用于檢測貓杯狀病毒IgG抗體的ELISA試劑盒及其檢測方法
【專利摘要】用于檢測貓杯狀病毒IgG抗體的ELISA試劑盒及其檢測方法，它涉及一種用于檢測貓杯狀病毒的試劑盒及其檢測方法。它解決了目前貓杯狀病毒診斷和檢測結果不理想的問題。試劑盒包括ELISA微孔板、酶標二抗和底物顯色液。方法：一、稀釋加入ELISA微孔板孵育；二、加入酶標二抗孵育；三、加入底物顯色液，室溫避光反應；四、加入終止液終止反應，酶標儀檢測450nm吸光值與ELISA試劑盒的Cut Off值進行比較，即得出檢測結果。本發明ELISA試劑盒檢測結果重復性穩定性高、速度快。
【專利說明】
用于檢測貓杯狀病毒I gG抗體的EL ISA試劑盒及其檢測方法
技術領域
[0001 ]本發明涉及一種用于檢測貓杯狀病毒的試劑盒及其檢測方法。
【背景技術】
[0002] 貓杯狀病毒(Feline calicivirus，FCV)為杯狀病毒科，水瘡性病毒屬，是一種單 鏈RNA病毒。FCV是貓病毒性呼吸道傳染病主要表現為口腔潰瘍、眼鼻分泌物增多、流涎、結 膜炎、羞明、口腔炎、氣管炎、支氣管炎，伴有雙相熱。是貓的多發病，發病率高，強毒株感染 可發生肺炎、呼吸困難、甚至死亡。主要傳染源為病貓和帶毒貓，病貓在急性期可隨分泌物 和排泄物排出大量病毒，直接傳染易感貓;帶毒貓經治療，癥狀可消失，臨床康復后仍長期 排毒，是危險的傳染源。
[0003] 根據病史、臨床癥狀和流行特點進行診斷常常誤診，延誤治療并導致病毒的擴散 和傳播。而目前貓杯狀病毒抗體的檢測使用的是血清中和試驗和間接免疫熒光等方法，檢 測耗時，重復性差、且多為實驗室內部應用，缺少統一的標準。

【發明內容】

[0004] 本發明的目的是為了解決目前貓杯狀病毒診斷和檢測結果不理想，而提供的一種 用于檢測貓杯狀病毒IgG抗體的ELISA試劑盒及其檢測方法。
[0005] 本發明用于檢測貓杯狀病毒IgG抗體的ELISA試劑盒包括ELISA微孔板、酶標二抗 和底物顯色液;其中，ELISA微孔板內包含已包被的可溶性表達的貓杯狀病毒0RF2重組蛋白 F〇
[0006] 其中，可溶性表達的FCV基因0RF2重組蛋白F的制備方法：
[0007] 根據Genbank中登錄的貓杯狀病毒(FCV)VPl基因序列(Genbank:X99445.1)設計擴 增貓杯狀病毒0RF2的F區RNA片段的上游引物SacI:5'-ATT GAG CTC CTG GGT TAC ACA GGA AIT GGT-3'，和下游引物XholI:5'-ATA CTC GAG TCA TAA ITT TGT CAT ACT ACT-3'，并采 用PCR方法進行擴增，再將擴增的基因片段克隆到載體pET-32a中構建重組質粒，測序驗證 無誤后轉入表達宿主菌E. coli BL21 (DE3)中用IPTG誘導表達，條件為：菌液于37°C搖床搖 至對數生長期(0D590nm值為0.4~0.6)加入IPTG至終濃度0.5mM，誘導溫度為20°C，誘導時 間為7h，獲得可溶性表達的貓杯狀病毒0RF2重組蛋白F，貓杯狀病毒0RF2重組蛋白F的氨基 酸序列為 VTLALLGYTGIGEQAIGSDRDRVVRISVLPETGARGGNHPIFYKNTIKLGYVIRSIDVFNS QILHTSRQLSLNHYLLPPDSFAVYRIIDSNGSWFDIGIDSDGFSFVGVSSLPTLEFPLSASYMGIQLAKIRLASNIR SSMTKL〇
