專利名稱：檢測耐草甘膦蛋白G2-aroA的方法及其專用酶聯免疫試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種檢測耐草甘膦蛋白G2-aroA的方法及其專用酶聯免疫試劑盒。
背景技術：
草甘膦類除草劑是一種廣譜性、非選擇性除草劑，它通過抑制EPSPS(5_烯醇丙酮酰草酸-3-磷酸合酶，是植物體內芳香族氨基酸合成途徑中的一個重要酶)的活性，阻斷了植物莽草酸途徑的生物合成，強烈抑制細胞分裂，對許多一年生和多年生雜草都具有強烈的抑制作用。由于草甘膦易于被微生物分解，在土壤中無殘毒，對動物無毒害，自從1976年Roundup研制成功以來,得到了廣泛的應用。但是，由于玉米等禾本科作物對草甘膦敏感，使其應用受到限制。因此，將耐草甘膦基因轉入作物，不但可以擴大草甘膦的使用范圍，而且可降低生產成本，保護作物免受藥害，最終達到增產增收的目的。目前，國際上在耐草甘膦轉基因植物的研究方面，已經取得了突破性進展。美國孟山都(Mosanto)和Calegene等公司在基于對EPSP合成酶的編碼基因aroA的研究，已獲得耐草甘膦轉基因大豆、玉米、油菜和棉花等作物系列品種，其中大豆等多種轉基因作物已經進入商品化生產。Mosanto公司生產的耐草甘膦二型轉基因玉米在2007年的播種面積預計超過3200萬英畝，相當于美國玉米播種面積的40%。2004年，中國農業科學院生物技術研究所發現了一個新的耐草甘膦基因G2-aroA (中國專利，申請號03826892. 2，授權公告號CN100429311C)。目前尚沒有抗G2_aroA蛋白的單克隆抗體，也未見利用G2_aroA蛋白單克隆抗體鑒別轉G2-aroA基因植物的相關報道。

發明內容
本發明的一個目的是提供一種檢測耐草甘膦蛋白G2-aroA的酶聯免疫試劑盒。本發明所提供的酶聯免疫試劑盒中含有獨立包裝的抗所述G2_aroA蛋白的單克隆抗體；所述G2-aroA蛋白的氨基酸序列為序列表中序列9 ;所述單克隆抗體由雜交瘤細胞株AntiG2-5Fll產生；所述雜交瘤細胞株AntiG2_5Fll在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏編號為CGMCC No. 5772。所述酶聯免疫試劑盒中還含有分別獨立包裝的抗所述G2-aroA蛋白的多克隆抗體和/或所述G2-aroA蛋白標準品和/或用于標記所述單克隆抗體的標記酶；所述多克隆抗體是以所述G2-aroA蛋白為免疫原免疫脊椎動物得到的。在本發明的一個實施例中，所述多克隆抗體具體是以所述G2-aroA蛋白為免疫原免疫家兔(體重約2kg的新西蘭大耳白兔)得到的。所述G2-aroA蛋白標準品可為G2-aroA蛋白或由所述G2-aroA蛋白配制成的一系列不同濃度的G2_aroA蛋白溶液。所述一系列不同濃度的G2-aroA蛋白溶液具體可為從濃度為10 μ g/mL開始，按照2倍比進行稀釋所得的溶液。所述G2-aroA蛋白溶液的溶劑具體可為PBST。所述酶聯免疫試劑盒中還含有分別獨立包裝的包被緩沖液和/或洗滌液和/或底物緩沖液和/或終止緩沖液和/或封閉液；在本發明的一個實施例中，所述包被緩沖液具體為碳酸鹽緩沖液，其溶劑為水，Na2CO3和NaHCO3 ;溶質Na2CO3和NaHCO3在所述包被緩沖液中的濃度分別為15mM和35mM ;所述包被緩沖液的pH為9. 6。在本發明的一個實施例中，所述洗滌液具體為PBST，其溶劑為水，溶質為Na2HP04、KH2PO4、NaCl和吐溫20 ; 溶質Na2HPO4、KH2PO4和NaCl在所述洗滌液中的濃度分別為8. 3mM、I. 5mM和200mM ;所述吐溫20在所述洗滌液中的體積百分含量為O. 1% ;所述洗滌液的pH為 7. 5。