一種茶樹嫩芽內源激素含量的測定方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于林學中樹木內源激素技術領域，具體涉及一種基于高效液相色譜法 (HPLC)測定茶樹頂芽內源激素含量的方法。
【背景技術】
[0002] 茶樹（Camelliasinensis)在我國栽種歷史悠久，是我國南方傳統的經濟植物 (張玉翠，2010)。目前關于茶樹的科學研宄，多集中在形態指標、光合特性及內在品質等方 面。通過分子機理的研宄，深入認識植物激素調控茶樹生長、發育及其對環境適應的機制， 具有重要的科學意義。
[0003] 植物激素（planthormone,PH)是指在植物體的某一部位合成，可轉移到其他部 位，并對植物的生長發育具有顯著調節作用的微量有機物，亦稱植物天然激素或內源激素。 植物內源激素種類多，含量甚微，且易被破壞。它們在細胞分裂與伸長、組織與器官分化、開 花與結實、成熟與衰老、休眠與萌發、植物形態建成以及離體組織培養等方面具有重要作用 (SantnerA，2009)。茶樹作為我國重要的農業經濟作物，以采摘幼嫩新梢為主。茶芽的萌 發及生長極易受外界環境的影響，這些影響在很大程度上都是通過植物激素直接進行作用 的（岳川，2012)。
[0004] 由于吲哚乙酸和赤霉素都可以與化學試劑反應，生成物在紫外光激發下可以呈現 出不同顏色的熒光，因此可用熒光法測定其含量，植物激素的測定還有紙層析、氣相色譜 (GC)、等方法，但由于分離效率和靈敏度的局限，目前關于植物頂芽和葉片的內源激素測定 方法主要為間接酶聯免疫吸附法（ELISA)，已有茶樹頂芽內源激素測定方法是間接酶聯免 疫吸附法（ELISA)，其基本方法是將已知的抗原或抗體吸附在固相載體（聚苯乙烯微量反 應板）表面，使酶標記的抗原抗體反應在固相表面進行，用洗滌法將液相中的游離成分洗 除。但需要購買酶聯免疫試劑盒，對試驗條件高。
[0005] 高效液相色譜法（HighPerformanceLiquidChromatography，簡稱HPLC)是一 種區別于經典液相色譜，基于儀器方法的高效能分離手段，因其高速、高效、高靈敏度、高自 動化的特點，廣泛用于各個領域，也是目前用于茶樹內源激素測定的重要方法。高效液相 色譜法測定快速、高效、高靈敏度、高自動化的特點，但對配制流動相、設置色譜條件要求較 高；由于茶樹嫩芽中存在茶多酚等多酚類物質生化成分，會對激素的測定造成干擾，因此其 樣品的前處理與其他品種樣品前處理存在差異。目前關于利用高效液相色譜法測定茶樹頂 芽的內源激素的方法前人研宄較少，尚未有相適宜的測定方法研宄成果。

【發明內容】

[0006] 發明目的：為了克服現有技術中存在的不足，本發明提供一種用于HPLC法測定茶 樹頂芽的內源激素的方法，具有高速、高效、高靈敏度、高自動化的特點。本發明主要解決了 在利用高效液相色譜法測定茶樹頂芽激素時，探索茶樹頂芽樣品前處理方法、流動相的選 擇和色譜條件，對成功利用HPLC測定植物激素提供一種可靠快速方法。
[0007] 技術方案：為實現上述目的，本發明采用的技術方案為：
[0008] -種茶樹嫩芽內源激素含量的測定方法，包括以下步驟：
[0009] 1)樣品收集冷凍與預處理；
[0010] 2)配置流動相及設置色譜條件；
[0011] 3)配置標準溶液并建立回歸方程；
[0012] 4)樣品待測溶液檢測；
[0013] 所述流動相由甲醇與0. 075%冰乙酸溶液組成；所述標準溶液包括IAA標準液、ZT 標準液、ABA標準液和GA3#準液。
[0014] 進一步的，在本發明中，步驟2)所述色譜條件為流速0. 7mL/min，檢測波長210nm 和254nm，柱溫25°C，進樣量20yL。
[0015] 進一步的，在本發明中，步驟2)所述流動相的配置方法為：再將甲醇與0.075%冰 乙酸溶液分別進行抽濾及超聲波震動30min，按體積比為45:55配制流動相。
[0016] 進一步的，在本發明中，步驟3)所述標準溶液包括0.lg/L的IAA標準液、0. 001g/ L的ZT標準液、0. 001g/L的ABA標準液和0. 01g/L的GA3#準液。
[0017] 進一步的，在本發明中，步驟1)所述樣品收集冷凍的具體方法為：采集茶樹嫩芽 樣品，置于液氮中5min后放入冰箱冷凍保存。
[0018] 進一步的，在本發明中，步驟1)所述樣品預處理的具體方法為：
