一種時間分辨免疫熒光定量檢測方法及其所用的試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發明涉及生物醫學檢測領域，具體而言，涉及一種時間分辨免疫熒光定量檢測方法，所述方法兼具了POCT快速定量檢測系統和化學發光常規檢測項目的檢測功能，在操作上快速靈活，準確性、線性范圍、靈敏度、精密性等性能指標均好于層析法膠體金和熒光定量系統。所述的試劑盒包括：熒光微球與反應杯；所述熒光微球為聚苯乙烯熒光微球；所述聚苯乙烯熒光微球內部包裹有稀土熒光離子銪，表面包被有與待測物對應的抗體；所述反應杯固定包被有與待測物對應的抗體、抗原或待測物本身；所述聚苯乙烯熒光微球表面包被的抗體與反應杯固定包被的抗體為待測物的配對抗體。該試劑盒方便保存和運輸，具備化學發光大系統的檢驗功能。
【專利說明】
一種時間分辨免疫熒光定量檢測方法及其所用的試劑盒
技術領域
[0001] 本發明涉及生物醫學檢測領域，具體而言，涉及一種時間分辨免疫熒光定量檢測 方法及其所用的試劑盒。
【背景技術】
[0002] 隨著國民經濟和國家醫療健康事業的不斷發展，心臟標志物、感染性疾病、內分泌 激素、糖尿病、傳染病、腫瘤標記物的臨床檢測量不斷增長，臨床檢測技術也日益發展。
[0003] 目前用于檢測心血管疾病標志物、炎癥感染標志物等臨床需要快速檢測出具結果 的項目，一般采用層析法的膠體金免疫定量和層析法的熒光免疫定量P0CT快速檢測系統。 POCT(point-〇f-care testing)也常被稱為床旁檢測、醫生診所檢測、實驗室外檢測、分散 測試、現場替代檢測、"衛星化"檢測、患者自我檢測等。其檢測具有時間短，患者親歷等優 點，因而能快速而恰當地進行診療、護理、病程觀察，進而提高醫療質量和患者滿意度，目前 P0CT已經廣泛應用在ICU、手術、急診、診所及患者家中，主要應用于心臟標志物、感染性疾 病、糖尿病等項目的檢測，而大型的化學發光系統也不斷在三甲醫院得到普及使用。
[0004] 層析法的膠體金免疫定量和層析法的熒光免疫定量P0CT快速檢測系統雖然在適 應臨床P0CT檢測日益擴大的需求方面發揮了突出的作用，但同時也存在著準確性欠佳，重 復性波動大的缺陷。在腫瘤標記物、激素、傳染病的臨床定量檢測，目前為主依賴進口的化 學發光檢測系統，該系統龐大而復雜，并且價格昂貴，一般的中小醫院難以開展更難普及。 例如目前常用的日本三菱公司的Pathfast?化學發光免疫分析系統則是小型的化學發光 系統，和法國梅里埃的mini vidas酶聯免疫熒光定量檢測系統，均存在系統復雜，維護麻 煩，采用液體系統、需要冷藏等缺點。
[0005] 有鑒于此，特提出本發明。

【發明內容】

[0006] 本發明的第一目的在于提供一種時間分辨免疫熒光定量檢測方法，該方法操作簡 單、快速，易于掌握。
[0007] 本發明的第二目的在于提供所述時間分辨免疫熒光定量檢測方法所用的試劑盒， 所述的試劑盒檢測準確性好，重復性性好，反應體系簡單，維護方便。
[0008] 為了實現本發明的上述目的，特采用以下技術方案：
[0009] -種時間分辨免疫焚光定量檢測方法，包括：
[0010] 1)、吸取待測樣本，加入熒光微球并溶解混勻；
[0011]所述焚光微球為:聚苯乙稀焚光微球的內部包裹有稀土焚光離子銪，表面包被有 與待測物對應的抗體；
[0012] 2)、吸取步驟1)中得到的混合液體，加入到固定包被有與待測物對應的抗體或抗 原的反應杯中進行反應；
[0013] 3)、反應結束后移除反應杯中內的液體并用洗滌緩沖液對反應杯的內含物進行洗 滌；
