一種百合草莓潛隱環斑病毒半定量檢測金標卡及制備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種對百合病毒快速半定量檢測的金標卡及制備方法，具體指運用膠體金免疫層析法研制出能快速半定量檢測百合草莓潛隱環斑病毒(SLRSV)的金標卡及其制備方法。
【背景技術】
[0002]百合(Lilium spp.)是百合科(Liliaceae)百合屬(Lilium)多年生宿根單子葉草本植物，是世界著名的球根花卉，栽培歷史悠久，集觀賞、食用和藥用于一體;荷蘭作為世界上最大的花卉種植大國，其百合的切花及種球產業發展較為成熟;在中國，食用和藥用百合產業發展較好，主要產區在甘肅、湖南和湖北，主要品種為蘭州百合、龍牙百合(野百合)等；對于切花百合，近年來，隨著我國觀賞百合種植面積的迅速增加，從國外引進種球的數量和批次數目不斷增長，影響百合生產的病毒病在各百合種植區普遍流行。
[0003]目前文獻報道侵染百合的病毒有20多種，除百合斑駁病毒(Lilymottle virus,LMoV)，黃瓜花葉病毒(Cucumber mosaic virus, CMV)和百合隱癥病毒(Lily symptomlessvirus, LSV)外，草莓潛隱環斑病毒(Strawberry latent ringspot virus, SLRSV)也被證實可侵染百合。于翠等(2008)對來自荷蘭的進口百合種球樣品進行了病毒的DAS-ELISA檢測，發現30個樣品中，有6個樣品檢測到SLRSV的侵染，侵染率達20.0%。
[0004]SLRSV隸屬于伴生5工豆病毒科(Secoviridae)溫州蜜柑矮縮病毒屬(Sadwavirus)，是薔薇科果實類作物上的重要病毒之一，也是國家質檢總局發布的重要檢疫性有害生物；該病害主要分布在歐洲、美國和俄羅斯等地區；SLRSV寄主范圍廣泛，可以侵染27科130種植物，病毒侵染植株后，主要表現為葉片褪綠、畸形、植株矮化、產量以及品質下降等現象，嚴重時可引起毀滅性災害;SLRSV主要通過長劍線蟲(Xiphinema sp.)傳播，此外，機械、嫁接和種子也可傳播;SLRSV是單鏈的RNA病毒，病毒粒子形態為球狀，大小相等，直徑30nm，通常有明顯的六邊形輪廓;SLRSV CP蛋白包含大小兩種亞基，
分子量分別約為43.0和26.0 kDa。
[0005]目前關于SLRSV的檢測研究，有雙抗體酶聯免疫吸附法(DAS-ELISA)、免疫吸附電鏡以及聚合酶鏈式反應(PCR)等的相關報道，但以上方法都還停留在研究和實驗室階段，無法滿足百合種植現場及田間快速檢測的需求，從而無法掌握田間病毒感染的準確信息。此夕卜，這兩種傳統實驗室檢測方法都需要專業人員用專門的儀器設備在實驗室花很長時間才能完成，其程序復雜，檢測費用高、對儀器設備和檢測條件要求高，因此使用范圍受到很大的局限。
[0006]膠體金免疫層析方法利用抗原抗體的結合，以及膠體金呈現顏色反應來檢測抗原或抗體;該方法可以避免以上幾種檢測方法的缺點，以其特異性強、成本低、操作簡便、適合現場快速檢測等優點已被廣泛接受，已用于包括煙草斑駁病毒、南瓜花葉病毒等多種植物病毒的檢測。
[0007]對于百合病毒，目前雖有用膠體金免疫層析法檢測LMoV和LSV等的相關報道(Zhang et al., 2015, J Virol Methods , 220)，但是其只能進行定性檢測，也就是說檢測結果僅能定性判斷病毒的有或無，對于陽性結果無法得知被檢樣品病毒含量的差異，田間防治病毒時依舊盲目而缺乏科學依據，從而阻礙了該方法的廣泛普及與推廣。
