利用雙向電泳技術檢測產琥珀酸放線桿菌中酶的方法
【專利摘要】本發明公開了一種利用雙向電泳技術檢測產琥珀酸放線桿菌中酶的方法，所述方法包括菌體蛋白的提取、第一向IPG等點聚焦電泳、SDS?PAGE凝膠電泳、凝膠掃描和圖像分析等步驟。運用本方法能獲得蛋白質清晰、背景清楚的雙向電泳凝膠圖譜，能夠明確得鑒定出產琥珀酸放線桿菌中是否存在β?葡萄糖苷酶，從而解析產琥珀酸放線桿菌在二糖利用過程中的糖轉運和降解機制，對于后續利用產琥珀酸放線桿菌工業化生產丁二酸的過程十分有利，尤其對于碳源優化、發酵過程控制、降低成本有重要的意義。
【專利說明】
利用雙向電泳技術檢測產琥珀酸放線桿菌中酶的方法
技術領域
[0001]本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種利用雙向電泳技術檢測產琥珀酸放線桿菌中酶的方法。
【背景技術】
[0002]丁二酸作為一種四碳化合物，在工業上具有重要的用途，它可作為有機合成的原材料、中間產物或專用化學品廣泛應用于食品、香料、醫藥、油漆、塑料、材料等產業。生物法生產丁二酸具有許多優點，因此受到了國內外的廣泛關注。目前，利用產琥珀酸放線桿菌發酵生產丁二酸是國內外研究的熱點之一。產琥珀酸放線桿菌能利用多種糖類，包括一些二糖(例如纖維二糖)。研究表明，該菌株具有較強的利用纖維二糖發酵生產丁二酸的能力(Min Jiang, Rong Xu, Yong-Lan Xi, et al.Succinic acid product1n fromcellob1se by Actinobacillus succinogenes.B1resource Technology, 2013, 135
(5):469-474.)。該菌是如何攝入并降解利用纖維二糖的，纖維二糖是直接以二糖的形式進入細胞代謝網絡還是細胞將纖維二糖降解為兩分子的葡萄糖之后再被細胞降解利用，解析這一問題對于研究產琥珀酸放線桿菌能利用多種碳源的機制有重要的意義。纖維二糖在β-葡萄糖苷酶的作用下，可被降解為兩分子葡萄糖。本專利旨在利用雙向電泳技術來檢測產琥珀酸放線桿菌糖轉運機制中是否存在β-葡萄糖苷酶，從而更好地解析產琥珀酸放線桿菌在二糖利用過程中的糖轉運和降解機制。

【發明內容】

[0003]利用酶活法測定菌體中是否存在某種酶對酶本身的活力和含量要求較高，特別對于一些含量比較低的蛋白，利用酶活測定法無法準確獲知酶在該菌體中是否存在。本發明的目的在于提供一種利用雙向電泳技術來檢測產琥珀酸放線桿菌中葡萄糖苷酶的方法。
本發明所述的利用雙向電泳技術檢測產琥珀酸放線桿菌中葡萄糖苷酶的方法通過以下技術方案實現:
一種利用雙向電泳技術檢測產琥珀酸放線桿菌中酶的方法，包括以下步驟:
步驟I)培養產琥珀酸放線桿菌，提取菌體蛋白；
步驟2)采用IPG固相膠條，水化上樣，進行等點聚焦，等電聚焦完成后平衡膠條；
步驟3)轉移步驟2)平衡后的膠條至SDS-PAGE凝膠上進行電泳；
步驟4)將所得凝膠染色脫色后，掃描并分析圖像。
[0004]具體地，所述步驟I)中產琥泊酸放線桿菌為產琥泊酸放線桿菌(Actinobac Hlussuccinogenesmil'i CGMCC N0.1716，培養產琥珀酸放線桿菌方法如下:將凍存于_70°C冰箱的菌種在斜面培養基中進行平板劃線后，在37°C厭氧培養箱中活化培養24 h;活化培養后的菌種轉接到種子培養基中，充⑶2 2?3min，培養溫度35?37 °C，培養時間10?12h;將活化好的種子液接入發酵罐中，接種量為體積比3?10%，溫度為35?40 °C，始終通入C02氣體來保持厭氧環境，纖維二糖作為碳源，整個發酵過程中PH控制在6.5-7.0,攪拌速度為100?300 rpm，發酵30?40 h。
[0005]具體地，所述步驟I)提取菌體蛋白的具體方法為:菌體以纖維二糖作為唯一碳源發酵12?16h后，取發酵液，離心去除上清獲得菌體沉淀，用TCA-丙酮沉淀法提取總蛋白樣品。利用clean-up試劑盒對該總蛋白樣品進行純化，試劑盒純化能去除蛋白樣品溶液中的雜質，有利于獲得理想的電泳圖譜。
具體地，所述步驟2)具體為:將步驟I)提取的菌體蛋白與水化液混合成上樣液，加有已知酶的菌體蛋白與水化液混合成上樣液作為對照，水化上樣，泡漲IPG固相膠條，然后轉移至膠條槽中，進行等點聚焦，等點聚焦結束后將膠條依次在平衡液1、平衡液2中平衡，平衡條件為搖床轉速40rpm下平衡15min;
