高效液相色譜法測定血漿及大腸癌細胞中5-氟尿嘧啶含量的方法
【技術領域】
[0001 ]高效液相色譜法進行血漿及大腸癌細胞中5-氟尿嘧啶含量的測定方法，屬于液相 色譜醫學分析技術領域。
【背景技術】
[0002] 5-氟尿嘧啶(5-Fu)是目前在臨床上應用最廣泛的嘧啶類抗腫瘤藥物，常用于大腸 癌、肝癌、胃癌等惡性腫瘤的治療。但是臨床上不同的腫瘤患者對5-Fu的療效和毒性反應有 明顯的個體差異。其抗癌化療效應和癌細胞內該藥物濃度有很大的關系，而且該藥在體內 藥物濃度過高時會發生其它的副作用。為了增強藥物的療效和減少不良副作用，必須嚴格 監測其在癌細胞內的濃度及體內藥物濃度的動態。進行監測對提高藥物療效，降低毒性，防 止術后轉移具有較大的臨床意義。
[0003] 雖然文獻已有報道采用HPLC法測定5-Fu，但5-Fu小腸吸收差，口服生物利用度低， 細胞及血漿中藥物含量極低，加上細胞及各血漿內源性物質干擾大，萃取方法回收率偏低， 采用常規的測定方法難以達到所需的檢測靈敏度，因而影響生物樣本中5-Fu測定的準確 性。
[0004] 本發明采用固相萃取提取大腸癌細胞及血漿中的5-Fu，提高了 5-Fu的萃取效率； 并對色譜條件進行了優化，文獻[1:劉放，劉雪莉，周芝芳等，用HPLC法測定5-Fu在大腸癌細 胞中的吸收特性，腫瘤研究與臨床，2002，14(3) : 155-158. ]HPLC測定5-Fu，色譜條件采用磷 酸鹽緩沖液體系，色譜峰存在嚴重拖尾現象;而且純粹的磷酸鹽體系對色譜柱和進樣體系 影響較大，大大縮短其使用壽命;本發明通過在檢測流動相中添加三氟乙酸和甲醇體系改 善了峰型，提高了理論塔板數并使色譜條件溫和，在選定的最佳色譜條件下，使5-Fu的測定 比文獻報道的更加精密、準確。

【發明內容】

[0005] 本發明的目的是提供一種用高效液相色譜法進行血漿及大腸癌細胞中5-氟尿嘧 啶含量的測定方法。本發明采用固相萃取提取大腸癌細胞及血漿中的5-Fu，提高了 5-Fu的 萃取效率;并對色譜條件進行了優化，使5-Fu的測定比文獻報道的更加精密、準確。
[0006] 本發明的技術方案:高效液相色譜法測定血漿及大腸癌細胞中5-氟尿嘧啶含量的 方法，步驟為： (一）、生物樣本前處理 血漿樣品處理 將固相萃取柱Styre Screen? HP依次用lmL乙醇、lmL含0.1%三氟乙酸的去離子水活 化； 吸取0.5mL血漿樣品，以lmL/min的速度加入活化后的固相萃取柱，待樣品富集后用lmL 去離子水淋洗，抽干;用V/V為75:25的乙醇-含0.1%三氟乙酸的去離子水溶液洗脫，抽干;使 用真空離心蒸發濃縮器干燥20min，去掉有機溶劑;經冷凍干燥器干燥濃縮，測定時用流動 相稀釋到合適的濃度； 大腸癌細胞(SW480-B7及SW480-NC)樣品處理 將固相萃取柱Styre Screen? HP依次用lmL乙醇、lmL含0.1%三氟乙酸的去離子水活 化； 分別取大腸癌細胞SW480-B7及SW480-NC，細胞數1 X 106，加質量濃度0.1%的氫氧化鈉 溶液1 mL，超聲5miη后，加0.5g硫酸銨，超聲5miη后，吸取0.5mL超聲處理后的溶液，以1 mL/ min的速度加入活化過的固相萃取柱，待樣品富集后用lmL去離子水淋洗，抽干；用V/V為75: 25的乙醇-含0.1%三氟乙酸的去離子水溶液洗脫，抽干；使用真空離心蒸發濃縮器干燥 20min，去掉有機溶劑;經冷凍干燥器干燥濃縮，測定時用200yL流動相溶解； 流動相為:磷酸調pH=3.0、再用三氟乙酸調pH=2.0的去離子水-甲醇溶液，去離子水：甲 醇體積比95:5，使用前經0.45μπι濾膜抽濾并脫氣； (二） 、色譜條件 色譜條件確定為：儀器:Waters 1525型高效液相色譜儀，2489紫外檢測器；色譜柱 Diamonsil C18柱，5ym、4.6X250mm; 流動相:磷酸調pH=3.0、再用三氟乙酸調pH=2.0的去離子水-甲醇溶液，去離子水：甲醇 體積比95:5，使用前經0.45μπι濾膜抽濾并脫氣； 