[0014] 4)、洗滌完成后，移除洗滌緩沖液并檢測反應杯內的熒光值，計算得到待測樣本中 的待測物濃度。
[0015] 本申請的反應原理可簡述為：
[0016] 先將待測樣本溶液稀釋至合適濃度后與聚苯乙烯熒光微球反應(實際是與包被在 微球表面的抗體進行結合），形成微粒-抗體-待測物的復合物；
[0017] 將所述微粒-抗體-待測物的復合物加入到反應杯內時，反應杯的內含物（即包被 有與待測物對應的抗體、抗原或待測物本身)會將相應的復合物抓取并固定在反應杯內。經 洗滌后洗去所有未結合的物質。
[0018] 反應結束后，用紫外光源(340nm)對反應杯掃描檢測，反應杯內熒光納米微球發出 高強度的熒光(615nm)，且衰變時間也較長。利用延緩測量時間，待樣品基質中自然發生的 短壽命熒光（1~l〇ns)全部衰變后，再測量稀土元素的特異性熒光，這樣就可以完全排除特 異本底焚光的干擾。
[0019] 再將得到的熒光值代入事先計算好的由待測物標準品的不同濃度的濃度值與其 對應的熒光值建立的標準曲線方程式，即可分析出樣品中待測物的濃度。
[0020] 其中，當待測物為抗原物質時，與聚苯乙烯熒光微球反應形成微粒-抗體-抗原的 復合物;反應杯內可包被待測物本身或與包被在聚苯乙稀熒光微球上的抗體結合位點不同 的第二抗體(即其配對抗體）。
[0021] a)、當反應杯內包被待測物本身時，反應杯拉取到的為未與樣本溶液中的待測物 結合的微球上的抗體(相當于反應杯內的待測物與樣本溶液中的待測物程競爭關系），即測 試得到的熒光信號與樣本溶液中的待測物濃度成反比。
[0022] b)、當反應杯內包被第二抗體時，反應杯拉取到的為微粒-抗體-抗原復合物，即測 試得到的熒光信號與樣本溶液稀釋中的待測物濃度成正比。
[0023] 當待測物本身即為抗體物質時（為描述方便，聚苯乙烯熒光微球上包被的抗體稱 為抗體微*，反應杯內包被的抗體稱為抗體》)與聚苯乙烯熒光微球反應形成微粒-抗體Π 抗體的復合物;反應杯內可包被待測物本身或與包被在聚苯乙烯熒光微球上的抗體結合位 點不同的第二抗體(即其配對抗體），或待測物對應的抗原。
[0024] 當反應杯內包被待測物本身時，情況同a)，即測試得到的熒光信號與樣本溶液稀 釋中的待測物濃度成反比；
[0025] 當反應杯內包被第二抗體時，情況同b)，即測試得到的熒光信號與樣本溶液稀釋 中的待測物濃度成正比；
[0026] 當反應杯內包被待測物對應的抗原時，情況同b)，即測試得到的熒光信號與樣本 溶液稀釋中的待測物濃度成正比，但注意此時抗體微政吉合待測物的Fc段，以防止干擾待測 物與其抗原結合。
[0027] 優選的，如上所述的時間分辨免疫熒光定量檢測試劑盒的使用方法，在步驟1)中， 加入所述熒光微球之前，還包括將待測樣本加入稀釋液并混勻。
[0028] 優選的，如上所述的時間分辨免疫熒光定量檢測試劑盒的使用方法，在步驟1)中， 所述混勻具體為用移液槍的吸頭吹打混勻。
[0029] 優選的，如上所述的時間分辨免疫熒光定量檢測試劑盒的使用方法，在步驟3)中， 所述反應的反應時間為10~20min。
[0030] 實施如上所述的時間分辨免疫熒光定量檢測方法的試劑盒，所述試劑盒包括：
[0031] 熒光微球與反應杯；
[0032]所述熒光微球為:聚苯乙烯熒光微球內部包裹稀土熒光離子銪，表面包被與待測 物對應的抗體；
[0033] 所述反應杯固定包被有與待測物對應的抗體、抗原或待測物本身；
[0034] 所述聚苯乙烯熒光微球表面包被的抗體與反應杯固定包被的抗體為待測物的配 對抗體。