[0008]近年來，通過我們對田間感病毒程度不同的百合葉片葉綠體超微結構、光合色素含量、防御酶活性等生理生化指標的測定和分析，發現許多陽性植株通常無明顯癥狀，其葉綠體結構、光合色素含量以及株高、莖粗、葉片形狀等生長指標與健康植株沒有差異;而部分陽性植株葉片形成了輕微的斑駁條紋，葉綠體結構被部分破壞，光合色素含量以及株高、莖粗等生長指標顯著低于健康植株;也發現少量的陽性植株出現了明顯的斑駁條紋或壞死斑，葉片嚴重變小，植株嚴重矮化，生理測定發現其葉綠體結構被嚴重破壞，光合色素含量顯著低于健康植株(Zhang et al., 2014, Philipp Agric Scientist, 97(1));進一步通過對病毒含量的Real-time PCR檢測，證實出現嚴重癥狀的陽性植株，其病毒相對含量是無癥狀陽性植株的 1000倍以上(Zhang et al., 2014, Philipp Agric Scientist, 97(2));以上實驗結果說明病毒含量的差異對百合生長影響的差異較大，所以對于感病程度不同的陽性植株應該采取不同的策略，科學管理、合理防治，最大程度降低病毒對百合生長的危害;可見，檢測病毒含量的差異將對田間病毒管理起到非常重要的指導意義。
[0009]然而，目前對于百合病毒的防治主要以殺滅傳播介體-蚜蟲為主，對于如何科學地噴施抗百合病毒藥劑，噴施抗病毒藥劑后百合病毒增殖是否被抑制，若已抑制，抑制的程度如何等問題均沒有相關報道，而這些問題的解決首先依賴于半定量檢測；因此，實現半定量檢測的意義重大。
[0010]本發明為了進一步提高膠體金免疫層析檢測方法的使用效率和田間普及率，實現對百合病毒的快速且半定量檢測，通過一系列優化試驗，將半定量檢測應用于膠體金免疫層析試驗，首先將檢測線增加至三條，再將已知量的有濃度差異的抗體分別包被于檢測線，研制能快速半定量檢測SLRSV的金標卡，滿足百合大規模脫毒及商業和田間對百合病毒快速檢測的需求。

【發明內容】

[0011]本發明的目的在于客服現有技術的不足，提供一種用膠體金免疫層析法半定量檢測SLRSV的金標卡及其制備方法。
[0012]本發明金標卡檢測準確率高，特異性強，重復性好，操作簡便，無需借助其他儀器和設備，5?10分鐘便可以判定被檢樣品SLRSV含量的差異。
[0013]本發明的技術方案如下:
一種半定量檢測百合草莓潛隱環斑病毒的金標卡，包括:金標卡槽I，襯板12，樣品墊8，膠體金結合墊9，硝酸纖維素膜10，吸水濾紙11，金標卡槽I包括上殼體和下殼體，上殼體和下殼體通過卡扣連接，上殼體設有加樣孔2和反應窗3，樣品墊8置于加樣孔2下方，硝酸纖維素膜10置于反應窗3下方，膠體金結合墊9上含有金標探針，襯板12固定于金標卡槽I中，樣品墊8、膠體金結合墊9、硝酸纖維素膜10和吸水濾紙11依次排列連接于襯板12上表面，硝酸纖維素膜10上設有第一檢測線4、第二檢測線5、第三檢測線6和對照線7，第一檢測線4、第二檢測線5、第三檢測線6上分別包被的是不同濃度的兔抗SLRSV IgG，對照線7上包被的是羊抗兔IgG，第一檢測線4、第二檢測線5、第三檢測線6上SLRSV IgG包被量分別為2.0?2.5pg、1.0?1.25 yg和2.0?2.5 yg蛋白，金標探針抗體標記量為22yg/mL，羊抗兔IgG包被量為2.0?2.5yg蛋白。
[0014]其中在用所述金標卡檢測時，在所述加樣孔處加入百合樣品的待檢溶液，對比反應窗內檢測線4、5、6和對照線