其中，所述水化液:2%CHAPS，0.5%IPG緩沖液，18mMDTT，8M尿素，0.002%溴酚藍；
所述平衡液I: SDS平衡母液中加入DTT 0.1mg/膠條；
所述平衡液2: SDS平衡母液中加入碘乙酰胺0.25mg/膠條；
所述SDS平衡母液:75mM Tris-Cl pH8.8，6M尿素，2%SDS，0.002%溴酚藍，29.3%甘油。具體地，所述的酶為葡萄糖苷酶;所述上樣液體積為450HL，上樣液含有菌體蛋白I?2mg，泡漲時間10?12h，所述IPG固相膠條為24cm的線性的固相干膠條pH3_10，等點聚焦過程參數設置如下:30V運行10h，500V運行lh，1000V運行lh，1000V電壓2小時內梯度升高至10000V，10000 V運行7?8h，1000V運行2?3h，上限電流為50μΑ/膠條，溫度為20 °C。
[0006]具體地，所述步驟3)中SDS-PAGE凝膠電泳中膠濃度為12.5%，電泳條件為3W/膠條4?5h，10-13W/膠條，直至溴酚藍指示劑到達凝膠底部邊緣時停止電泳。
[0007]具體地，所述步驟4)采用考馬斯亮藍染色;分析圖像具體方法為:將菌體蛋白樣品和加有已知酶的菌體蛋白樣品分別獲得的凝膠圖像進行比對，找出差異的蛋白點。
[0008]本發明所使用的菌株產琥?白酸放線桿菌(Ac t inobac illus succ inogenes )NJ 113的來源:在中國專利局或國際專利組織承認的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心進行了專利程序保藏(保藏編號:CGMCC N0.1716)的，并在本申請日之前已授權(專利號200610085415.9，授權公告日2009年9月9日，授權公告號CN100537744 C)的生物材料。
[0009]本發明的有益效果在于:本發明所述方法提供了一種利用雙向電泳技術檢測產琥珀酸放線桿菌中葡萄糖苷酶的方法，本方法易操作，實驗結果分析簡便，而傳統的利用酶活法測定菌體中酶的方法對操作的要求高，整個操作必須保證酶的活性，而且對酶量的要求比較高，微量的酶通過酶活法很難檢測，而對于細胞膜上的酶的提取往往損失較為嚴重，很難獲得活性比較好的酶。本方法彌補了上述所有的缺陷，可以作為檢測產琥珀酸放線桿菌中酶的有效手段。
【附圖說明】
[0010]圖1是采用24cm的線性的IPG固相干膠條ΡΗ3-10的雙向電泳凝膠考染圖，蛋白樣品為產琥珀酸放線桿菌蛋白提取液。
[0011]圖2是采用24cm的線性的IPG固相干膠條pH3_lO的雙向電泳凝膠考染圖，蛋白樣品為加有β-葡萄糖苷酶的產琥珀酸放線桿菌蛋白提取液。
【具體實施方式】
[0012]下面結合【具體實施方式】進一步說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。
若未特別指明，下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照本領域技術人員所熟知的常規手段或者按照制造廠商所建議的條件。
[0013]本發明所用的原料或試劑除特別說明之外，均可通過通過商業化渠道購得。
[0014]實施例1
本發明所使用的菌株產琥泊酸放線桿菌(Ac t inobac ? I Ius succinogenes )NJ113的來源:在中國專利局或國際專利組織承認的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心進行了專利程序保藏(保藏編號:CGMCC N0.1716)的，并在本申請日之前已授權(專利號200610085415.9，授權公告日2009年9月9日，授權公告號0肌00537744 C)的生物材料。
[0015]活化菌種:將凍存于-70 °C冰箱的產琥珀酸放線桿菌(Ac ZinokcH/mssucc inogenes )NJ113菌種在斜面培養基中進行平板劃線后，在37 C厭氧培養箱中活化培養24 h0
