熒光納米探針及其制備方法和用于食品中多種危害因子同步檢測的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及食品檢測領域，特別是一種熒光納米探針，該熒光納米探針的制備方法，以及用于食品中多種危害因子同步檢測的方法。
【背景技術】
[0002]食品中危害因子檢測一直是食品安全領域中的重要課題，但目前能夠靈敏、穩定可靠、快速簡便、低成本地監控乳品中常見的危害因子的方法，實現對乳品中高頻危害因子實現一步“全檢測”的技術仍然缺乏。
[0003]如乳品中常見的“高頻危害因子”如三聚氰胺，黃曲霉毒素Ml，Beta_內酰胺類抗生素等的檢測技術主要有基于色譜-質譜等理化檢測、基于抗原抗體反應原理的免疫分析檢測和基于微生物相關技術原理的檢測。對乳品中抗生素的檢測最初發展起來的是基于抗生素與微生物間相互作用而建立的微生物生長抑制法、微生物受體法和酶促比色法。乳品中理化檢測方法是利用抗生素分子中的基團具有的特殊反應或性質來測定其含量，如高效液相色譜法、氣相色譜法、質譜法、聯用技術等等，能進行定性、定量和藥物鑒定，敏感性較高，但色譜法分析過程繁瑣復雜，樣品前處理步驟較為復雜，工作量大，儀器昂貴，要求有熟練地技術人員及較長的分析周期，這也一定程度上限制了色譜法的應用。目前，用于檢測抗生素殘留的免疫分析方法主要有兩類:一類是以抗原抗體識別為核心反應，代表方法是酶聯免疫吸附法(ELISA)，另一類是以受體配體識別為核心反應。但影響因素較多，易出現假陽性結果且靈敏度低。不管哪種方法，其檢測對象都是一種(類)物質，要實現一次性對高頻危害因子實現同步高通量的測定，目前的檢測方法還不能實現。
[0004]以稀土熒光化合物作為熒光標記物的時間分辨熒光生化分析技術已經取得了顯著的進步，在醫學臨床診斷、食品安全領域以及生命科學等領域發揮著越來越重要的作用。現有技術中，基于稀土熒光生物標記物超長熒光壽命的時間分辨熒光生化分析技術可有效消除各種各樣來自于樣品及儀器的背景信號對熒光測定的干擾，使得測定靈敏度顯著增加。
[0005]但是現有的稀土熒光探針具有光信號較弱、檢測集成度低的問題，并且現有的稀土熒光探針及其配套的檢測裝置和平臺無法實現多種危害因子同步檢測的目的。

【發明內容】

[0006]本發明的主要目的是提供一種光信號強、有助于高通量檢測食品中危險因子的熒光納米探針，同時，本發明還提供了該熒光納米探針的制備方法，以及采用該熒光納米探針來實現食品中多種危害因子同步檢測的方法，該方法能夠實現多種危害因子同步檢測的目的。
[0007]在闡述本發明的具體方案之前，對本發明中的各化合物簡稱予以說明:
[0008]TEOS (正硅酸乙酯)、BHHCT (三聯苯衍生物螯合物)、BPTA(四氮-[2，6_雙(3 ’ -氨基甲基-Γ-吡啶)-4-苯基吡啶])、APTMS(3-氨丙基三甲氧基硅烷)、NHS(N-羥基琥珀酰亞胺)、BBCAP(2，9-雙[N，N-雙(羧甲基)氨甲基]-1，10-(菲咯啉))、PTTA(聯三吡啶多羧酸衍生物)、BCPDA(4，7-雙氯磺酰基苯基-1，10-菲啰啉-2，9-二羧酸迮00(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽)、TritonX-100(聚乙二醇辛基苯基醚)、Tris(三羥甲基氨基甲烷)、BSA(牛血清白蛋白)、PDMS(聚一■甲基娃氧燒)。
[0009]本發明提供的技術方案為:一種熒光納米探針，包括內部載有Eu3+和/或Tb3+的稀土螯合物的TEOS納米內核，所述的TEOS納米內核表面修飾有多層表面鍵合有Eu3IPz^Tb3+稀土螯合物的TEOS殼層。
[0010]優選地，熒光納米探針的最外層還設有一層TEOS殼層，該TEOS殼層表面并不鍵合有Eu3+和/或Tb3+稀土螯合物，其主要用于鍵合抗體或者抗原模擬物。
[0011]在上述的熒光納米探針中，所述的TEOS納米內核的表面也鍵合有Eu3+和/或Tb3+稀土螯合物。
[0012]需要說明的是:在本方案中，“和/或”所指代的意思為可以選擇之一或兩種均可選擇。比如，Eu3+和/或Tb3+的稀土螯合物是指該稀土螯合物中所螯合的稀土離子可以為Eu3+也可以為Tb3+，也可以為兩者的混合物。
[0013]在本方案中，若選擇螯合有Eu3+和Tb3+的離子時，其配比是根據實際需要來進行選擇的，螯合物中所鍵合的Eu3+和Tb3+的摩爾比例可以為0:5、1:4、2:3、1:1、3:2、4:1、5:0。
[0014I Tb納米、Eu納米還是混合包裹的Eu/Tb納米都具有一致的激發和發射光譜。調整Eu與Tb 二者濃度的混合比例能夠制備多色熒光納米，其所制備出的多色熒光納米探針的激發波長是保持一致的，如圖5中A、B所示，BBCAP-Eu，BBCAP-Tb的激發波長為280nm。隨著摻入Tb與Eu摩爾比例的不同，形成的多色熒光納米探針在峰型上展示了一些變化，如圖5中C所示。但這種混合包裹的焚光納米探針，隨著在外層的“layer-by-layer”(一層又一層)包裹，其特征光譜峰也沒有發生變化，這對于后續的標記實驗是重要的，這樣可以保證不同類型的熒光納米探針混合進行多種危害因子的同步檢測，并有望實現可視化檢測。
