在用于檢測多聚靶分子的基于顆粒的測試中防止聚集的試劑、方法和設備的制造方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及在用于檢測樣品中包含兩個或多個類似或相同表位的多表位靶分析物和/或用于確定樣品中多表位靶分析物的濃度的測試中防止檢測顆粒聚集的方法，其中所述方法包括應用能夠特異性結合到多表位分析物上的至少一個表位的第一捕獲實體的步驟，其特征在于所述第一捕獲實體阻斷至少一個表位結合到檢測顆粒。本發明進一步涉及其中多表位靶分析物的檢測包括使用第二捕獲實體的方法，所述第二捕獲實體可以如第一捕獲實體那樣特異性結合到多表位靶分析物的相同或相似表位。還預期到用于檢測所述多表位靶分析物的方法，在包括傳感器表面的系統中執行該方法以及使用第一捕獲實體以阻斷至少一個表位結合到檢測顆粒，諸如磁檢測顆粒。
【背景技術】
[0002]對普遍且有效的醫療護理的需求使得體外診斷學的世界朝向集成隨機訪問和床旁護理(point-of care)解決方案發展。此類解決方案的實現要求較高:測試需要是快速、靈敏、定量且準確的。此外，在其上執行測試的平臺需要易于使用且簡潔。
[0003]親和力測定使用生物分子來從樣品中捕獲特異性靶分子并且允許確定其濃度。通常，通過將涂敷有捕獲分子的納米顆粒或微粒分散至樣品流體中來實現親和力捕獲(Luchini等人，2008, Nano Lett., 8(1), 350 - 361)。因此，典型的基于親和力的測定在海量應用中使用，諸如診斷學測定、在研究中檢測生物分子，諸如蛋白、肽和核酸，由此使用親和分子，諸如例如抗體，其通常通過對特定生物分子的高結合親和力來表征。原則上，官能化的顆粒，例如磁顆粒，被吸引至傳感器表面，在那里顆粒可以間接(即借助于捕獲的分析物)或直接結合到捕獲探針，諸如印刷在表面上的抗體。結合的顆粒數目與樣品中存在的靶分子的數量正相關或反相關。通常，在此類生物傳感器應用中，可以使用對接近表面的顆粒靈敏的任何技術來檢測顆粒;通常此類技術基于光學檢測，諸如檢測散射光或受抑全內反射(FTIR)，如例如Bruls 等人，Lab Chip, 2009，9.2504-3510中所述。
[0004]然而，如現有技術中描述的此類親和力測定的重要缺點是這一事實，即在靶分子以多聚形式存在或提供大量相似或相同表位的情況下，多個顆粒可以結合到同一靶分子，其可導致形成珠粒-靶聚集體，即以群聚。這可能顯著減低顆粒(例如磁顆粒)的數目，所述顆粒可能與表面緊密接觸并且因此可能降低測定的靈敏度。此外，此類聚集過程可以以不可重現的方式發生，因此導致測定結果不準確。
[0005]因此，存在提供在多聚或多表位靶分子存在的情況下防止顆粒群聚的手段和方法的需求。

【發明內容】

[0006]本發明針對這些需求并且提供在多聚或多表位靶分子存在的情況下防止顆粒群聚的手段和方法。上述目標具體通過在用于檢測樣品中包含兩個或多個相似或相同表位的多表位靶分析物和/或用于確定樣品中所述多表位靶分析物的濃度的測試中防止檢測顆粒聚集的方法來實現，其中所述方法包括應用能夠特異性結合到所述多表位分析物上的至少一個表位的第一捕獲實體的步驟，其特征在于所述第一捕獲實體阻斷至少一個表位結合到檢測顆粒。此類第一捕獲實體的采用導致大部分相似或相同表位覆蓋在靶分析物上并且僅留下一小部分或單一表位。這些少數表位是自由的并且可以隨后或同時通過能夠與檢測顆粒相互作用的另外捕獲實體而結合。由此，有效地防止以其他方式幾乎不可避免的檢測顆粒的群聚。這導致測定或相應的檢測方法的靈敏度的顯著增加，并且還改進測定/檢測方法的再現性，因而增加測定/檢測方法準確性。
[0007]在優選的實施方案中，如上所提及的所述多表位靶分析物的檢測因而包括使用第二捕獲實體，其可以如第一捕獲實體那樣特異性結合到多表位靶分析物的相同或相似表位，其中第二捕獲實體包含準許第二捕獲實體結合到檢測顆粒的標記。
[0008]在本發明的仍另一優選的實施方案中，多表位靶分析物的檢測包括使用第二捕獲實體，其可以如第一捕獲實體那樣特異性結合到多表位靶分析物的相同或相似表位，并且其中第二捕獲實體存在于檢測顆粒上。
[0009]在進一步的方面中，本發明涉及用于檢測樣品中多表位靶分析物和/或用于確定樣品中多表位靶分析物的濃度的方法，其包括以下步驟:
-應用可以特異性結合到多表位分析物上的至少一個表位的第一捕獲實體，其特征在于第一捕獲實體阻斷至少一個表位結合到檢測顆粒；
-應用第二捕獲實體，其可以如第一捕獲實體那樣特異性結合到多表位靶分析物的相同表位，其中第二捕獲實體包含準許第二捕獲實體結合到如上文定義的檢測顆粒的標記，或其中第二捕獲實體存在于如上文定義的檢測顆粒上；以及
-利用能夠結合到第二捕獲實體上所存在的標記的檢測顆粒或利用包含能夠特異性結合到多表位靶分析物的表位的第二捕獲實體的檢測顆粒來檢測多表位靶分析物，
其中防止所述檢測顆粒聚集。
[0010]在如上定義的方法的優選實施方案中，測試中待使用的第一捕獲實體的數量和/或第二捕獲實體的數量取決于以下來制定
(i)待使用的檢測顆粒的數目；
(ii)用于多表位靶分析物的第二捕獲實體的數目；
(iii)多表位靶分析物上相似或相同表位的數目；
(iv)待測量的多表位靶分析物的濃度范圍；
(V)第一捕獲實體對多表位靶分析物的親和力；
(vi)第二捕獲實體對多表位靶分析物的親和力;和/或
(vii)檢測顆粒上標記的結合位點的數目。
[0011]在使用如上文定義的第一和第二捕獲實體的方法的仍另一優選的實施方案中，在用于檢測樣品中多表位靶分析物和/或用于確定樣品中多表位靶分析物的濃度的測試中待使用的第一與第二捕獲實體的比例為η-1至I，其中η為多表位靶分析物上相同表位的數目。
[0012]在方法的進一步優選的實施方案中，使包含多表位靶分析物的樣品在添加檢測顆粒之前與第一和/或第二捕獲實體接觸。
[0013]在本發明的另一優選實施方案中，第一捕獲實體和/或第二捕獲實體為抗體、抗體片段(諸如Fab片段)、DNA分子、RNA分子或非免疫球蛋白。
[0014]在進一步優選的實施方案中，非免疫球蛋白為經設計的錨蛋白重復蛋白(DARPin)、affi body 分子、adnec tin、anti cal in、affi I in、avimer、knottin、fynomer、phylomer 或 kunitzii^jfto
[0015]在仍另一優選的實施方案中，如上所提及的樣品中多表位靶分析物的檢測和/或樣品中多表位靶分析物濃度的確定在系統中執行，包括以下步驟:
-結合多表位靶分析物至檢測顆粒，
-使結合到多表位靶分析物的檢測顆粒與系統的傳感器表面接觸；
-允許多表位靶分析物的不同(非相同或不相似的)表位通過系統的傳感器表面上所存在的第三捕獲實體而結合；以及-檢測傳感器表面上剩余的顆粒。
[0016]在特別優選的實施方案中，檢測顆粒是磁顆粒。
[0017]在進一步優選的實施方案中，樣品中多表位靶分析物的檢測和/或樣品中多表位靶分析物濃度的確定在光磁系統中執行，并且光學檢測在靜止的樣品流體中。
[0018]在優選的實施方案中，如本文上述定義的方法另外包括在檢測之前磁致動磁顆粒的步驟。
[0019]在進一步的方面中，本發明涉及使用可以特異性結合到包含兩個或多個相似或相同表位的多表位分析物上的至少一個表位的第一捕獲實體以阻斷至少一個表位結合到檢測顆粒。特別優選的是檢測顆粒為磁檢測顆粒。
[0020]在如本文上述定義的方法或用途的特別優選的實施方案中，多表位分析物是CRP或D-二聚體。
【附圖說明】
[0021]圖1示出FTIR檢測的原理。來自光源的光進入筒，從筒/流體界面反射并且在檢測器上成像。如果顆粒存在于該界面上所產生的漸逝場中，則反射光強度降低。
[0022I圖2示出使用Magnotech技術的夾心免疫測定。在區段(I)中，涂敷有針對革El的一級抗體的磁顆粒分散于樣品液體中并且結合靶。在區段(2)中，頂部和底部線圈以脈沖方式致動磁顆粒，導致結合至傳感器表面，在那里二級抗體可以結合到所結合的靶分子。在區段
(3)中，從傳感器表面去除未結合的顆粒，并且使用漸逝場檢測所結合的顆粒。
[0023]圖3示出用于磁顆粒夾心測定的反應圖示。兩個不同的捕獲分子(以不同灰影指示)可以結合到靶分子上的不同表位。
[0024]圖4提供五聚靶分子(例如CRP)的示意圖。黑色半圓描繪第一捕獲分子(涂敷在磁顆粒上)的結合位點，灰色半圓代表第二捕獲分子(涂敷在傳感器表面上)的結合位點。
[0025]圖5示出群聚過程的示意圖，其由存在相同靶分子/復合體上的磁顆粒上的捕獲分子的多個結合位點所導致。
