一種檢測牛乳過敏原的表面等離子共振法
【技術領域】
[0001]本發明涉及免疫分析技術領域，尤其涉及一種檢測牛乳過敏原的表面等離子共振法。
【背景技術】
[0002]FA0/WH0認定的導致人類食物過敏的八大類食品中，牛乳及其制品就是其中之一。在歐美的食品標簽法中也規定了牛乳是必須標示的食物過敏原成分。乳球蛋白(β-lactoglobulin，0LG)是牛乳中的主要過敏原，牛乳過敏原0LG的檢測方法目前主要是針對牛乳中特異性過敏原蛋白質或編碼過敏原的DNA片段。以DNA片段為檢測目標的檢測的手段，依賴聚合酶鏈式反應(PCR)來擴增特定的DNA片段，檢測食品中過敏原基因的DNA殘留，這種技術是把編碼過敏原蛋白的DNA作為食物過敏物質的檢測目標而不是檢測過敏原蛋白本身。這類方法目前應用比較廣泛是定性PCR和實時熒光定量PCR (Real-time PCR)o Real-time PCR可以利用特異性探針提高檢測的特異性。目前，PCR技術已用于不同食品過敏原的檢測。但食物過敏反應主要是由于食物中過敏原蛋白所引起，并不是蛋白對應的基因本身，PCR出現陽性結果也不能說明食物中含有對應的過敏原蛋白。因此，以檢測過敏原基因為基礎的方法并不是理想的檢測方法，在實際檢測中應用較少。
[0003]檢測食物中特異性過敏原蛋白質的方法主要是基于蛋白與特異抗體的免疫反應性。制備高效價的特異性抗體是過敏原蛋白檢測的關鍵。在牛乳過敏原的免疫檢測中就是利用抗原和抗體的特異結合的原理。目前，最主要的免疫檢測方法就是ELISA法(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)。有兩種半定量的 ELISA 方法:分別是雙抗體夾心法(Double antibody sandwich method ELISA，S-ELISA)和競爭法(CompetitiveELISA, C-ELISA)，其中雙抗體夾心法靈敏高也最為常用。ELISA的蛋白檢測方法主要是檢測食品中的牛乳總蛋白或牛乳主要過敏原(β LG, CNs, BSA), S-ELISA的檢出限(LOD) —般是約為2.5ppm，C-ELISA的LOD —般約為lppm。純化的抗β LG多克隆抗體已經用于雙抗體夾心法檢測嬰幼兒奶粉和人乳中低劑量的^!^，其檢出限可達到。.。。]!^.!^-1。目前，基于抗β LG單克隆抗體的雙抗體夾心法也用于檢測天然或變性的β LG,可檢測熱處理后變性的牛乳及其制品。抗酪蛋白多克隆抗體和單克隆抗體也已用于牛乳中酪蛋白的檢測，主要用于評價水解嬰幼兒奶粉蛋白的免疫反應性。ELISA的檢測所用時間大約4h，對人員的操作要求也較高。
[0004]除了 ELISA方法外，電泳法(SDS-PAGE)、質譜法(LC/MS/MS)，免疫印跡法(WesternBlotting)也用于水解牛乳中牛乳過敏原的檢測。但與傳統的ELISA方法相比，這些方法的靈敏度不高，對低劑量的過敏原檢測不出或成本太高。

【發明內容】

[0005]鑒于上述現有技術的不足，本發明的目的在于提供一種檢測牛乳過敏原的表面等離子共振法，旨在解決現有檢測方法存在的耗時耗力，靈敏度不高及對低劑量的過敏原檢測不出或成本太高的問題。
[0006]本發明的技術方案如下:
一種檢測牛乳過敏原的表面等離子共振法，其中，包括步驟:
A、以牛乳乳球蛋白作為抗原，免疫動物，制備抗牛乳乳球蛋白多克隆抗體；
B、以牛乳β-乳球蛋白作為抗原，免疫動物，獲得雜交瘤細胞，通過雜交瘤細胞制備抗牛乳乳球蛋白單克隆抗體；
C、通過偶聯的方法將抗牛乳乳球蛋白單克隆抗體固定于檢測芯片上，將不同濃度的牛乳乳球蛋白流經所述檢測芯片，然后加入抗牛乳乳球蛋白多克隆抗體用于放大信號，得到檢測結果。
