一種肺癌篩查試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種肺癌篩查試劑盒。
【背景技術】
[0002] 肺癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，其發病率和死亡率呈逐年上升趨勢，目前 發病率居世界首位，嚴重威脅著人類健康和生命。
[0003] 肺癌的病因復雜，一般認為影響因素包括:①吸煙；②環境污染：如霧霾、室內裝 修;③不良生活方式:如飲食習慣差、生活壓力大;④慢性肺部疾病:如肺結核、塵肺，砂肺、 慢性支氣管炎;⑤人體內在因素:如家族遺傳、免疫機能降低、內分泌功能失調等。
[0004] 同時，肺癌是一種善于隱匿的疾病，經常在疾病發展到晚期才表現出臨床癥狀，70 ~80%的肺癌患者在診斷出患有肺癌癥狀時已是中、晚期，癌細胞已經擴散，錯過了最佳治 愈時機，五年生存率低。對于早期的肺癌患者，經過及時治療可大大提高患者的5年及以上 生存率和生存質量。因此肺癌的早期診斷和進行有效的篩查至關重要。
[0005] 肺癌的篩查，是指對那些沒有肺癌相關癥狀的人群進行常規體檢，在出現癥狀前 及時發現肺癌。如果可以找到血液里面的肺癌分子標志物，用于提示臨床醫生早期對患者 采取相關的治療措施或者決策具有重要的意義。
[0006] 熱休克蛋白60(heat shock protein 60，HSP60)，是一種生物進化上高度保守的 蛋白質，其主要作用為協助多肽或蛋白質的正確轉位、折疊和裝配。關于HSP60與肺癌，僅有 文獻報道HSP60在肺腺癌患者組織中不表達，在有吸煙史的慢性阻塞性肺病患者(C0PD)中， 支氣管癌變的C0PD患者肺組織中表達的HSP60水平低【Cappello F etal，Hsp60and HsplOdown-regulation predicts bronchial epithelial carcinogenesis in smokers with chronic obstructive pulmonary disease[J]，Cancer，2006，107(10):2417-24]。目 前未見關于血漿HSP60與肺癌相關的報道。

【發明內容】

[0007] 為了解決上述問題，發明人對肺癌進行了詳細研究，發現了 HSP60可以作為其分子 標志物。其中，HSP60在血清中的表達水平與肺癌呈正相關。因此，通過檢測血清中HSP60的 表達水平，可以預測待檢人群患肺癌的風險。
[0008] 據此，本發明提供了一種肺癌篩查試劑盒，以及檢測HSP60的表達水平的試劑在制 備肺癌篩查試劑中的用途。
[0009] 本發明的肺癌篩查試劑盒，它包括任選的用于檢測HSP60表達水平的試劑。
[0010] 其中，所述試劑是用于檢測血清中HSP60表達水平的試劑。
[0011]其中，所述檢測HSP60表達水平的試劑為蛋白芯片檢測方法用試劑。
[0012] 其中，所述檢測HSP60表達水平的試劑為ELISA檢測方法用試劑或Western Blot檢 測方法用試劑。
[0013]本發明還提供了檢測HSP60表達水平的試劑在制備肺癌篩查用試劑中的用途。
[0014] 其中，所述試劑是用于檢測血清中HSP60表達水平的試劑。
[0015]其中，所述檢測HSP60表達水平的試劑為蛋白芯片檢測方法用試劑。
[0016] 其中，所述檢測HSP60表達水平的試劑為ELISA檢測方法用試劑或Western Blot檢 測方法用試劑。
[0017] 本發明試劑盒通過檢測HSP60的表達水平，可以判斷待檢人群患肺癌的風險：若 HSP60的表達水平高，則患肺癌的風險高，若HSP60的表達水平低，則患肺癌的風險低，可用 于臨床肺癌的輔助診斷，臨床應用前景良好。
[0018] 顯然，根據本發明的上述內容，按照本領域的普通技術知識和慣用手段，在不脫離 本發明上述基本技術思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。