[0008] ELISA微孔板的制備方法：
[0009] 用pH值為9.6的濃度為0.05mol/L的碳酸鹽緩沖液作為包被緩沖液，將純化后的貓 杯狀病毒0RF2重組蛋白F稀釋后，按lOOiil/孔加入微孔板，保證每孔中重組蛋白F的含量為 0.2yg; 4°C包被過夜，次日棄去包被液，再按100yl/孔加入濃度為5 %的脫脂乳封閉液，37 °C 靜置2h，然后洗滌甩干、室溫干燥后裝入包裝袋，加入干燥劑，真空保存。
[0010] lOOOmL 包被緩沖液由 1 ? 5g 的Na2C〇3、2 ? 9g 的 NaHC〇3加ddH2〇7K溶解，調節 pH 值至9 ? 6 后加余量的水制成。
[0011] 用上述ELISA試劑盒檢測貓杯狀病毒的方法：
[0012] 一、將待測血清用抗體稀釋液按血清終點滴度稀釋，然后按每孔lOOiil加入ELISA 微孔板，37 °C孵育lh，再用抗體稀釋液清洗3~5次；
[0013] 二、每孔加入稀釋的酶標二抗100yl，37°c孵育lh，再用抗體稀釋液清洗3~5次；
[0014] 三、每孔加入底物顯色液50yl，室溫避光反應10~15min;
[0015] 四、每孔加入50yl終止液終止反應，酶標儀檢測450nm吸光值與ELISA試劑盒的Cut Off值進行比較，即得出檢測結果。
[0016] Cut Off值為陽性與陰性結果的臨界值。
[0017]上述ELISA試劑盒的Cut Off值確立方法：以不同來源的貓杯狀病毒陽性血清逐級 稀釋作為一抗、以TOS緩沖液作為陰性對照，每個陽性血清稀釋度檢測N次;然后將與陰性對 照呈差異顯著的最大稀釋梯度作為血清終點滴度，不同來源的貓杯狀病毒陽性血清的血清 終點滴度0D45Q?均值+3XSD為ELISA試劑盒的Cut Off值。
[0018] FCV基因組為單股正鏈RNA，大小約為7.81cb左右，其RNA5'端共價結合有VPg蛋白， FCV基因組包含三個0RF(0pen Reading Frame)，分別為0RF1、0RF2、0RF3 ARF2主要編碼FCV 的衣殼蛋白，其翻譯能夠得到75KD的衣殼蛋白前體蛋白，前體蛋白經過病毒的蛋白酶切割 掉14kd的前導蛋白（IX)，得到成熟的62KD左右的成熟衣殼蛋白VPUFCV的衣殼蛋白根據不 同株之間的相似性可分為六個區域，主要分為A、B、C、D、E、F區。
[0019] 本發明所選貓杯狀病毒檢測抗原為0RF2的F區重組蛋白F，F區位于衣殼蛋白的高 度保守的羧基末端，位于病毒表面，為非中和抗體結合位點；因此0RF2重組蛋白F為貓杯狀 病毒的結構蛋白之一，具有高抗原性，氨基酸保守性達89.0%~100 %，是抗原優勢蛋白， 其特異性好、重復穩定性高。
[0020] 本發明采用間接E1ISA法檢測貓杯狀病毒，將0RF2重組蛋白F包被于ELISA微孔板 中，然后用5%的脫脂乳將酶標板封閉，加入待測樣品。待測樣品中的貓杯狀病毒IgG抗體能 與酶標板中包被的0RF2重組蛋白F反應，形成F抗原-抗體復合物，酶標抗體加入后與之結 合，再通過底物顯色液顯色，終止液終止反應。利用酶標儀在450nm波長下測定吸光度值，0D 值的大小與待測樣品中貓杯狀病毒IgG抗體的含量成正比。
[0021]由于FCV感染率高，難以采集到足夠的陰性血清樣本，所以無法采用陰性血清樣本 的0D45Qnm吸光值標定ELI SA判定標準。本發明中采用血清終點滴度法確立了本發明方法的 Cut Off值和判定標準，具有準確、可靠的優點。