[0035]本發明兼具了POCT(point-〇f-care testing)快速定量檢測系統和化學發光常規 檢測項目的檢測功能，在操作上快速靈活，在性能上比目前的膠體金或熒光的層析定量法 明顯高一檔次，準確性、線性范圍、靈敏度、精密性等性能指標均好于層析法膠體金和熒光 定量系統，達到了化學發光定量檢測的大系統的性能水平。
[0036] 與經典的時間分辨焚光免疫分析方法DELFIA法不同，時間分辨焚光免疫層析技術 采用熒光納米微球作為標記物，每個微球中可包裹成千上萬個熒光分子，大大提高了標記 效率，有效的提高了靈敏度;同時納米熒光微球表面修飾有合適密度的羧基，用于與蛋白或 抗體的共價偶聯，提高標記物的穩定性。
[0037] 優選的，如上所述的試劑盒，所述聚苯乙烯熒光微球為固態，所述反應杯的內含物 為固態。
[0038] 本申請的主要反應試劑及最終的檢測體系均為固相。其中，熒光標記物和反應杯 中都包被有大量的抗體或抗原物質，若以液體環境進行運輸或保存，必須采用干冰降溫或 冰箱保存，會導致整體成本攀升。而本申請所用試劑經過凍干處理，常溫保存即可，維護更 加簡單可靠，對應用條件要求相對較低，適用于床旁即時診斷的需求。
[0039] 優選的，如上所述的試劑盒，所述試劑盒還包含有洗滌緩沖液、稀釋液和代碼條中 的一種或多種。
[0040] 進一步優選的，如上所述的試劑盒，所述洗滌緩沖液為5~15mM PBST。
[0041 ] PBST即常規的磷酸鹽吐溫緩沖液，由PBS(Phosphate Buffered Saline)和Tween-20配制而成4!17.0~7.4。
[0042] 試劑盒內可包含PBST，也可不包含，由實驗室人員自行配制。
[0043] 進一步優選的，如上所述的試劑盒，所述稀釋液的配方為：
[0044] 0.8 ~1.2%BSA、0.08 ~0.12%Triton-X405、0.8 ~1.2% 蔗糖，溶劑為 45 ~55mM PBS〇
[0045] BSA(Bovine Serum Albumin)即牛血清白蛋白，PBS (Phosphate Buffered Saline)即磷酸緩沖鹽溶液。
[0046] 其中，本發明所采用的稀釋液和洗滌緩沖液均為工作液，但本領域技術人員可根 據需要替換為母液，使用時稀釋即可。
[0047] 進一步優選的，如上所述的試劑盒，所述代碼條中記錄有由待測物標準品的不同 濃度的濃度值與其對應的熒光值建立的標準曲線方程式信息。
[0048] 所述代碼條上印有條形碼或二維碼，在使用試劑前需讓檢測儀器讀取代碼條內的 信息，然后才能正常檢測，檢測儀器可自動將讀取得到的熒光值代入代碼條中記載的方程 式得到測試結果。當然，為方便人工讀取，代碼條上也可直接印上標準曲線公式，供人工計 算得到結果。
[0049] 與現有技術相比，本發明的有益效果為：
[0050] 1)、本發明兼具了P0CT快速定量檢測系統和化學發光常規檢測項目的檢測功能， 在操作上快速靈活，在性能上比目前的膠體金或熒光的層析定量法明顯高一檔次，準確性、 線性范圍、靈敏度、精密性等性能指標均好于層析法膠體金和熒光定量系統。
[0051] 2)、本申請的主要反應試劑及最終的檢測體系均為固相。其中，熒光標記物和反應 杯中都包被有大量的抗體或抗原物質，若以液體環境進行運輸或保存，必須采用干冰降溫 或冰箱保存，會導致整體成本攀升。而本申請所用試劑常溫保存即可，維護更加簡單可靠， 對應用條件要求相對較低，適用于床旁即時診斷的需求。
[0052] 3)、可通過系統的模塊擴充，具備化學發光大系統的檢驗功能，適用腫瘤標記物、 傳染病、內分泌激素等項目的檢測需求。
[0053] 4)、與傳統的P0CT技術相比，僅需要檢測一次反應杯內的熒光值即可(P0CT需要同 時檢測檢測線與對照線處的熒光值），減小了系統誤差，檢測結果更精確可靠。