[0019] 1-1)浸提：稱取冷凍的茶樹嫩芽樣品，加入80%冷甲醇研磨，置于4°C下靜置16h 后，抽濾得粗提液；
[0020] 1-2) -次萃取：將步驟1-1)所得粗提液用等量石油醚萃取，棄去醚相，保留水 相；
[0021] 1-3)旋轉蒸發：將步驟1-2)所得水相在37°C下旋轉蒸發至溶液體積的1/4至 1/5 ；
[0022] 1-4)調節pH:將步驟1-3)所得旋蒸濃縮液調節pH至8. 0,加入PVP，過濾，用 0? 3mol/L酒石酸溶液調節pH至3. 5 ;
[0023] 1-5)二次萃取：將調好pH值的溶液用等量乙酸乙酯萃取，收集水相，合并酯相；
[0024] 1-6)酯相收集：將步驟1-5)所得酯相在37°C下旋轉蒸干，溶解于甲醇，通過 0. 45ym濾膜抽濾，濾液保存于4°C下棕色瓶中，待測；
[0025] 1-7)水相收集：將步驟1-5)所得的水相調節pH至8. 0,用等量飽和正丁醇萃取得 有機相，在60°C下旋轉蒸發，溶解于甲醇，離心，濾液保存于4°C下棕色瓶中，待測。
[0026] 進一步的，在本發明中，所述建立回歸方程的具體方法為：在相應的色譜條件下分 別測定所述標準溶液，用保留時間對標準溶液進行定性判定；將所述標準液配制成系列濃 度梯度的標準混合液并進行檢測，以混合標準液峰面積與其質量濃度進行線性回歸分析； 以峰面積為縱坐標，以各進樣濃度為橫坐標，得到相應的標準溶液的線性回歸方程。
[0027] 進一步的，在本發明中，所述系列濃度梯度的標準混合溶液的具體配制方法為：根 據混合后的標準混合溶液的總體積和其中各組分的最終濃度，得出各標準溶液所需量，將 配置好的標準溶液進行混合，制成標準混合溶液后進行檢測，根據結果制成標準曲線。
[0028] 進一步的，在本發明中，樣品待測溶液檢測后，進行重現性和精密度的檢驗：取同 一批次茶樹嫩芽樣品待測溶液，加入已知濃度的混合標準溶液后，測定其中的內源激素含 量，計算加標回收率。
[0029] 進一步的，在本發明中，所述標準溶液和樣品待測溶液在進行測定前均需用 0. 45ym濾膜過濾。
[0030] 有益效果：本發明提供的高效液相色譜法測定茶樹頂芽的內源激素的方法，與現 有技術相比，本發明解決了在利用高效液相色譜法測定茶樹頂芽激素時，探索茶樹頂芽樣 品前處理方法、流動相的選擇和色譜條件，對成功利用HPLC測定植物激素提供一種可靠快 速方法，并且可快速、準確、同時測定茶樹嫩芽的IAA、ZT、ABA和6八3的含量；進行加標回收 率實驗，平均回收率為98. 91 %，符合激素測定要求。
【附圖說明】
[0031] 圖1為本發明方法的流程示意圖；
[0032] 圖2為本發明標準樣品出峰時間色譜圖，其中標明時間的峰從左至右依次為：反 玉米素、赤霉素、生長素、脫落酸。
【具體實施方式】
[0033] 下面結合附圖對本發明作更進一步的說明。
[0034] 如圖1所示為一種的方法的流程示意圖，具體技術方案如下：
[0035] 實施例
[0036] 第一步：茶樹嫩芽樣品收集
[0037] 經過不同氮肥處理（0. 4g/盆、0. 8g/盆、1. 6g/盆、2. 4g/盆）的茶樹嫩芽，取一芽 兩葉，若干，置于液氮中5min后放入冰箱冷凍，于-24°C下冷凍保存。液氮的作用主要固定 嫩芽中的內源激素。
[0038] 第二步：儀器設備與藥品準備
[0039] (1)儀器設備
[0040] 10-1000yLDRAGONLAB可調式移液槍，上海萬島儀器科技有限公司；
[0041] 1000mL砂芯過濾裝置，天津津騰實驗設備有限公司；
[0042] QP-01小型真空泵，深圳良誼儀器公司；
[0043] DS-5510DTH超聲波清洗器，上海奧析科學儀器有限公司；
[0044] LC600液相色譜儀，北京萊博泰科儀器股份有限公司。
[0045] (2)藥品試劑
[0046] IAA標準品，SIGMA-ALDRICH，productofUSA;
[0047] ZT標準品，SIGMA-ALDRICH，productofUSA;
[0048] ABA標準品，SIGMA-ALDRICH，productofUSA;
[0049] GA3標準品，SIGMA-ALDRICH，productofUSA;
[0050] 甲醇，色譜純，國藥集團化學試劑有限公司，上海；
[0051] 冰乙酸，分析純，國藥集團化學試劑有限公司，上海。
[0052] 第三步：茶樹嫩芽樣品的預處理
[0053] 1-1)浸提：稱取1. 000g冷凍的茶樹嫩芽樣品，用10ml80%冷甲醇研磨并完全轉 移