[0022]本發明具有操作耗時時間短，快速的優點。免疫熒光檢測對于熒光的強弱主觀意 識過重，而本發明方法檢測結果非主觀判斷，檢測結論更為明確清晰。
【附圖說明】
[0023] 圖1是0RF2重組蛋白A、B、CD、E、F的間接ELI SA分析結果圖。
[0024] 圖2是實施例3中1號貓血清樣本間接免疫熒光試驗結果圖。
[0025] 圖3是實施例3中18號貓血清樣本間接免疫熒光試驗結果圖。
[0026] 圖4是實施例3中2號貓血清樣本間接免疫熒光試驗結果圖。
【具體實施方式】
[0027]本發明技術方案不局限于以下所列舉【具體實施方式】，還包括各【具體實施方式】間的 任意組合。
[0028]【具體實施方式】一：本實施方式用于檢測貓杯狀病毒IgG抗體的ELISA試劑盒包括 ELI SA微孔板、酶標二抗和底物顯色液;其中，ELI SA微孔板內包含已包被的可溶性表達的貓 杯狀病毒0RF2重組蛋白F。
[0029]本實施方式中可溶性表達的FCV基因0RF2重組蛋白F的制備方法：
[0030] 根據Genbank中登錄的貓杯狀病毒(FCV)VPl基因序列(Genbank:X99445.1)設計擴 增貓杯狀病毒0RF2的F區RNA片段的引物，并采用PCR方法進行擴增，再將擴增的基因片段克 隆到載體pET-32a中構建重組質粒，測序驗證無誤后轉入表達宿主E.coli BL21 (DE3)中用 IPTG誘導表達;然后優化截短蛋白表達的誘導條件一一具體如何操作、參數是多少，獲得可 溶性表達的貓杯狀病毒0RF2重組蛋白F。
[0031]本實施方式中ELISA微孔板的制備方法：
[0032]用pH值為9.6的濃度為0.05mol/L的碳酸鹽緩沖液作為包被緩沖液，將純化后的貓 杯狀病毒0RF2重組蛋白F稀釋后，按lOOixl/孔加入微孔板，保證每孔中重組蛋白F的含量為 0.2yg; 4°C包被過夜，次日棄去包被液，再按100yl/孔加入濃度為5 %的脫脂乳封閉液，37 °C 靜置2h，然后洗滌甩干、室溫干燥后裝入包裝袋，加入干燥劑，真空保存。
[0033] 1000mL包被緩沖液由1.5g的Na2C03、2.9g的NaHC0 3加ddH20水溶解，調節pH值至9.6 后加余量的水制成。
[0034]【具體實施方式】二:本實施方式與【具體實施方式】一的不同點是：用于檢測貓杯狀病 毒IgG抗體的ELISA試劑盒還包括終止液，終止液為硫酸溶液。其它步驟及參數與實施方式 一相同。
[0035]本實施方式中終止液為濃度是2mo 1 /L的硫酸溶液。
[0036]【具體實施方式】三:本實施方式與【具體實施方式】一或二的不同點是:底物顯色液為 TMB顯色液。其它步驟及參數與實施方式一或二相同。
[0037]【具體實施方式】四：本實施方式與【具體實施方式】一至三之一的不同點是:酶標二抗 為辣根過氧化物酶標記的山羊抗貓IgG。其它步驟及參數與實施方式一至三之一相同。 [0038]【具體實施方式】五:本實施方式與【具體實施方式】一至四之一的不同點是：用于檢測 貓杯狀病毒IgG抗體的ELISA試劑盒還包括抗體稀釋液。其它步驟及參數與實施方式一至四 之一相同。
[0039] 本實施方式中抗體稀釋液為pH值7.4的PBST，具體配置如下：1000ml溶液中含有液 0? 27g的KH2P〇4、3? 58g的Na2P〇4 ? 12H20、8? 0g的NaCI、0? 2g的KCL、0? 5ml的Tween-20和余量的 蒸餾水制成。
[0040]【具體實施方式】六:本實施方式用本發明ELISA試劑盒檢測貓杯狀病毒的方法：
