草甘膦檢測微流控芯片、草甘膦抗原固定方法及檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種草甘膦檢測微流控芯片、草甘膦抗原固定方法及檢測方法。
【背景技術】
[0002]草甘膦(Glyphosate，GLY)作為除草劑，經近年來許多研宄表明草甘膦對生物具有一定的毒性，草甘膦進入環境會對生態環境產生有害影響，引起水污染，植被破壞，并通過在食物中的殘留對人類健康構成威脅，并在遺傳方面產生不良影響。因此我國2006年頒布的《生活飲用水衛生標準》(GB 5749-2006)規定飲用水中草甘膦的含量不得超過
0.700mg/Lo《生活飲用水標準檢驗方法》(GB/T 5750— 2006)中草甘膦的檢測采用的是柱后衍生離子交換色譜法，在色譜柱后增加自動衍生設備，操作繁瑣且不易掌握。
[0003]目前有關草甘膦殘留分析方法主要采用液相色譜和氣相色譜法，另外還有液-質聯用、氣-質聯用和離子色譜法等。但由于草甘膦極性強，易溶于水，難溶于大多數有機溶劑，沒有發色和突光基團等特性，使得氣相色譜法常用的各種標準衍生技術的使用受到限制。利用色譜法進行草甘膦殘留檢測實驗操作復雜、難度大，無法滿足生產實踐中草甘膦快速檢測的需要。
[0004]中國專利200910247555.5公開了一種基于免疫反應的生物檢測微流控芯片及其備做方法。該芯片以光學透明的聚二甲基硅氧烷為材料，由樣品通道層，閥門控制層及基片層構成。芯片內含樣品富集及免疫分析模塊，該模塊由一個或幾個納升體積的免疫色譜柱微分析室組成，每個分析室固定有抗體蛋白或抗原。該微流控芯片存在制備程序復雜，檢測需要復雜的信號采集模塊、微處理器及數據庫，檢測設備成本高昂，也使用了色譜分析方法，檢測程序復雜，難度大，檢測速度慢。
[0005]免疫分析法(Immunoassay, IA)是以抗原抗體特異性識別和結合反應為基礎來獲得定性或定量結果的微量檢測技術。與傳統的微量檢測方法相比，具有特異性好、靈敏度高、分析容量大、成本低、方便快速、適于現場測定等優點。但是免疫檢驗通常在96孔板上進行，樣品和試劑消耗量大，且抗原-抗體的結合時間長，這些不足限制了其進一步的應用。
【發明內容】
[0006]本發明的目的在于提供一種草甘膦檢測微流控芯片、草甘膦抗原固定方法及檢測方法，使微流控芯片能夠簡便、快速、準確檢測水中的草甘膦。
[0007]為解決上述技術問題，本發明的一種檢測草甘膦的微流控芯片，包括位于底部的基片和密封覆蓋于其上的蓋片，基片上設置有微流路，所述微流路包括衍生化通道和與其相連的免疫反應檢測通道，免疫反應檢測通道內表面固定有草甘膦抗原，在衍生化通道的入口設置有水樣入口和衍生試劑入口，在免疫反應檢測通道出口設置有廢液出口，在衍生化通道與免疫反應檢測通道連接處附近設置有磷酸鹽緩沖液入口、草甘膦抗體溶液入口、Cy3熒光染料標記二抗溶液入口和十二烷基磺酸鈉溶液入口。
[0008]作為優選，所述基片和蓋片的材料為玻璃片，微流路采用光刻的方法刻出。
[0009]作為優選，所述基片與蓋片采用熱鍵合技術鍵合。
[0010]作為優選，所述衍生化通道設置成蛇形曲折通道。
[0011]作為優選，所述免疫反應檢測通道深40um，寬度為150um，長度為35mm。
[0012]為解決上述技術問題，本發明的一種草甘膦抗原固定方法，應用于權利要求1所述的草甘膦檢測微流控芯片，通過對微流控芯片的免疫反應檢測通道內表面進行化學修飾引入活性基團，再使免疫反應檢測通道內表面上的活性基團與草甘膦抗原活性基團結合，從而使草甘膦抗原固定在免疫反應檢測通道的內表面上。
[0013]作為優選，所述免疫反應檢測通道內表面的化學修飾步驟如下:
[0014](I)用體積比為1:1甲醇和鹽酸的混合液在超聲波清洗機中超聲清洗微流控芯片30min,去離子水清洗后吹干；