[0007]所述的檢測牛乳過敏原的表面等離子共振法，其中，所述步驟A具體包括:以牛乳β -乳球蛋白作為抗原，將牛乳β -乳球蛋白和福氏完全佐劑混合乳化后免疫動物，同時將牛乳β -乳球蛋白和福氏不完全佐劑混合乳化后免疫動物，然后夾動物眼球取血，離心取血清，制得抗牛乳乳球蛋白多克隆抗體。
[0008]所述的檢測牛乳過敏原的表面等離子共振法，其中，所述步驟A之后還包括:對抗牛乳β -乳球蛋白多克隆抗體進行效價測定、純化及特異性測定。
[0009]所述的檢測牛乳過敏原的表面等離子共振法，其中，所述步驟B具體包括:以牛乳β -乳球蛋白作為抗原，將牛乳β -乳球蛋白和福氏完全佐劑混合乳化后免疫動物，同時將牛乳β -乳球蛋白和福氏不完全佐劑混合乳化后免疫動物，然后取免疫后的動物脾細胞與骨髓瘤細胞混合，通過PEG法進行細胞融合，獲得雜交瘤細胞，對雜交瘤細胞進行篩選與克隆，制得抗牛乳乳球蛋白單克隆抗體。
[0010]所述的檢測牛乳過敏原的表面等離子共振法，其中，所述步驟B還包括對抗牛乳β-乳球蛋白單克隆抗體進行純化處理，所述純化處理具體包括:用牛乳乳球蛋白為靶抗原，應用ELISA法進行交叉試驗排除非特異性反應，取陽性雜交瘤細胞株用生理鹽水洗滌3次，配成I X 106/mL，接種動物腹腔每只0.5mL，待8?1d后抽取腹水，離心，分離腹水，分裝，純化腹水，得到一株抗牛乳β -乳球蛋白單克隆抗體。
[0011]所述的檢測牛乳過敏原的表面等離子共振法，其中，所述步驟B還包括采用免疫印跡法對抗牛乳β -乳球蛋白單克隆抗體進行鑒定，并采用不同的抗IgG類型單抗對抗牛乳乳球蛋白單克隆抗體進行抗體類型測定。
[0012]所述的檢測牛乳過敏原的表面等離子共振法，其中，所述步驟B還包括對抗牛乳β-乳球蛋白多克隆抗體進行特異性測定。
[0013]所述的檢測牛乳過敏原的表面等離子共振法，其中，所述步驟D具體包括步驟:
D1、將抗牛乳乳球蛋白單克隆抗體固定于檢測芯片上；
D2、以3?7 μ L/min的流速注射一濃度的牛乳β -乳球蛋白流經檢測芯片280~320s ； D3、以3~7 μ L/min的流速注射HBS-EP緩沖液平衡檢測芯片表面150~200s ；
D4、以3~7 μ L/min的流速注射抗牛乳β _乳球蛋白多克隆抗體用于放大信號；
D5、以 25~35yL/min 的流速注射 8~10mM Glycine-HCl 25~35s，3 次用于抗牛乳 β-乳球蛋白單克隆抗體的表面；
在非零濃度注射之前，用HBS-EP緩沖液替代一定濃度的牛乳β -乳球蛋白作為樣本零濃度用來檢測LOD。
[0014]所述的檢測牛乳過敏原的表面等離子共振法，其中，所述步驟Dl中，所述抗牛乳β-乳球蛋白單克隆抗體的固定具體包括步驟:
Dl1、注射HBS-EP緩沖液，以8~12 μ L/min的流速平衡檢測芯片表面4~7min ；
D12、注射NHS與EDC的混合液，以8~12 μ L/min的流速活化檢測芯片表面5~10min ；D13、注射抗牛乳β-乳球蛋白單克隆抗體，以8~12yL/min的流速偶聯檢測芯片5~10min ；
D14、注射乙醇胺，以8~12 μ L/min的流速封閉檢測芯片表面5~10 min。
[0015]所述的檢測牛乳過敏原的表面等離子共振法，其中，所述步驟D2中，用HBS-EP緩沖液將牛乳 β -乳球蛋白稀釋為 5、10、20、40、80、100、500、1000、4000、16000、50000、100000ng/mL的不同濃度的牛乳乳球蛋白。
[0016]有益效果:本發明利用抗牛乳乳球蛋白單克隆抗體作為固定抗體，捕抓牛乳β -乳球蛋白，再通過抗牛乳β -乳球蛋白多克隆