[00411 一、將待測血清用抗體稀釋液按血清終點滴度稀釋，然后按每孔l00yl加入ELISA 微孔板，37 °C孵育lh，再用抗體稀釋液清洗3~5次；
[0042] 二、每孔加入稀釋的酶標二抗100y 1，37 °C孵育1 h，再用抗體稀釋液清洗3~5次；
[0043] 三、每孔加入底物顯色液50yl，室溫避光反應10~15min;
[0044] 四、每孔加入50yl終止液終止反應，酶標儀檢測450nm吸光值與ELISA試劑盒的Cut Off值進行比較，即得出檢測結果。
[0045] 本實施方式步驟一設重復孔。酶標二抗為辣根過氧化物酶標記的山羊抗貓lgG，酶 標二抗稀釋倍數為5000倍。終止液是濃度為2mol/L的硫酸溶液。底物顯色液為TMB顯色液。 ELI SA微孔板內包含已包被的可溶性表達的FCV基因0RF2重組蛋白F。
[0046] 本實施方式中ELISA試劑盒的Cut Off值為0.295。待測血清樣本的0D值彡0.295， 則該樣本為貓杯狀病毒IgG抗體陰性;待測血清樣本的0D值>0.295，則該樣本為貓杯狀病毒 IgG抗體陽性。
【具體實施方式】 [0047] 七:本實施方式與六的不同點是：以不同來源的貓杯 狀病毒陽性血清逐級稀釋作為一抗、以PBS緩沖液作為陰性對照，每個陽性血清稀釋度檢測 N次;然后將與陰性對照呈差異顯著的最大稀釋梯度作為步驟一的血清終點滴度。其它步驟 及參數與實施方式六相同。
[0048] 本實施方式中N>3。
【具體實施方式】 [0049] 八:本實施方式與七的不同點是:貓杯狀病毒陽性血 清逐級稀釋比例為 1:100、1:200、1:400、1:800，1:1600、1:3200、1:6400、1:12800、1: 21600 和1:51200。其它步驟及參數與實施方式七相同。
【具體實施方式】 [0050] 九：本實施方式ELISA試劑盒的Cut Off值確立方法：以不同來源的 貓杯狀病毒陽性血清逐級稀釋作為一抗、以PBS緩沖液作為陰性對照，每個陽性血清稀釋度 檢測N次;然后將與陰性對照呈差異顯著的最大稀釋梯度作為血清終點滴度，不同來源的貓 杯狀病毒陽性血清的血清終點滴度0D4 5Qr?均值+3XSD為ELISA試劑盒的Cut Off值。
[0051] 本實施方式中N多3。本實施方式選用20份來源不同的貓杯狀病毒陽性血清進行試 驗。
[0052] 實施例1
[0053] 利用分子生物學軟件對FCV 2280株（ATCC編號VR-2057，）VP1蛋白（GenBank: KC835209.1) A、B、⑶、E、F分區進行抗原性、可接近性、親水性、主鍵柔韌性、抗原表位的定位 等方面的分析。
[0054] 軟件DNAstar分析結果表明VP1蛋白的B區（125aa~397aa)、E區（426aa~524aa)、F 區（524aa~668aa)均具有較高的抗原性。
[0055] 軟件Megalingn分析結果顯示氨基酸保守性分別是B區為90.2%~100%4區為 67.7%~100%、F區為89.0%~100%。