流速：lmL/min; 進樣體積:20yL; 柱溫：30°C; 檢測波長：266nm; (三） 、固相萃取柱的選擇 米用Styre Screen? HP固相萃取柱； (四） 、標準曲線與檢測限： 血漿標準曲線 取適量的5-Fu標準品用甲醇溶解，配成lmg/mL標準液，稀釋成500，100，50，10，5，1，0.5 yg/mL，分別取100yL，各加健康人未給藥的空白血漿定容至2mL，混勻，配置為標準血藥5-Fu 濃度為25，5,2.5,0.5,0.25,0.05,0.025yg/mL，按步驟(一)所述血漿樣品處理方法經固相 萃取處理后，進行HPLC測定，記錄峰面積；以5-Fu濃度為橫坐標，相應的峰面積為縱坐標進 行線性回歸，得線性為:Y=34783x+34562，R 2=0.9991，結果顯示5-Fu質量濃度在0.025~25μ g/mL之間呈良好的線性關系;按信噪比S/N為3計，5-Fu的最小檢測濃度為0.02yg/mL; 大腸癌細胞標準曲線 取適量的5-Fu標準品用水溶解，配成lmg/mL標準液，稀釋成250，125，62.5，12.5，6.25， 3.125，0.625yg/mL的5-Fu稀釋液，分別取100yL系列5-Fu稀釋液各加未給藥空白SW480-B7 及 SW480-NC 細胞定容至2mL，混勻，配置成 12 · 5yg/mL、6 · 25yg/mL、3 · 125yg/mL、0 · 625yg/mL、 0 · 3125yg/mL、0 · 156 25yg/mL、0 · 0 312 5yg/mL的系列標準溶液，按步驟(一）大腸癌細胞樣品 處理方法進行固相萃取處理后，進行HPLC分析，記錄峰面積；以5-Fu濃度為橫坐標，相應的 峰面積為縱坐標進行線性回歸，SW480-B7癌細胞的線性為:Y=37963x+36842，R 2=0.9993; SW480-NC癌細胞的線性為：Y=30244x+32421，R2=0.9998;表明5-Fu質量濃度在0.03125~ 12.5ug/mL之間呈良好的線性關系，按信噪比S/N為3計，5-Fu的最小檢測濃度為0.025ug/ mL； (五） 、精密度和準確度 血漿樣品精密度與準確度測定 分別配制高、中、低三種不同濃度的5-Fu血漿樣品，按步驟(四）"血漿標準曲線"項下操 作，日內測定5次，日間測定3d，記錄峰面積，代入血漿標準曲線，計算回收率和日內、日間相 對標準差； 大腸癌細胞樣品精密度與準確度測定 分別配制高、中、低三種不同濃度的5-Fu的大腸癌細胞樣品，按步驟（四）"大腸癌細胞 標準曲線"項下操作，日內測定5次，日間測定3d，記錄峰面積，分別代入大腸癌細胞標準曲 線，計算回收率和日內、日間相對標準差； (六） 、樣品測定 臨床血樣測定 腫瘤患者于5-Fu靜脈輸注開始后24 h后取外周血，測定10例樣本5-Fu血藥濃度;取血 漿樣品適量，按步驟(一)生物樣本前處理血漿樣品處理方法處理后，取20yL注入色譜儀進 行測定，測定所得峰面積代入相對應的標準曲線方程，計算得到血漿樣品中5-Fu的含量； 大腸癌細胞內5-Fu的測定 以一定密度大腸癌細胞SW480-B7、SW480-NC分別接種于4個Τπχ)培養瓶中，當細胞為對 數生長期時，其中3瓶給藥，使5-Fu終濃度為2. Oyg/mL、4. Oyg/mL、8. Oyg/mL，1瓶不給藥，作 為對照;在給藥24 h后收集各濃度組細胞;取細胞數為1 X 106細胞沉淀的大腸癌細胞，每組 各6份，共12份，按步驟(一）生物樣本前處理大腸癌細胞樣品處理方法處理后，測定所得峰 面積代入相對應的標準曲線方程，計算得到5-Fu濃度，最后換算為每個大腸癌細胞內5-Fu 含量(l(T7yg/個細胞）。
[0007] 本發明的有益效果:本發明采用固相萃取提取大腸癌細胞及血漿中的5-FU，提高 了 5-Fu的回收率;并對色譜條件進行了優化，本發明通過在檢測流動相中添加三氟乙酸和 甲醇體系改善了峰型，提高了理論塔板數并使色譜條件溫和，在選定的最佳色譜條件下，使 5-F