[0015]在上述的熒光納米探針中，所述的稀土螯合物所用的螯合劑為BBCAP或BHHCT或PTTA0
[0016]在上述的熒光納米探針中，所述的表面鍵合有Eu3+和/或Tb3+稀土螯合物的TEOS殼層為3_5層。
[0017]本發明還提供上述的熒光納米探針的制備方法，具體來說，包括以下步驟:
[0018]步驟1:在反相微乳液中合成內部載有Eu3+和/或Tb3+稀土螯合物的TEOS納米內核；
[0019]步驟2:在TEOS納米內核的表面鍵合Eu3+和/或Tb3+稀土螯合物；
[0020]步驟3:在鍵合有Eu3+和/或Tb3+稀土螯合物的TEOS納米內核表面修飾一層TEOS殼層；
[0021 ]步驟4:在步驟3得到的具有TEOS殼層的粒子表面鍵合Eu3+和/或Tb3+稀土螯合物；
[0022]步驟5:重復步驟3和步驟4，2?4次；
[0023]步驟6:在步驟5得到的粒子表面修飾一層TEOS殼層。
[0024]在上述的熒光納米探針的制備方法中，所述的步驟2具體為:將步驟I所得到的TEOS納米內核置于無水乙醇中并加入APTMS反應，得到表面鍵合有氨基的TEOS納米內核，并將其置于無水乙醇中；
[0025]然后加入螯合劑，使螯合劑和氨基反應，將反應產物經過Tris.HCl溶液處理后置于無水乙醇中；
[0026]最后加入EuCl3和/或TbCl3,反應一段時間后得到表面鍵合Eu3+和/或Tb3+稀土螯合物的TEOS納米內核；
[0027]其中，TEOS納米內核、APTMS、螯合劑、EuCl3和/或TbCl3的重量比為10?100:1?5:0.5?5:0.5 ?5ο
[0028]在上述的熒光納米探針的制備方法中，所述的步驟2具體為:將步驟I所得到的TEOS納米內核置于無水乙醇中并加入APTMS反應，得到表面鍵合有氨基的TEOS納米內核，并將其置于無水乙醇中；
[0029]然后加入螯合劑，使螯合劑和氨基反應，將反應產物經過Tris.HCl溶液處理后置于無水乙醇中；
[0030]最后加入EuCl3和/或Tb Cl3，反應一段時間后得到表面鍵合Eu3+和/或Tb3+稀土螯合物的TEOS納米內核；
[0031 ] 其中，TEOS納米內核、APTMS、螯合劑、EuCl3和/或TbCl3的重量比為10?100:1?5:0.5?5:0.5 ?5ο
[0032]本發明還提供一種用于食品中多種危害因子同步檢測的方法，具體來說，所述的方法通過具有多條檢測通道的微流控芯片和多種如上述的熒光納米探針實施;每一種危害因子均對應有相應的檢測通道和相應的熒光納米探針；
[0033]所述的方法具體為:將待檢物溶液加入到多條檢測通道后，用緩沖液沖洗后加入含多種熒光納米探針的溶液，最后用緩沖液沖洗后檢測檢測通道內的熒光信號；
[0034]其中，對于采用夾心法檢測的危害因子，該危害因子對應的檢測通道內和用于檢測該危害因子的熒光納米探針的表面均固定有該危害因子的捕獲抗體；
[0035]對于采用競爭法檢測的危害因子，該危害因子對應的檢測通道內固定有該危害因子的捕獲抗體，且用于檢測該危害因子的熒光納米探針的表面偶聯有該危害因子的模擬物。
[0036]另外，本發明還提供了另一種用于食品中多種危害因子同步檢測的方法，所述的方法通過具有多條檢測通道的微流控芯片和多種如上述的熒光納米探針實施;每一種危害因子均對應有相應的檢測通道和相應的熒光納米探針；
[0037]所述的方法具體為:首先將含多種熒光納米探針的溶液與待檢物溶液混合后，將混合溶液加入到多條檢測通道中，然后用緩沖液沖洗后檢測檢測通道內的熒光信號；
[0038]其中，對于采用夾心法檢測的危害因子，該危害因子對應的檢測通道內和用于檢測該危害因子的熒光納米探針的表面均固定有該危害因子的捕獲抗體；
[0039]對于采用競爭法檢測的危害因子，該危害因子對應的檢測通道內固定有該危害因子的模擬物，且用于檢測該危害因子的熒光納米探針的表面固定有該危害因子的捕獲抗體。
[0040]所述的模擬物為危害因子與BSA或卵清蛋白反應得到，如BSA-三聚氰胺、BSA-氯霉素等。
[0041]在此需要說明的是，采用夾心法進行測試的危害因子一般為大分子危害因子如細菌、病毒等微生物，該大分子危害因子具有多個結合位點，也稱為完全抗原;對于采用競爭法進行測試的危害因子一般為小分子危害因子如三聚氰胺、抗生素、激素等，其僅具有一個結合位點，也稱為半抗原。
[0042]在上述的用于食品中多種危害因子同步檢測的方法中，所述的微流控芯片上還設有控制通道，所述的控制通道內未修飾任何生物分子。
[0043]在上述的用于食品中多種危害因子同步檢測的方法中，所述的微流控芯片包括PDMS本體，所述的PDMS本體的中央設有進樣口，所述的檢測通道和控制通道分別與進樣口相連，所述的進樣通道的末端和控制通道的末端均設有出口，所述的進樣通道和控制通道內均設有多個柱狀的凸起;所述的微流控芯片設置在一可旋