[0056] 根據Genbank中登錄的貓杯狀病毒(FCV)VPl基因序列(Genbank:X99445.1)設計擴 增貓杯狀病毒0RF2的A、B、CD、E、F區RNA片段的引物，并采用PCR方法進行擴增，再將擴增的 基因片段克隆到載體pET-32a中構建重組質粒，測序驗證無誤后轉入表達宿主E.coli BL21 (DE3)中用IPTG誘導表達;然后優化截短蛋白表達的誘導條件。貓杯狀病毒0RF2重組蛋白A、 CD誘導條件:菌液于37°C搖床搖至對數生長期，即0D590nm值為0.4~0.6之間，加入IPTG終 濃度為O.lmM，誘導溫度為16°C，誘導時間為9h。貓杯狀病毒0RF2重組蛋白B、E、F誘導條件： 菌液于37°C搖床搖至對數生長期，即0D590nm值為0.4~0.6之間，加入IPTG至終濃度為 0.5mM，誘導溫度為20°C，誘導時間為7h。最終獲得可溶性表達的分截斷的貓杯狀病毒0RF2 重組蛋白。
[0057] 利用Ni-NTA HIS Bind Resin對表達的重組蛋白進行純化，并采用BCA法測定蛋白 濃度。純化的0RF2重組蛋白等量上樣(每孔11.7ug)，以貓杯狀病毒質控陽性血清（1:500)作 為一抗，HRP標記的山羊抗貓IgG(l: 5000)作為二抗，進行Western blot分析，0RF2重組蛋白 B、E、F分別在相應蛋白大小處獲得特異性蛋白條帶，而0RF2重組蛋白A、CD在預期大小處蛋 白條帶顯色較淺，實驗結果表明0RF2重組蛋白B、E、F具有良好的抗原性。用ImageJ軟件測定 的0RF2重組蛋白A、B、CD、E、F的免疫印記灰度值分別為0、17123、0、18366、19471。統計學軟 件分析結果表明0RF2重組蛋白B、E、F與重組蛋白A、⑶差異顯著(P〈0.05)。以上結果與分子 生物學軟件抗原性預測結果相符，可初步確定重組蛋白B、E、F為抗原優勢蛋白。
[0058] 再以0RF2重組蛋白A、B、CD、E、F作為包被抗原，同濃度（2μg/ml)包板，每孔100yl， 以FCV陽性質控血清（1:12800稀釋)作為一抗，以1:5000稀釋的HRP標記的山羊抗貓IgG作為 二抗，并設陰性質控血清對照、空白對照。每孔均設兩個平行對照，測定〇D45(U直。根據S/N值 大小判斷重組蛋白18、〇)4、 17的抗原性強弱，8次重復操作后進行統計學檢驗。結果表明 0RF2重組蛋白F的0D 45QS/N值最高，與其它四個重組蛋白差異性顯著(P〈0.05)(如圖1所示）。 [0059] 結合生物信息學軟件DNAstar及Western Blot抗原性分析結果，確定0RF2重組蛋 白F為FCV VP1優勢抗原片段。
[0060]陽性質控血清:經疫苗免疫后貓血清再經56°C、30min補體滅活處理。
[0061]陰性質控血清:未患病且未經免疫的貓血清再經56°C、30min補體滅活處理。
[0062] 實施例2
[0063]取貓細小病毒、貓皰疹病毒、貓傳染性鼻支氣管炎病毒、貓傳染性腹膜炎病毒和貓 杯狀病毒共五份病毒陽性血清，用本發明檢測貓杯狀病毒IgG抗體的ELISA試劑盒進行檢 測。只有貓杯狀病毒陽性血清檢測結果為陽性，其余四份血清樣本均顯示為陰性，實驗證明 本發明檢測貓杯狀病毒IgG抗體的ELI SA試劑盒的特異性良好。
[0064]采用不同批次包被的ELISA微孔板進行操作，變異系數為0.05 %~0.26 %，小于 10%，證明本發明檢測貓杯狀病毒IgG抗體的ELISA試劑盒的批間重復穩定性高。
[0065]采用同一批次包被的ELISA微孔板進行操作，變異系數為0.01 %~0.06 %，小于 10%，證明本發明檢測貓杯狀病毒IgG抗體的ELISA試劑盒的批內重復穩定性高。
[0066] 實施例3
[0067]將20份來源不同的貓血清分別做間接ELISA實驗(采用本發明試劑盒進行檢測）、 中和試驗及間接免疫熒光實驗。