[0019]以下通過實施例形式的【具體實施方式】，對本發明的上述內容再作進一步的詳細說 明。但不應將此理解為本發明上述主題的范圍僅限于以下的實例。凡基于本發明上述內容 所實現的技術均屬于本發明的范圍。
【附圖說明】
[0020]圖1為早期肺癌患者與健康對照血漿HSP60檢測結果圖
【具體實施方式】
[0021]實施例1HSP60表達水平與肺癌的關系 [0022]實驗方法如下：
[0023] -、臨床資料
[0024] 選取早期肺癌患者15例，健康對照10例，基本信息如下：
[0025]
[0026] 二、HSP60表達水平的檢測（定量檢測HSP60的含量）
[0027] 采用在RayBiotech公司購買的AAH-BLG-CUST試劑盒(貨號:AAH-BLG-CUST)，按照 如下方法檢測HSP60的表達水平：
[0028] 1、樣品透析
[0029] 抽取肺癌患者及健康對照的血液，EDTA抗凝后離心（1200rpm，10min)，將上清吸取 后進行第二次離心（3000rpm，15min)，吸取第二次離心后的上清即血漿，作為檢測標本，分 裝后-80°C保存。
[0030] 血漿樣品在生物素標記前需要利用透析管進行透析。分別取樣品100此加入到透 析管中，然后在4000mL的1 X ros(pH = 8)中4 °C邊攪拌邊透析。間隔3小時更換透析液一次， 透析三次后收集樣品至1.5mL離心管。
[0031] 注：1XPBS的配制：1.0g KCl，40gNaCl，1.0g KH2P04,5.75g Na2HP04用4,500ml去 離子水溶解，用1M NaOH調節pH=8.0，最后用去離子水定容至5，000ml。
[0032] 2、生物素標記樣品
[0033]在整個生物素標記樣品的過程，避免任何試劑受到胺類物質或疊氮鈉(或Tris，甘 氨酸)的污染。
[0034] 1)使用標記試劑前，將標記試劑(Labeling Reagent)小管快速離心后，管中加入 100yL 1 X PBS溶解標記試劑粉末，上下吹打將標記試劑混勻，制備成1 X標記試劑溶液。 [0035] 2)向裝有35ul樣本的離心管中加入22ul的IX標記試劑溶液和155ul標記緩沖液。 快速混勻，搖床上室溫孵育30min，每5min輕彈離心管，混合反應試劑。
[0036] 3)孵育30min后，在上步反應液中加入3yL終止液（Stop Solution);
[0037] 4)分別取樣品已加入終止液后樣品各100yL加入透析管中，然后在4000
[0038] mL的1 XPBS(pH=8)中4°C邊攪拌邊透析。間隔3小時更換透析液一次。
[0039]透析三次以后收集樣品。
[0040] 3、玻片芯片的完全干燥
[0041 ]將玻片芯片（RayBio? Biotin label-based human antibody array land 2)從 盒子中取出來，在室溫平衡20_30min后，將包裝袋打開，揭開密封條，然后將芯片放在真空 干燥器或者室溫干燥1-2小時。
[0042] 4、封閉和孵育
[0043] 1)每個芯片孔中加入100yL的封閉緩沖液(Blocking Buffer)，室溫搖床上孵育 lh，避免產生氣泡；
[0044] 2)抽去封閉液，每個孔中添加100yL透析后樣品，一個陣列一個樣品，4°C振蕩孵育 12-16h〇
[0045] 3)清洗
[0046] 使用Thermo Scientific Weilwash Versa芯片洗板機清洗玻片，分為兩步：首先 用1 X洗液I(Wash Buffer I)(用去離子水稀釋20X洗液I得到）進行清洗，每孔250yL的1 X 洗液I，清洗5次，每次震蕩10s，震蕩強度選擇高；然后換用1 X洗液II通道進行清洗，每孔 250yL的1 X洗液II (Wash Buffer II)(用去離子水稀釋20 X洗液II得到），清洗3次，每次震 蕩l〇s，震蕩強度選擇高。
[0047] 4)抽去IX洗液II，每孔加入100uL用封閉液1500稀釋的Cy3equiVal ent室溫避光 振蕩孵育2小時。
[0048] 5)按照步驟3)和4)洗玻片。
[0049] 5、熒光檢測
[0050] 采用激光掃描儀例如Axon Ge