爐中450°C煅燒3h，降至室溫后轉移至離心管中，加入20mL3.5mol/L HC1振蕩16h，離心分離后，上清液用0.45μπι濾膜過濾得提取液，利用5%過硫酸鉀121°C消解30min，分析其中磷濃度，即ΤΡ含量。4. 根據權利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述Pi的測定具體為:準確稱取0.5g藻類粉末樣品一份，3個平行樣，置于離心管中，加入20mLlmol/L HC1振蕩提取16h，離心分離后，上清液用0.45μπι濾膜過濾得提取液，測定磷濃度，SPPi含量。5. 根據權利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述步驟(3)P。的提取具體為:取藻類粉末樣品0.5g加入提取劑，室溫下振蕩提取16h，4°C條件下，8000 X g離心30min后留取上清液，冷凍干燥形成粉末樣品，冷凍保存備用。6. 根據權利要求5所述的提取方法，其特征在于，所述步驟(4)中NaOH為0.6mL lOmol/ LNaOH;所述離心為8000 X g離心15min;所述D2O為0.2ml。7. 根據權利要求6所述的提取方法，其特征在于，所述提取劑為0.5mol/L NaOH+25m mol/L EDTA〇8. 根據權利要求1-7任一項所述的提取方法，其特征在于，所述步驟(3)中，藻類粉末樣品與提取劑的固液比為1:60。9. 根據權利要求1-7任一項所述的提取方法，其特征在于，所述步驟(5)中，31P-NMR參數中延遲時間Di的設置為2s、5 s或15 s，分析測試時間為12-15h。10. 根據權利要求1-7任一項所述的提取方法，其特征在于，分析得到，藻類中磷由正磷酸鹽、單酯磷、二酯磷以及焦磷酸鹽組成，P。占 TP的31.27%~72.96%，單酯磷為藻類中P。重要組分，其平均含量占 P。的83 %。
【文檔編號】G01N1/34GK106053509SQ201610290790
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年5月4日
【發明人】馮偉瑩, 吳豐昌, 朱元榮, 張琛
【申請人】中國環境科學研究院

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