[0068] 實驗結果如表1所示，間接ELISA實驗的Cut Off值為0.295。
[0069]表1

[0071] 1號、18號和2號貓血清樣本間接免疫熒光試驗結果分別如圖2、圖3和圖4所示。
[0072]采用本發明試劑盒的檢測結果與中和試驗檢測結果的符合率為95%;與間接免疫 熒光試驗檢測結果的符合率為100 %。
【主權項】
1. 用于檢測貓杯狀病毒IgG抗體的ELISA試劑盒，其特征在于用于檢測貓杯狀病毒IgG 抗體的ELI SA試劑盒包括ELI SA微孔板、酶標二抗和底物顯色液;其中，ELI SA微孔板內包含 已包被的可溶性表達的貓杯狀病毒0RF2重組蛋白F。2. 根據權利要求1所述的用于檢測貓杯狀病毒IgG抗體的ELISA試劑盒，其特征在于用 于檢測貓杯狀病毒IgG抗體的ELISA試劑盒還包括終止液，終止液為硫酸溶液。3. 根據權利要求1或2所述的用于檢測貓杯狀病毒IgG抗體的ELISA試劑盒，其特征在于 底物顯色液為TMB顯色液。4. 根據權利要求3所述的用于檢測貓杯狀病毒IgG抗體的ELISA試劑盒，其特征在于酶 標二抗為辣根過氧化物酶標記的山羊抗貓IgG。5. 根據權利要求1或2所述的用于檢測貓杯狀病毒IgG抗體的ELISA試劑盒，其特征在于 用于檢測貓杯狀病毒IgG抗體的ELISA試劑盒還包括抗體稀釋液。6. 用權利要求1所述ELISA試劑盒檢測貓杯狀病毒的方法，其特征在于檢測方法按以下 步驟進行： 一、 將待測血清用抗體稀釋液按血清終點滴度稀釋，然后按每孔lOOyl加入ELISA微孔 板，37 °C孵育lh，再用抗體稀釋液清洗3~5次； 二、 每孔加入稀釋的酶標二抗1〇〇μ1，37Γ孵育lh，再用抗體稀釋液清洗3~5次； 三、 每孔加入底物顯色液50μ1，室溫避光反應10~15min; 四、 每孔加入50μ1終止液終止反應，酶標儀檢測450nm吸光值與ELISA試劑盒的Cut Off 值進行比較，即得出檢測結果。7. 根據權利要求6所述的檢測貓杯狀病毒的方法，其特征在于以不同來源的貓杯狀病 毒陽性血清逐級稀釋作為一抗、以PBS緩沖液作為陰性對照，每個陽性血清稀釋度檢測N次； 然后將與陰性對照呈差異顯著的最大稀釋梯度作為步驟一的血清終點滴度。8. 根據權利要求7所述的檢測貓杯狀病毒的方法，其特征在于貓杯狀病毒陽性血清逐 級稀釋比例為 1:1〇〇、1:200、1:400、1:800,1:1600、1:3200、1:6400、1:12800、1:21600和 1: 51200。9. 權利要求1所述ELISA試劑盒的Cut Off值確立方法，其特征在于以不同來源的貓杯 狀病毒陽性血清逐級稀釋作為一抗、以PBS緩沖液作為陰性對照，每個陽性血清稀釋度檢測 N次;然后將與陰性對照呈差異顯著的最大稀釋梯度作為血清終點滴度，不同來源的貓杯狀 病毒陽性血清的血清終點滴度〇D45Qr?均值+3XSD為ELISA試劑盒的Cut Off值。
【文檔編號】G01N33/569GK106053801SQ201610382614
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年6月1日
【發明人】劉家森, 曲連東, 田進, 劉大飛, 劉春國, 郭東春, 李志杰, 劉明, 姜騫, 胡曉亮, 康洪濤, 吳紅霞
【申請人】中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所