【附圖說明】
[0054] 為了更清楚地說明本發明【具體實施方式】或現有技術中的技術方案，下面將對具體 實施方式或現有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的 附圖是本發明的一些實施方式，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創造性勞動的前 提下，還可以根據這些附圖獲得其他的附圖。
[0055] 圖1為本申請提供的試劑盒試用時的操作示意圖。
[0056] 附圖標記：
[0057] 101移液槍的tip頭；
[0058] 102待測樣本；
[0059] 103 稀釋液；
[0060] 104洗滌緩沖液；
[0061] 105凍干的熒光微球；
[0062] 106 反應杯。
【具體實施方式】
[0063]下面將結合實施例對本發明的實施方案進行詳細描述，但是本領域技術人員將會 理解，下列實施例僅用于說明本發明，而不應視為限制本發明的范圍。實施例中未注明具體 條件者，按照常規條件或制造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未注明生產廠商者，均為 可以通過市售購買獲得的常規產品。
[0064] 實施例1
[0065] 定量檢測人血清樣本中AFP(甲胎蛋白）含量。
[0066] 本實施例還提供了詳細的代碼條的制備方法。
[0067] 將 AFP 標準品梯度稀釋為 Ong/ml、50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、400ng/ml、800ng/ ml這幾個濃度。
[0068]待測樣本濃度未知。
[0069]取出試劑盒中的反應板(如圖1所示），其中熒光微球10 5及反應杯10 6內的孔內預 先裝有固體內含物。使用時將稀釋液和洗滌緩沖液預先加到孔103和104中。
[0070] 操作步驟：
[0071] 1、用移液槍101吸取50yL樣本102,加入到稀釋液孔103內，吹吸3次混勻；
[0072] 2、用移液槍101吸取100yL已稀釋的樣本，加入到標記有一株AFP單克隆抗體的熒 光微球的孔105內，吹吸3次溶解混勻；
[0073]所述熒光微球為聚苯乙烯熒光微球內部包裹稀土熒光離子銪，表面包被與待測物 對應的抗體后得到；
[0074]所述稀釋液的配方為：
[0075] 1.0%BSA、0.10%Triton-X405、0.8~1.2%蔗糖，溶劑為45~55mM PBS〇
[0076] 3、用移液槍吸取50yL熒光標記物孔105內的液體，加入到已包被有另一株AFP單克 隆抗體(與聚苯乙烯熒光微球上標記的單克隆抗體互為配對抗體）的反應杯106中，反應15 分鐘；
[0077] 4、反應時間到后，用移液槍101吸取去除反應杯106內液體，再用干凈的tip頭101， 依次吸取于洗滌緩沖液104的孔內吸取300yL 10Mm PBST，每次用tip頭101吹打3次后，吸取 到廢液桶廢棄;重復洗滌3~5次；
[0078] 5、洗滌完畢后，移除PBST溶液，用熒光檢測儀檢測反應杯106內的熒光值。
[0079 ]注:每次吸取不同溶液之前需要更換t ip頭101。
[0080] 測試結果如表1所示：
[0081] 表1反應杯焚光值結果
[0084]在實際應用中，標準曲線是事先做好的，并記錄在代碼條中，不需要使用者自行制 作該線性方程。
[0085] 待測樣本反應杯內的熒光值為5767,將y = 5767代入線性方程，得到待測樣本濃度 為394.8ng/ml。
[0086] 實施例2
