一種百兩金皂苷b原料或其制劑的檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于醫藥技術領域，設及藥品的質量控制方法，具體是指百兩金皂巧B原 料或其制劑的分析檢測方法。
【背景技術】
[0002] 百兩金皂巧B的化學名稱為西克拉敏A3-0-a-鼠李化喃糖-(1 一 2) - 0 -D-葡萄 化喃糖-(1 一 4) -[ 0-D-葡萄化喃糖-(1 一 2)-] -a 阿拉伯化喃糖巧，是存在于紫金牛 科紫金牛屬植物百兩金、朱砂根、紅毛走馬胎等多種植物中的有效成分，具有細胞毒活性和 抗腫瘤、抗炎等藥理作用。在深入研究開發該活性成分的過程中，需要將其提取制備成含量 大于90%的中藥1類新藥原料，并進而制備成制劑。目前未見百兩金皂巧B原料藥及其制 劑的定量分析方法，為深入探討本品的成藥性及藥理活性，我們從該藥材中提取分離得到 百兩金皂巧B單體，并按照對照品研究技術指導原則進行了純化及結構鑒定。本發明采用 高效液相色譜-蒸發光散射檢測法（HPLC-ELSD)建立起百兩金皂巧B原料或其制劑的定量 分析方法，為進一步的深入研究和新藥開發提供新的分析手段和參考數據。
[0003]


【發明內容】

[0004] 本發明提供一種使用高效液相色譜-蒸發光散射檢測法（HPLC-ELSD)測定百兩金 皂巧B原料或其制劑的定量分析方法，其特征在于W十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；W 體積比為30 : 70~40 : 60己膳-水為流動相；用蒸發光散射檢測器檢測，理論板數按百 兩金皂巧B計算不得低于5000 ;其主要步驟包括色譜系統適用性試驗、對照品和樣品溶液 制備、進樣分析測定并計算含量。
[0005] 根據前述的檢測方法，其中，所述百兩金皂巧B原料采用如下方法制備：將百兩金 粉碎，用50 %~80 %的己醇提取，將提取液減壓濃縮，上大孔吸附樹脂，分別用水和30 %己 醇沖洗除雜，再用80%己醇洗脫，洗脫液減壓濃縮干燥，上硅膠柱層析，W體積比為70 : 30 的己酸己醋-甲醇洗脫，合并富含百兩金皂巧B的流份，除去溶劑，甲醇重結晶，干燥、即得； 其制劑為百兩金皂巧B原料用常規工藝制備而成的膠囊或片劑。
[0006] 根據前述的檢測方法，其中，所述百兩金皂巧B對照品是采用制備型高效液相色 譜儀對百兩金皂巧B原料進行分離純化而得，其制備的色譜條件為；W十八烷基硅烷鍵合 硅膠為填充劑；體積比為60 : 40~70 : 30的甲醇-水為流動相；在205皿波長下監測； 其供試品采用制備液相使用的流動相配制成飽和溶液，取上清液進樣，收集目標峰流出液， 濃縮、干燥、檢查純度，即得。
[0007] 根據前述的檢測方法，其中，所述百兩金皂巧B原料或其制劑的供試品溶液是用 50 %~70 %的甲醇或己醇水溶液作為溶劑提取。
[000引根據前述的檢測方法，其中，所述采用HPLC-ELSD法測定百兩金皂巧B原料或其制 劑含量的方法包括如下步驟和優化條件：
[0009] 照高效液相色譜法（中國藥典2010年版一部附錄VID)測定：
[0010] 色譜條件與系統適用性試驗：用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；己膳-水 (35 : 65)為流動相；蒸發光散射檢測器檢測，理論板數按百兩金皂巧B計算不得低于 4000。
[0011] 對照品溶液制備取百兩金皂巧B對照品適量，精密稱定，加50 %甲醇制成每1ml含 0. 3mg的百兩金皂巧B對照品溶液，即得。
[001引供試品溶液制備取百兩金皂巧B原料30mg，精密稱定，置100ml量瓶中，加入50% 己醇適量，超聲處理使溶解，用50 %己醇稀釋至刻度，搖勻，過濾或離屯、，取續濾液或上清 液，即得。
[001引測定方法分別精密吸取對照品溶液5yL、20yL;供試品溶液10yL;注入液相色 譜儀，測定，用外標兩點法對數方程計算，即得。
[0014] 本發明所提供的百兩金皂巧B原料或其制劑中百兩金皂巧B含量的HPLC-ELSD檢 測方法具有如下優點：
[0015] (1)本發明提供的方法首次引入了百兩金皂巧B原料或其制劑中有效成分百兩金 皂巧B的含量測定，從而使百兩金皂巧B的質量控制方法更加科學合理；
[0016] (2)本發明所提供的的百兩金皂巧B原料或其制劑的分析方法首次將HPLC-ELSD 法用于百兩金皂巧B原料或其制劑中活性成分百兩金皂巧B的含量測定，具有良好的線性 關系、精密度、重復性、穩定性、耐受性和回收率，測定簡便快速。
【附圖說明】
[0017] 圖1為百兩金皂巧B對照品溶液的HPLC-ELSD色譜圖；
[0018] 圖2為百兩金皂巧B原料的HPLC-ELSD色譜圖；
[0019] 圖3為百兩金皂巧B膠囊的HPLC-ELSD色譜圖。
【具體實施方式】