[00? 6] 種子培養:將產琥I自酸放線桿菌(Ac / i I Ius succ inogenes )NJ113接種至種子培養基中，10mL血清瓶裝液量50mL，充⑶2 2?3min，培養溫度35?37°C，培養時間10?12h0
[0017]發酵培養菌體:將種子液接種到發酵培養基中，接種量為體積比3?10%，始終通入CO2氣體來保持厭氧環境，纖維二糖作為碳源，整個發酵過程中pH控制在6.5-7.0,發酵溫度35?37°C，攪拌速度為100~300 rpm，發酵30?40 h。
[0018]上述的種子培養基和發酵培養基應理解為現有技術中任何可以被產琥珀酸放線桿菌利用的培養基成分。在本發明的實施例中，所述種子培養基組分為:葡萄糖10?20g/L，酵母膏 5 ?10 g/L，NaH2PO4.2H20 9.6 ?15.5g/L，K2HP04.3Η20 15.5 ?21.4 g/L，NaHCO3 10?18 g/L，玉米漿 5?10 g/L,pH 6.0?8.0。
[0019]所述發酵培養基組分為:纖維二糖40 g/L，乙酸鈉1.36?2.8 g/L,NaCl I?2.2g/L，CaCl2 0.2?0.4 g/L，MgCl2 0.2?0.5 g/L,Na2HPO4 0.31 ?0.65 g/L,NaH2PO4 1.6 —3.5 g/L,K2HPO4 3?6.1 8/1，酵母膏10?2(^/1，？冊.0~8.0。
[0020]提取菌體蛋白:菌體以纖維二糖作為唯一碳源發酵12?16h后，取發酵液，離心去除上清獲得菌體沉淀，加入預冷的含有20mmol/LDTT的10%TCA丙酮溶液混勻后置于-20°C中過夜，離心去上清，風干沉淀，向沉淀中加入雙向電泳裂解液(7M尿素，4%CHAPS，2%IPG緩沖液，40mM DTT)，室溫下浸提2h，離心取上清，即制得產琥I自酸放線桿菌(Act inobac Hlussucc inogenes )NJ113的總蛋白樣品溶液。用c I ean_up試劑盒(從GE公司購得)純化，試劑盒純化能去除蛋白樣品溶液中的雜質，有利于獲得理想的電泳圖譜。
[0021 ]蛋白質定量:用Bradford法測定蛋白質含量。
[0022]水化上樣:將提取的菌體蛋白2mg與水化液(2%CHAPS，0.5%IPG緩沖液，18mMDTT，8M尿素，0.002%溴酚藍)混合成上樣液450UL，水化上樣，泡漲IPG固相膠條12h，IPG固相膠條為24cm的線性的固相干膠條pH3-10，設有三個平行膠條，平行樣之間的實驗條件完全一致。
[0023]等電聚焦:將泡漲好的膠條轉移至膠條槽中，進行等點聚焦，等點聚焦過程參數設置如下:30V運行10h，500V運行lh，1000V運行lh，1000V電壓2小時內梯度升高至10000V，10000 V運行7?8h，1000V運行2?3h，上限電流為50μΑ/膠條，溫度為20 0C。
[0024]膠條平衡:等點聚焦結束后將膠條依次在平衡液1、平衡液2中平衡，平衡條件為搖床轉速40rpm下平衡15min。所述平衡液1:SDS平衡母液中加入DTT 0.1mg/膠條；所述平衡液2: SDS平衡母液中加入碘乙酰胺0.25mg/膠條;所述SDS平衡母液:75mM Tris-Cl pH8.8，6M 尿素，2%SDS，0.002% 溴酚藍，29.3% 甘油。
SDS-PAGE凝膠電泳:使用垂直電泳，膠濃度為12.5%，將平衡后的膠條轉移至SDS-PAGE凝膠的上端，用瓊脂糖封頂。電泳的條件為3W/膠條4?5h，10-13W/膠條，直至溴酚藍指示劑到達凝膠底部邊緣時停止電泳。
[0025]考馬斯亮藍染色:將跑完的凝膠放于考馬斯亮藍R-250染色液(Ig考馬斯亮藍R-250粉末溶于300mL乙醇、10mL乙酸和600mL水的混合溶液中)中，震蕩染色過夜，將膠條轉移至脫色液[40%(v/v)乙醇、20%(v/v乙酸)，40%(v/v)超純水]中，震蕩脫色，直至凝膠背景透明。
[0026]凝膠掃描和圖像分析:將脫色過的凝膠置于掃描儀上掃描，保存圖片，如圖1所示。平行之間的凝膠圖片重復性比較高，沒有蛋白點丟失，本實施例證明采用上述電泳實驗可以獲得菌體的蛋白質圖譜。
[0027]實施例2
取實施例1提取的菌體蛋白2mg，加入β-葡萄糖苷酶(從Fluka公司購買)0.1mg，與水化液混合上樣，其他條件同實施例1。