[0087] 定量檢測人血清樣本中sAg含量。
[0088]本實施例還提供了詳細的代碼條的制備方法。
[0089]取出試劑盒中的反應板(如圖1所示），其中熒光微球10 5及反應杯10 6內的孔內預 先裝有固體內含物。使用時將稀釋液和洗滌緩沖液預先加到孔103和104中。
[0090] 操作步驟：
[0091] 1、在使用試劑前需讓檢測儀器讀取代碼條內的信息，以獲取標準曲線方程，及確 認待測物對應的試劑盒無誤。
[0092] 2、用移液槍101吸取50yL樣本102，加入到稀釋液孔103內，吹吸3次混勻；
[0093] 3、用移液槍101吸取100yL已稀釋的樣本，加入到標記有抗sAg的單克隆抗體的熒 光微球的孔105內，吹吸3次溶解混勻；
[0094]所述熒光微球為聚苯乙烯熒光微球內部包裹稀土熒光離子銪，表面包被與待測物 對應的抗體后得到；
[0095]所述稀釋液的配方為：
[0096] 0.8%85厶、0.12%1^行〇11-父405、0.8%蔗糖，溶劑為551111?85。
[0097] 4、用移液槍吸取50yL熒光標記物孔105內的液體，加入到已包被有sAg的反應杯 106中，反應20分鐘；
[0098] 5、反應時間到后，用移液槍101吸取去除反應杯106內液體，再用干凈的tip頭101， 依次吸取于洗滌緩沖液104的孔內吸取300yL 15Mm PBST，每次用tip頭101吹打3次后，吸取 到廢液桶廢棄;重復洗滌3~5次；
[0099] 6、洗滌完畢后，移除PBST溶液，用熒光檢測儀檢測反應杯106內的熒光值。
[0100] 注:每次吸取不同溶液之前需要更換tip頭101。
[0101] 測得待測樣本反應杯內的熒光值為3154,將熒光值輸入檢測儀器得到待測樣本濃 度為402. lng/ml。
[0102] 實施例3
[0103] 定量檢測人血清樣本中乙肝表面抗體含量。
[0104] 本實施例還提供了詳細的代碼條的制備方法。
[0105] 將乙肝表面抗體標準品梯度稀釋為0mIU/ml、50mIU/ml、100mIU/ml、250mIU/ml、 1000mIU/ml、5000mIU/ml，這幾個濃度。
[0106] 待測樣本濃度未知。
[0107] 取出試劑盒中的反應板(如圖1所示），其中熒光微球105及反應杯106內的孔內預 先裝有固體內含物。使用時將稀釋液和洗滌緩沖液預先加到孔103和104中。
[0108] 操作步驟：
[0109] 1、用移液槍101吸取50yL樣本102，加入到稀釋液孔103內，吹吸3次混勻；
[01 ?0] 2、用移液槍101吸取100yL已稀釋的樣本，加入到標記有一株乙肝表面抗原的焚光 微球的孔105內，吹吸3次溶解混勻；
[0111]所述熒光微球為聚苯乙烯熒光微球內部包裹稀土熒光離子銪，表面包被與待測物 對應的抗原后得到；
[0112] 所述稀釋液的配方為：
[0113] 1.0%BSA、0.10%Triton-X405、0.8~1.2%蔗糖，溶劑為45~55mM PBS〇
[01 Μ] 3、用移液槍吸取50yL焚光標記物孔105內的液體，加入到已包被有另一株乙肝表 面抗原(與聚苯乙烯熒光微球上標記的抗原互為配對抗原）的反應杯106中，反應15分鐘；
[0115] 4、反應時間到后，用移液槍101吸取去除反應杯106內液體，再用干凈的tip頭101， 依次吸取于洗滌緩沖液104的孔內吸取300yL 10Mm PBST，每次用tip頭101吹打3次后，吸取 到廢液桶廢棄;重復洗滌3~5次；
[0116] 5、洗滌完畢后，移除PBST溶液，用熒光檢測儀檢測反應杯106內的熒光值。
[0117] 注:每次吸取不同溶液之前需要更換tip頭101。