[0020] 1儀器、試藥與樣品
[0021] 高效液相色譜儀（美國安捷倫1100系列），包括在線真空脫氣機佑1322A)， 四元梯度累佑1311A)，自動進樣器佑1313A)，柱溫箱佑1316A)，DAD檢測器佑1314A)， 化emstation色譜工作站；Alltec證LSD2000型蒸發光散射檢測器；制備型高效液相色譜 儀（美國貝克曼庫爾特肥CHMAN125P型），包含SYSTEMGOLD125PSolventModule和16化 Detector等；Milli-Q超純水器（美國Milipore公司）；Microfuge18臺式離屯、機（美國貝 克曼庫爾特有限公司）；KQ-500DE超聲清洗機（昆山市超聲儀器有限公司，功率300W，頻率 40曲Z) ;BP-210D型電子分析天平（德國賽多利斯，十萬分之一）；過濾裝置（Autoscience) 及微孔濾膜化 45]im)。色譜柱；WatersSymmetiTCi8(150mmX4. 5mm，5]im);Phenomenex GeminiCi8(150mmX4.5mm，5]im);AlltechAltimmaCi8(250mmX4.5mm，5]im);制備色譜柱； 邸CHMANULTRAPREPC18 (21.ImmX150mm，10ym);保護巧；pheno皿exCig。
[0022] 百兩金皂巧B自制（烙點；263-265°C，薄層色譜多個展開及顯色系統均顯示一個 斑點，采用HPLC-ELSD峰面積歸一化法計算其質量濃度大于98%，符合定量分析用中藥化 學對照品純度的質量要求）；己膳為色譜純，水為高純水；其余試劑均為分析純。百兩金藥 材購買于四川省某公司，經本發明人鑒定為百兩金（ArdisiacrispaCrhunb. )DC.A.)。
[0023] 2百兩金皂巧B對照品制備
[0024] 將百兩金粉碎，用50%~80%的己醇提取，將提取液減壓濃縮，上大孔吸附樹脂， 用水和30%己醇沖洗除雜，再用80%己醇洗脫，洗脫液減壓濃縮干燥，上硅膠柱層析，W體 積比為70 : 30的己酸己醋-甲醇洗脫，合并富含百兩金皂巧B的流份，除去溶劑，甲醇重結 晶，用相應流動相溶解結晶物使成飽和溶液，上清液注入制備型高效液相色譜儀分離純化； 色譜條件；Ci8柱；流動相：體積比為60 : 40~68 : 32的甲醇-水；檢測波長；205皿，收 集目標峰流出液，濃縮、干燥，即得。
[00巧]將制得的百兩金皂巧B對照品采用高分辨質譜化R-FAB-M巧給出精確分子量：m/zl097. 5432[M+Na]，對應分子式為；〔53也〇22化（分子量計算值為；1〇97. 5509);其碳、 氨核磁共振信號根據gCOSY，HMQC，HMBC所顯示的相關關系得到了歸屬，結構鑒定為西 克拉敏A3-0-a-鼠李化喃糖-(1 一 2)-e-D-葡萄化喃糖-(1 一 4)-[e-D-葡萄化喃 糖-(1 一 2)-]-a 阿拉伯化喃糖巧。
[0026] 本發明制備的虎舌紅素B經高效液相色譜-蒸發光散射檢測法（HPLC-ELSD)純度 檢查，不同色譜柱和流動相測定結果均為一個色譜峰，WHPLC-ELSD峰面積歸一化法測定， 其質量分數均大于98%，符合含量測定用中藥化學對照品的要求。
[0027] 3方法優化
[0028] 3. 1蒸發光散射檢測器參數優化
[0029] 其主要參數有漂移管溫度和氣體流速，W5°C為遞增值，考察漂移管溫度在 70°C~120°C條件下同一供試品溶液百兩金皂巧B的峰高和噪聲情況，結果顯示漂移管 溫度為95°C時，其信噪比較佳。另一方面，W步長0.化?mirTi，考察了氣體流速從1. 2~ 2.化?mirTi時對響應值和噪聲的影響，結果發現氣體流速降低，其響應值增高，但噪聲也隨 之增加，其信噪比在2.化?min-i時較佳。
[0030] 3. 2提取方法與溶劑優化
[0031] 供試品溶液提取溶劑考察了水、30 %甲醇、50 %甲醇、70 %甲醇、甲醇、30 %己醇、 50 %己醇、70 %己醇、己醇等對百兩金皂巧B原料的提取效果，結果W50 %和70 %的甲醇或 己醇較佳，從成本和安全考慮，確定為50%己醇提取。
[0032] 3. 3提取時間優化
[0033] 供試品溶液提取時間考察了 5min、10min、15min、20min的提取溶解效果，結果差 異不大。最終確定的前處理方法是W50%己醇為溶劑，超聲處理10分鐘。
[0034] 4測定方法
[00巧]照高效液相色譜法（中國藥典2010年版一部附錄VID)測定：
[0036] 色譜條件與系統適用性試驗：用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；己膳-水 (35 : 65)為流動相；蒸發光散射檢測器檢測，理論板數按百兩金皂巧B計算不得低于 4000。
[0037] 對照品溶液制備取百兩金