[0028]凝膠圖片如圖2所示。將圖1與圖2進行差異分析，圖2中方框標出的點為β-葡萄糖苷酶，圖1中此位置沒有出現蛋白點，結果證明產琥珀酸放線桿菌中不含β-葡萄糖苷酶，這對于研究產琥珀酸放線桿菌二糖代謝機理有很大的幫助。
【主權項】
1.一種利用雙向電泳技術檢測產琥珀酸放線桿菌中酶的方法，其特征在于，包括以下步驟: 步驟I)培養產琥珀酸放線桿菌，提取菌體蛋白； 步驟2)采用IPG固相膠條，水化上樣，進行等點聚焦，等電聚焦完成后平衡膠條； 步驟3)轉移步驟2)平衡后的膠條至SDS-PAGE凝膠上進行電泳； 步驟4)將所得凝膠染色脫色后，掃描并分析圖像。2.根據權利要求1所述的一種利用雙向電泳技術檢測產琥珀酸放線桿菌中酶的方法，其特征在于，所述步驟I)中產琥?自酸放線桿菌為產琥?自酸放線桿菌(Act inobaci I Iussuccinogenesmil'i CGMCC N0.1716，培養產琥珀酸放線桿菌方法如下:將凍存于_70°C冰箱的菌種在斜面培養基中進行平板劃線后，在37 °(:厭氧培養箱中活化培養24 h;活化培養后的菌種轉接到種子培養基中，充⑶2 2?3min，培養溫度35?37 °C，培養時間10?12h;將活化好的種子液接入發酵罐中，接種量為體積比3?10%，溫度為35?40 °C，始終通入CO2氣體來保持厭氧環境，纖維二糖作為碳源，整個發酵過程中PH控制在6.5-7.0,攪拌速度為100?300 rpm，發酵30?40 h。3.根據權利要求1所述的一種利用雙向電泳技術檢測產琥珀酸放線桿菌中酶的方法，其特征在于，所述步驟I)提取菌體蛋白的具體方法為:菌體以纖維二糖作為唯一碳源發酵12?16h后，取發酵液，離心去除上清獲得菌體沉淀，用TCA-丙酮沉淀法提取總蛋白樣品，利用clean-up試劑盒對該總蛋白樣品進行純化。4.根據權利要求1所述的一種利用雙向電泳技術檢測產琥珀酸放線桿菌中酶的方法，其特征在于，所述步驟2)具體為:將步驟I)提取的菌體蛋白與水化液混合成上樣液，加有已知酶的菌體蛋白與水化液混合成上樣液作為對照，水化上樣，泡漲IPG固相膠條，然后轉移至膠條槽中，進行等點聚焦，等點聚焦結束后將膠條依次在平衡液1、平衡液2中平衡，平衡條件為搖床轉速40rpm下平衡15min; 其中，所述水化液:2%CHAPS，0.5%IPG緩沖液，18mMDTT，8M尿素，0.002%溴酚藍； 所述平衡液I: SDS平衡母液中加入DTT 0.1mg/膠條； 所述平衡液2: SDS平衡母液中加入碘乙酰胺0.25mg/膠條； 所述SDS平衡母液:75mM Tris-Cl pH8.8，6M尿素，2%SDS，0.002%溴酚藍，29.3%甘油。5.根據權利要求4所述的一種利用雙向電泳技術檢測產琥珀酸放線桿菌中酶的方法，其特征在于，所述的酶為β-葡萄糖苷酶。6.根據權利要求4所述的一種利用雙向電泳技術檢測產琥珀酸放線桿菌中酶的方法，其特征在于，所述上樣液體積為450yL，上樣液含有菌體蛋白I?2mg，泡漲時間10?12h，所述IPG固相膠條為24cm的線性的固相干膠條pH3-10，等點聚焦過程參數設置如下:30V運行10h，500V運行lh，1000V運行lh，1000V電壓2小時內梯度升高至10000V，10000 V運行7?8h，100V運行2?3h，上限電流為50μΑ/膠條，溫度為20 °C。7.根據權利要求1所述的一種利用雙向電泳技術檢測產琥珀酸放線桿菌中酶的方法，其特征在于，所述步驟3)中SDS-PAGE凝膠電泳中膠濃度為12.5%，電泳條件為3W/膠條4?5h，10-13W/膠條，直至溴酚藍指示劑到達凝膠底部邊緣時停止電泳。8.根據權利要求1所述的一種利用雙向電泳技術檢測產琥珀酸放線桿菌中酶的方法，其特征在于，所述步驟4)采用考馬斯亮藍染色。9.根據權利要求1所述的一種利用雙向電泳技術檢測產琥珀酸放線桿菌中酶的方法，其特征在于，所述步驟4)中分析圖像具體方法為:將菌體蛋白樣品和加有已知酶的菌體蛋白樣品分別獲得的凝膠圖像進行比對，找出差異的蛋白點。
【文檔編號】G01N21/84GK105891303SQ201610305977
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2016年5月10日
【發明人】徐蓉, 徐為民, 徐世偉, 孫雨茜, 徐寸發, 周昊
【申請人】江蘇省農業科學院