[0118] 測試結果如表2所示：
[0119] 表2反應杯焚光值結果
[0122] 在實際應用中，標準曲線是事先做好的，并記錄在代碼條中，不需要使用者自行制 作該線性方程。
[0123] 待測樣本反應杯內的熒光值為8976，將y = 8976代入線性方程，得到待測樣本濃度 為611.0mIU/ml。
[0124] 最后應說明的是：以上各實施例僅用以說明本發明的技術方案，而非對其限制;盡 管參照前述各實施例對本發明進行了詳細的說明，但本領域的普通技術人員應當理解:其 依然可以對前述各實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分或者全部技術特征 進行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應技術方案的本質脫離本發明各實施例技 術方案的范圍。
【主權項】
1. 一種時間分辨免疫熒光定量檢測方法，其特征在于，包括： 1 )、吸取待測樣本，加入熒光微球并溶解混勻； 所述熒光微球為：聚苯乙烯熒光微球的內部包裹有稀土熒光離子銪，表面包被有與待 測物對應的抗體； 2) 、吸取步驟1)中得到的混合液體，加入到固定包被有與待測物對應的抗體或抗原的 反應杯中進行反應； 3) 、反應結束后移除反應杯中內的液體并用洗滌緩沖液對反應杯的內含物進行洗滌； 4) 、洗滌完成后，移除洗滌緩沖液并檢測反應杯內的熒光值，計算得到待測樣本中的待 測物濃度。2. 如權利要求1所述的時間分辨免疫熒光定量檢測方法，其特征在于，在步驟1)中，加 入所述熒光微球之前，還包括將待測樣本加入稀釋液并混勻。3. 如權利要求1或2所述的時間分辨免疫熒光定量檢測方法，其特征在于，在步驟1)中， 所述混勻具體為用移液槍的吸頭吹打混勻。4. 如權利要求1所述的時間分辨免疫熒光定量檢測方法，其特征在于，在步驟3)中，所 述反應的時間為10~20min。5. 實施權利要求1~4任一項所述的時間分辨免疫熒光定量檢測方法的試劑盒，其特征 在于，所述試劑盒包括： 焚光微球與反應杯； 所述熒光微球為：聚苯乙烯熒光微球內部包裹稀土熒光離子銪，表面包被與待測物對 應的抗體； 所述反應杯固定包被有與待測物對應的抗體、抗原或待測物本身； 所述聚苯乙烯熒光微球表面包被的抗體與反應杯固定包被的抗體為待測物的配對抗 體。6. 如權利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述聚苯乙烯熒光微球為固態，所述反應 杯的內含物為固態。7. 如權利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包含有洗滌緩沖液、稀釋液 和代碼條中的一種或多種。8. 如權利要求7所述的試劑盒，其特征在于，所述洗滌緩沖液為5~15mM PBST。9. 如權利要求7所述的試劑盒，其特征在于，按照質量百分數計，所述稀釋液的配方為： 0.8~1.2%85厶、0.08~0.12%1^行〇11-父405、0.8~1.2%蔗糖，溶劑為45~551111?85。10. 如權利要求7所述的時間分辨免疫熒光定量檢測試劑盒，其特征在于，所述代碼條 中記錄有由待測物標準品的不同濃度的濃度值與其對應的熒光值建立的標準曲線方程式 信息。
【文檔編號】G01N21/64GK106018818SQ201610515446
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年7月1日
【發明人】肖江群, 江應玲, 鐘乾興, 王保丹, 樂宜萃
【申請人】安邦（廈門）生物科技有限公司