從土壤中連續提取三種不同保存形式胡敏酸的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及胡敏酸的提取方法，更具體地說涉及一種從土壤中連續提取三種不同保存形式胡敏酸的方法。
【背景技術】
[0002]土壤有機質的保存十分復雜，研究者認為影響土壤有機質(SOM)穩定的因素主要有難降解性、相互作用以及可利用性。Skrull等將土壤有機碳的機理概括為生物化學難降解性以及物理保護作用(包括物理化學穩定性以及團聚體的形成Xvon Lutzow等認為土壤有機質的保存機理為選擇性保存、空間不可利用性以及與礦質表面的相互作用。與SOM類似，土壤胡敏酸作為SOM中的重要組分，在土壤中也有不同的保存形式。但對土壤胡敏酸的研究大多是單一提取劑提取單次，或者提取多次。這樣的萃取方法可能只能從土壤中萃取出單一保存形式的胡敏酸。例如國際腐殖質協會推薦的提取劑氫氧化鈉，對土壤的胡敏酸的萃取能力有限，可能只能提取氫鍵結合以及與氧化物表面絡合的有機質，而與氧化物結合以及與粘土礦物產生陽離子鍵橋的可萃取腐殖質可能無法被提取出來。

【發明內容】

[0003]為了彌補現有技術的不足，本發明目的是提供一種從土壤中連續提取三種不同保存形式胡敏酸的方法。
[0004]本發明解決技術問題所采用的技術方案是:從土壤中連續提取三種不同保存形式胡敏酸的方法，所述提取方法主要以下包括三個步驟:
a.游離胡敏酸HAf的提取:將研磨后的土樣置于離心瓶中，加入濃度為0.5 mol/L的NaOH溶液，在N2保護下攪拌約Imin;攪拌結束后靜置約30s，再將離心瓶及樣品放入搖床中搖晃;離心分離，并收集上清液;如此反復用NaOH溶液進行提取，至NaOH提取液接近無色;合并提取液，用HCl溶液調pH約至1.0，靜置分層;將沉淀與上清液分離，該沉淀即為游離胡敏酸HAf;將上述步驟中NaOH溶液無法提取的殘余物放入烘箱中65 °C烘干；
b.包裹胡敏酸HAe的提取:取上述步驟a中NaOH溶液無法提取的烘干殘余物，磨樣并過2mm的篩;再次用NaOH溶液進行提取，提取方法與上述游離胡敏酸HAf提取相似;提取至提取液顏色接近無色時，再次烘干-磨樣-提取，至首次NaOH提取的提取液接近無色;合并所有提取液，用HCl溶液調pH約至1.0，靜置分層；將沉淀與上清液分離，該沉淀即為包裹胡敏酸HAe;將上述步驟中NaOH溶液無法提取的殘余物放入烘箱中65 °C烘干；
c.結合胡敏酸HAi的提取:取上述步驟b中NaOH溶液無法提取的烘干殘余物，磨樣并過2mm的篩，放入離心瓶中；向離心瓶中加入HCl溶液，于60 °C下加熱20h;離心分離，去除上清液，留沉淀;再用HCl溶液重復處理一次，沉淀用milli Q水清洗4次，65°C下烘干;然后再次用NaOH溶液進行提取，提取步驟與上述包裹胡敏酸HAe的提取相似;合并所有的提取液，用HCl溶液調pH約至1.0，靜置分層;將沉淀與上清液分離，該沉淀即為結合胡敏酸HAi。
[0005]進一步地，所述步驟a中，搖床的轉速為115rpm，搖晃時間為4h;離心分離的轉速為3600 rpm，離心時間為10 min。
[000?] 進一步地，所述步驟a、b、c中，用于調節PH值的HCl溶液的濃度為6 mol/L;所述步驟c中，用于殘余物除鹽處理的HCl溶液的濃度也為6 mol/L。
[0007]進一步地，所述步驟a、b、c中，得到的三種不同保存形式的胡敏酸均分別再進行進一步的純化處理，去除粘粒物質。
[0008]對提取的上述三種不同形式的胡敏酸進行元素分析，結果顯示三種胡敏酸的元素組成差異顯著，游離胡敏酸碳含量最低，結合胡敏酸碳含量最高，說明土壤中確實存在三種不同形式的胡敏酸。測試的所有土壤均可分離出相對比例不同的三種胡敏酸組分，大多數土壤三種保存形式的胡敏酸的量按照游離胡敏酸，包裹胡敏酸和結合胡敏酸的順序顯著減少;但部分土壤包裹胡敏酸含量相對較高，甚至與游離胡敏酸相似。
[0009]該分析方法所用試劑(NaOH、HCl)少，實驗儀器簡單(離心機、烘箱、水浴、搖床)，大多實驗室均可進行操作。三種不同保存形式的胡敏酸分別在不同的土壤擾動下釋放，當土壤物理結構遭到破壞時可能釋放HAe;當土壤處于酸雨等礦物淋溶環境時可能釋放HAi。利用該技術分離的三種胡敏酸的C/N原子比分別約為HAf (12)、HAe (18)和HAi (30 )，說明三種胡敏酸的對微生物的敏感性逐步增加，因此當土壤受到擾動而釋放HAe和HAi時，易于被微生物分解利用。鑒于土壤胡敏酸對穩定土壤結構具有重要的作用，利用該分離技術對土壤三種保存形式的胡敏酸的含量及相對分布進行研究，在一定程度上可反映土壤抗擾動能力的強弱。
[0010]本發明的有益效果是:與現有技術相比，本發明提供的連續提取三種不同保存形式胡敏酸的方法利用物理和化學破壞土壤結構的簡單技術，從土壤中連續提取了三種不同保存形式的胡敏酸，該方法采用的試劑和實驗儀器較少，易操作，提取效率和純度較高;通過對土壤三種保存形式的胡敏酸的含量及相對分布進行研究，在一定程度上可反映土壤抗擾動能力的強弱。
【附圖說明】
[0011]圖1為本發明提供的連續提取三種不同保存形式胡敏酸的示意圖。
【具體實施方式】
[0012]下面結合附圖和【具體實施方式】，進一步闡明本發明，應理解下述【具體實施方式】僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。
實施例
[0013]從土壤中連續提取三種不同保存形式胡敏酸的方法，所述提取方法主要以下包括三個步驟:
a.游離胡敏酸HAf的提取:稱取100 g研磨后的土樣放入750 mL的離心瓶中，加入配置好的400 mL 0.5 mol/L的NaOH溶液;在N2保護下玻璃棒攪拌約I min(N2的出氣口通入到樣品濁液的液面以下)；攪拌結束后將犯的出氣口放到液面上端，靜置約30 s;將離心瓶及樣品放入搖床中，115 rpm搖晃4 h;將離心瓶放入離心機中3600 rpm離心10 min，分離上清液，暫存于收集瓶中；反復用NaOH溶液進行提取，至NaOH提取液顏色幾乎無色(提取次數與樣品有關);所有的提取液合并為一個樣品，加6 mol/L的HCl溶液調pH約至1.0，靜置一段時間；將沉淀與上清液分離，必要時離心分離;該沉淀即為游離胡敏酸HAf;離心瓶及其中NaOH無法提取的殘余物放入烘箱中65 °C烘干。
[00M] b.包裹胡敏