[0026]圖6描繪反應圖示，其描述了多聚靶(黑色五聚體)的夾心免疫測定。靶與捕獲分子的混合物反應，其中一部分攜帶獨特標記(正方形)。所形成的復合體隨后與可以結合到標記的捕獲分子官能化的磁顆粒反應。最后，具有捕獲的靶分子的磁顆粒與傳感器表面接觸，在那里另一捕獲分子(淺灰色)可以結合到靶分子上的不同表位。
[0027]圖7示出在一次性筒中免疫測定發生的不同過程的圖示。
【具體實施方式】
[0028]本發明涉及在多聚或多表位靶分子存在的情況下防止顆粒群聚的手段和方法。
[0029]盡管本發明將關于具體實施方案進行描述，但是該描述不應理解為限制性含義。
[0030]在詳細描述本發明的示例性實施方案之前，給出對于理解本發明重要的定義。
[0031 ]如本說明書和所附權利要求中所用的，“一個”和“一種”的單數形式也包括相應復數，除非上下文另外明確地說明。
[0032]在本發明的上下文中，術語“約”和“大約”指本領域技術人員將理解以仍舊確保所討論的特征的技術效果的精確度的區間。該術語通常指示從所示數值的±20 %、優選地±15 %、更優選地±10 %、并且甚至更優選地±5 %的偏差。
[0033]應理解術語“包含”不是限制性的。對于本發明的目的，術語“由……組成”理解為術語“包含”的優選實施方案。如果下文中將組定義為包含至少一定數目的實施方案，則這意指還涵蓋優選僅由這些實施方案組成的組。
[0034]此外，說明書和權利要求中術語“第一”、“第二”、“第三”或〃(a)〃、〃(b)〃、〃(c)〃、〃(d) 〃等用于在相似要素之間進行區分并且不一定用于描述相繼次序或時間次序。應理解如此所用的術語在合適情況下可互換并且本文描述的本發明的實施方案能夠以不同于本文描述或所示的其他順序操作。
[0035]在術語“第一”、“第二”、“第三”或〃(a) 〃、〃(b) 〃、〃(c) 〃、〃(d) 〃、〃i〃、〃i i〃等涉及方法或用途或測定的步驟的情況下，在步驟之間不存在時間或時間間隔相干性，即步驟可以同時進行或可以在此類步驟之間存在秒、分鐘、小時、天、周、月或甚至年的時間間隔，除非如上下文所述的本申請中另有說明。
[0036]應理解本發明不限于本文所述的特定方法、方案、試劑等，因為這些可以改變。還應理解本文所用的術語僅用于描述具體實施方案的目的，并且不旨在限定僅由所附權利要求限定的本發明的范圍。除非另有定義，否則本文使用的所有技術和科學術語具有如本領域普通技術人員通常理解的相同含義。
[0037]如上文已經所述的，本發明在一方面涉及在用于檢測樣品中包含兩個或多個相似或相同表位的多表位靶分析物和/或用于確定樣品中所述多表位靶分析物的濃度的測試中防止檢測顆粒聚集的方法，其中所述方法包括應用能夠特異性結合到所述多表位分析物上的至少一個表位的第一捕獲實體的步驟，其特征在于所述第一捕獲實體阻斷至少一個表位結合到檢測顆粒。
[0038]如本文所用的術語“檢測顆粒”意指小的、局部化的物體，物理性質，諸如體積或質量，可以歸因于它。在本發明的上下文中，檢測顆粒包含本領域技術人員已知的任何合適的材料或由其組成，例如檢測顆粒可以包含無機或有機材料，或由其組成或基本上由其組成。通常，檢測顆粒可以包含金屬或金屬合金、或有機材料，或由其組成或基本上由其組成，或者包含碳水化合物要素，或由其組成或基本上由其組成。預期到的材料的示例包括瓊脂糖、聚苯乙烯、膠乳、聚乙烯醇、二氧化硅和鐵磁金屬、合金或復合材料。特別優選的是磁或鐵磁金屬、合金或組合物。本發明中有用的特別優選的檢測顆粒是超順磁顆粒。如本文所用的術語“超順磁”描述磁性形式，其以小的鐵磁或鐵磁納米顆粒呈現。本領域已知在足夠小的納米顆粒中，在溫度影響下磁化可以隨機翻轉方向。兩次翻轉之間的時間稱為Ν?θ?弛豫時間。在不存在外部磁場的情形下，當用于測量納米顆粒的磁化的時間比Ngel弛豫時間長得多時，磁化呈現為平均為零，即處于順磁狀態。在這種狀態下，外部磁場能夠將納米顆粒類似地磁化為順磁體。然而，磁化率比順磁體的那些要大得多。
[0039]在本發明的具體實施方案中，磁顆粒可以為含鐵的磁顆粒。在其他實施方案中，磁顆粒可以包含氧化鐵，如Fe3O4或Fe2O3或鐵鉑。還預期到具有N1、Co和Cu的合金或包含這些元素的顆粒。在進一步的實施方案中，磁顆粒可以包含一定數量的