[0015](2)將體積比為7:3的硫酸和雙氧水的混合液通入到芯片通道內，靜置30min，使通道表面將產生羥基，反應結束用去離子水沖洗，再用氮氣吹干芯片；
[0016](3)將體積比為1:9的3-氨丙基三乙氧基硅烷和丙酮的混合液通入到芯片通道內，50°C反應24h，使芯片內表面氨基化，用去離子水清洗后60°C干燥2h，將含有過量戊二醛的磷酸緩沖液通入芯片通道內中，4°C反應lh，20°C反應lh，反應結束后用去離子水沖洗干凈。
[0017]作為優選，所述使免疫反應檢測通道內表面上的活性基團與草甘膦抗原活性基團結合的步驟如下:
[0018](I)將草甘膦加入到7.5ml 0.1M的4-嗎啉乙磺酸緩沖液中，使溶液中草甘膦濃度為0.019mM ;同時將200mg牛血清白蛋白溶解到5ml 0.1M的4-嗎啉乙磺酸緩沖液中；將39mgl-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺用0.1M的4-嗎啉乙磺酸緩沖液配制成0.019mM溶液；將上述三種溶液混合后室溫下反應2h，用分子截留量為6000-8000的Spectrapor I透析膜在4°C下持續透析24h ；
[0019](2)將250 μ L濃度為lmg/ml透析后的草甘膦-牛血清白蛋白溶液通入免疫反應檢測通道，4°C下反應24h，通入2mg/ml牛血清白蛋白溶液，靜置20min，磷酸鹽緩沖液清洗，
氮氣吹干。
[0020]為解決上述技術問題，本發明的一種草甘膦檢測方法，采用權利要求1所述的微流控芯片檢測草甘膦，該檢測方法包括如下步驟:
[0021 ] (I)同時抽取水樣和衍生試劑琥珀酸酐，在衍生化通道中，使水樣中的草甘膦與衍生試劑琥珀酸發生反應，從而對水樣中草甘膦進行衍生；
[0022](2)將衍生后的水樣與草甘膦單克隆抗體泵入到芯片免疫反應檢測通道，37°C條件下孵育15min，使水樣及免疫反應檢測通道上固定的草甘膦競爭性結合溶液中抗體結合位點；
[0023](3)泵入Cy3熒光染料標記的二抗，37°C條件下孵育15min，抗體與二抗發生免疫反應，形成草甘膦-抗體-二抗復合物；
[0024](4)用磷酸鹽緩沖液清洗芯片免疫反應檢測通道，將沒有結合在芯片上的復合物沖出檢測通道，用光電倍增管檢測熒光讀數F，根據用不含草甘膦的去離子水空白對照測得的熒光值Fe和公式F' = (Fc-F)/Fe計算得到F'，通過該微流控芯片關于樣品中草甘膦濃度C與相對熒光強度F'的線性方程計算出水樣中的草甘膦濃度C。
[0025]作為優選，將檢測后的微流控芯片用pHl.9濃度5%的十二烷基磺酸鈉溶液清洗，使抗體變性后脫離芯片上的草甘膦固定抗原，實現微流控芯片再生使用。
[0026]本發明一種草甘膦檢測微流控芯片、草甘膦抗原固定方法及檢測方法的有益效果是:
[0027](I)本發明中將免疫分析和微流控技術結合，利用了免疫分析法具有的特異性好、靈敏度高、分析容量大、成本低、方便快速、適于現場測定等優點，也利用了微流控芯片具有的分析速度快，工作效率高、試劑耗量少、系統高度集中、自動化程度高等優點，不僅提高了檢測的靈敏度和準確性、抗原與抗體的反應速度，也降低了樣品和試劑的消耗量，能夠簡便、快速、準確檢測水中的草甘膦。
[0028](2)采用玻璃片作為微流控芯片的材料，是由于玻璃片具有廉價、表面光滑、熒光背景低、性能穩定等諸多優點。微流路采用光刻的方法刻出，在于采用光刻的方法刻制方法簡便，可以精確控制微流路的大小和深度，而且形狀整齊規則。
[0029](3)基片與蓋片采用熱鍵合技術鍵合，可以實現基片與蓋片的嚴密密封，保證微流路流動的準確有效性，并防止雜質的帶入，避免影響檢測結果。
[0030](4)將衍生化通道設置成蛇形曲折通道，是為增加衍生試劑與草甘膦接觸時間，使水樣中的草甘膦能夠完全被衍生化，提高檢測的準確性。
[0031 ] (5)將免疫反應檢測通道設置成深40um，寬度為150um，長度為35mm，可以使草甘膦抗原充分的固定在免