一種三維比色和光電化學紙基設備的制備及其在過氧化氫檢測中的應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及過氧化氫檢測技術領域，更具體地說是一種能夠用于過氧化氫檢測的三維比色和光電化學紙基設備的制備。
【背景技術】
[0002]活性氧簇，是一種含氧的化學活性分子，它包含一些羥基自由基(.0H)，超氧陽離子(02.—)，過氧化氫(H2O2)等。H2O2,是活性氧簇中穩定性最好的一種，它在生命過程中發揮著重要作用。隨著H2O2濃度的改變，其在細胞內的作用也會隨之發生轉變。低濃度下，H2O2作為一種信使分子，不僅能夠起到信號轉化的作用，而且還對細胞起著保護作用;相反，H2O2濃度過高會導致細胞發生病變，如細胞發生癌變、老化等。因此，細胞內H2O2的高靈敏檢測變得尤為重要。
[0003]目前，檢測細胞內H2O2的方法主要有化學發光、毛細管電泳化學發光法以及熒光方法等。這些檢測方法所需儀器比較昂貴，操作過程繁瑣，不適合在偏遠貧困地區進行檢測。因此，研制一種廉價的、攜帶方便且能夠實現細胞內低濃度H2O2的檢測設備已成為科研工作者奮斗的目標。
[0004]近年來，紙基免疫設備以其廉價、可折疊、儲量豐厚且便于修飾和攜帶等優點而備受科學家的關注。自懷特賽茲課題組報道了微流體紙基分析設備以來，不同種類的紙基設備應運而生。到目前為止，紙基免疫設備已經成功應用于各種分析檢測中，包括蛋白質檢測、DNA檢測、金屬離子的檢測以及一些生物小分子的檢測等領域。光電化學生物傳感器，因其激發光源和檢測信號是獨立的，因此具有高的選擇性和靈敏性，有望實現細胞內低含量H2O2的定量檢測，但是光電化學檢測方法不能給出一種直觀的檢測結果；而比色生物傳感器，能夠對待測物進行直觀的、可視化的檢測，但因其靈敏度較低，只能對待測物進行定性或半定量檢測。因此，迫切需要開發一種特異性強、靈敏度高、檢測范圍寬的分析檢測方法以同時實現細胞內H2O2的定量和定性檢測。

【發明內容】

[0005]本發明要解決的技術問題是制作一種操作簡單、易于修飾、制作成本低的紙基設備，用于細胞內低濃度的H2O2的高靈敏且可視化的檢測。
[0006]為了解決上述技術問題，本發明是通過以下措施來實現的:一種三維比色和光電化學紙基設備的制備方法，其特征是包括以下步驟:
(1)在計算機上設計比色和光電化學紙芯片的疏水蠟批量打印圖案，樣式如附圖1所示，至左向右，依次包含蠟打印圖案A，蠟打印圖案B，蠟打印圖案C;
(2)將紙剪裁成A4大小的紙，利用蠟打印技術將步驟(I)中設計的疏水蠟批量打印圖案打印到A4紙上，隨后將紙片取出，放置到烘箱中，在130?150 °C下加熱2 min，使蠟融化并浸透整個紙的厚度，形成疏水墻，沒有打印蠟的部分為親水區； (3)利用激光切割機，對印有蠟打印圖案A的紙芯片進行切割，制備溶液入口，樣式如圖2數字I所示，制備顯色通道，樣式如圖2數字2所示，對印有蠟打印圖案C的紙芯片進行切割，制備孔洞，樣式如圖2數字3所示；
(4)采用絲網印刷技術，將工作電極印刷圖案印刷到步驟(3)中得到的紙上，具體印刷位置是附圖2中數字4所示位置，隨后再依次將Ag/AgCl參比電極、碳對電極印刷圖案印刷到步驟(3)中得到的紙上的反面區域，具體印刷位置是附圖3中數字I和2所示位置；
所述絲網印刷電極所用的紙材料為一級色譜紙或者普通濾紙；
(5)對步驟(4)中紙芯片的親水的工作區域，亦即附圖3中數字3所示位置，功能化，將伴刀豆球蛋白A，生物標簽復合物及細胞固定在親水區域；
所述親水區域功能化，包括以下步驟:
在紙芯片上生長一層致密的Pt納米粒子層:將10.0 yL 10.0 mi^^H2PtCl6溶液滴加到紙芯片的親水區域，隨后滴加2.0 yL 3.0 mM的NaBH4溶液，室溫下靜置10 min，用超純水沖洗掉松散的Pt納米粒子，隨后將紙芯片再次室溫下干燥;采用電沉積法在生長有Pt納米粒子層的紙芯片上生長竹節狀的ZnO:將長有Pt納米粒子層的紙芯片放于烘箱中，向此紙芯片上滴加40.0 mM的Zn(CH3COO)2.2H20，作為ZnO的種子溶液，隨后將紙芯片130 °C下干燥5 min，將滴加種子溶液和加熱干燥的步驟重復3次，S卩可在長有Pt納米粒子層的紙芯片表面附著上ZnO種子，隨后將此紙芯片放于20.0 mM Zn(NO3)2.6H20與25.0 mM六次甲基四胺水溶液中，85弋下，電鍍5000?9000 s即可;將伴刀豆球蛋白A固定在親水區域;制備生物標簽復合物，首先先制備花狀的三維多孔Pd:向5.0 mL, 1.0 mM H2PdCl4溶液中加入0.2mL, 0.1 M的抗壞血酸溶液，室溫下震蕩12 h;隨后利用巰基與Pd間相互作用力，將巰基修飾的單鏈DNA連接在三維多孔Pd上，而后將10.0 yg.mL—1的石墨烯量子點加入到修飾有單鏈DNA的Pd納米粒子復合物中，室溫下反應兩個小時，石墨烯量子點則通過與單鏈DNA間JT-JT作用力附著在Pd納米粒子表面，生物標簽復合物制備完成;將10.0 yL生物標簽復合物滴加到紙芯片表面，隨后用5.0 uL 1%的牛血清白蛋白掩蔽活性位點，室溫下孵育50 min;最后將細胞滴加到紙芯片表面，用磷酸鹽緩沖溶液沖洗電極表面未成功連接的細胞；
(6)向顯色反應溶劑儲備區中，亦即附圖3中數字4所示位置上，滴加顯色劑和一定量的H2O2，作為顯色反應的儲備液供后續顯色反應使用；
所述顯色劑為3，3 ’，5，5 ’ -四甲基聯苯胺；
所加H2O2的具體用量為5 yL 2%-10%的H2O2;
(7)將(6)所得的印有蠟打印圖案A的紙芯片和蠟打印圖案B的紙芯片進行對折，通過溶液入口，滴加10.0 yL的佛波酯溶液，室溫下反應2 min后完成顯色反應，隨后將印有蠟打印圖案A的紙芯片打開，采用磷酸鹽緩沖溶液沖洗工作電極表面，將印有蠟打印圖案B的紙芯片和印有蠟打印圖案C的紙芯片進行對折，向紙芯片的親水區域滴加40.0 pL包含有抗壞血酸的磷酸鹽緩沖溶液，在紫外燈的照射下，連接電化學設備進行光電化學測試，其中抗壞血酸和磷酸緩沖液的濃度均為0.1 Mo
[0007]本發明所述比色和光電化學紙芯片的疏水蠟批量打印圖案設計如下:溶液入口是直徑為2.0?3.0 mm的孔，顯色區域直徑為3.0 mm，顯色通道寬度為0.5?1.0 mm，總長度為5.0-6.0 mm，與溶液入口處相連的顯色通道入口部分為親水區，長度為2.0?3.0 mm，其它顯色通道為中空通道;工作區域直徑為6.0 _，參比和對電極所在區域直徑為8.0 mm;蠟打印圖案C上的孔洞是為了將工作電極連接到電化學工作站所設計的，且其直徑為2.0~3.0 mm。
[0008]本發明的有益效果:
(1)通過在紙芯片表面生長一層致密的Pt納米粒子以及后續生長竹節狀的ZnO，使得光電流信號強度大幅度提高；
(2)通過精巧地設計紙芯片，實現了癌細胞內低含量的H2O2高靈敏且可視化的檢測。
【附圖說明】
[0009 ]圖1:疏水蠟批量打印圖案；
圖2:放大后的疏水蠟批量打印圖案，其中，I為溶液入口，2為顯色通道，3為孔洞，4為工作電極所在區域；
圖3:放大后的疏水蠟批量打印圖案的反面樣式，其中，I和2分別為參比電極、對電極所在區域，3為紙芯片親水的工作區域，4為顯色反應溶劑儲備區。
【具體實施方式】
[0010]實施實例I
一種三維比色和光電化學紙基設備的制備及其在過氧化氫檢測中的應用:
(1)在計算機上設計比色和光電化學紙芯片的疏水蠟批量打印圖案，它包含蠟打印圖案A，蠟打印圖案B，蠟打印圖案C;
(2)將紙剪裁成A4大小的紙，利用蠟打印技術將步驟(I)中設計的疏水蠟批量打印圖案打印到A4紙上，隨后將紙片取出，放置到烘箱中，在130?150 °C下加熱2 min，使蠟融化并浸透整個紙的厚度，形成疏水墻，沒有打印蠟的部分為親水區；
(3)利用激光切割機，對印有蠟打印圖案A的紙芯片進行