在本發明的一個實施例中，所述底物緩沖液具體為PNPP緩沖溶液，其溶劑為水，溶質為MgCl2和二乙醇胺；溶質MgCl2在所述底物緩沖液中的濃度為ImM ;所述二乙醇胺在所述底物緩沖液中的體積百分含量為9. 7% ;所述底物緩沖液的pH為9. 8。在本發明的一個實施例中，所述終止緩沖液具體為3M的NaOH水溶液；在本發明的一個實施例中，所述封閉液具體為3% (3g/100ml)的BSA，其溶劑為水，溶質為牛血清白蛋白(BSA)、Na2CO3和NaHCO3 ；Na2CO3和NaHCO3在所述封閉液中的濃度分別為15mM和35mM ;所述封閉液的pH為7. 5。在本發明的一個實施例中，所述標記酶具體為堿性磷酸酯酶。所述酶聯免疫試劑盒在檢測或輔助檢測所述G2-aroA蛋白中的應用也屬于本發明的保護范圍。所述酶聯免疫試劑盒在鑒別或輔助鑒別轉G2-aroA基因植物中的應用也屬于本發明的保護范圍；所述G2-aroA基因編碼氨基酸序列為序列表中序列9的蛋白質。在本發明的一個實施例中，所述待測植物具體為玉米，如玉米品種綜31。所述酶聯免疫試劑盒在定量檢測G2-aroA蛋白含量中的應用也屬于本發明的保護范圍；所述G2-aroA蛋白的氨基酸序列為序列表中序列9。由雜交瘤細胞株AntiG2-5Fll CGMCC No. 5772產生的單克隆抗體在制備所述的酶聯免疫試劑盒中的應用也屬于本發明的保護范圍。利用本發明所提供的酶聯免疫試劑盒可用于定性或定量檢測玉米等轉基因植物中耐草甘膦蛋白G2-aroA的表達情況，具有快速、靈敏、特異性強的優點。保藏說明參椐的生物材料(株)AntiG2_5Fll科學描述小鼠雜交瘤細胞保藏機構中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏機構簡稱CGMCC地址北京市朝陽區北辰西路I號院3號保藏日期2012年2月7日保藏中心登記入冊編號CGMCC No. 577

圖I為純化后G2_aroA蛋白SDS-PAGE電泳鑒定圖。其中，泳道I為蛋白Marker，自上到下依次為72KD、45KD、32KD、14. 4KD ;泳道2_4均為原核重組表達載體pET-28a-G2_aroA中表達后純化所得的G2-aroA蛋白，上樣量分別為5μ 1、10μ 1、15μ I。圖2為SDS-PAGE檢測純化后單克隆抗體的純度。其中，泳道I為蛋白Marker ;泳道2為純化后的單克隆抗體，較大的目的條帶為重鏈，較小的目的條帶為輕鏈。圖3為酶聯免疫試劑盒檢測G2_aroA蛋白濃度的標準曲線。圖4為重組表達載體pS3300-UMG2的質粒圖譜。圖5為載體pS3300-UG0的質粒圖譜。圖6為轉G2_aroA基因玉米的PCR鑒定圖譜。其中，泳道I為陽性對照；泳道2為DNA Marker (D2000);泳道3為空白對照組；泳道4為陰性對照組；泳道5_24為20株轉G2-aroA基因玉米植株。圖7為轉G2-aroA轉基因玉米植株的草甘膦耐性田間鑒定圖。其中，I所示一行玉米為mG2-aroA轉基因玉米植株；2所示一行玉米為空載體轉基因玉米植株；3所示一行玉米為未轉基因的玉米植株。圖8為載體pUC19-UG2的質粒圖譜。圖9為載體pCAMBIA3300的質粒圖譜。圖10為載體pS3300的質粒圖譜。圖11為重組表達載體pS3300-UG2的質粒圖譜。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。弗氏完全佐劑北京康為世紀生物科技有限公司，產品目錄號為CWM001 ；弗氏不完全佐劑北京康為世紀生物科技有限公司，產品目錄號為CWM002 ；HAT :北京康為世紀生物科技有限公司，產品目錄號為CWM003 ；PEG4000 :北京康為世紀生物科技有限公司，產品目錄號為CWM005 ；RPMI 1640培養基北京康為世紀生物科技有限公司，產品目錄號為CWM006 ；胎牛血清(FBS):北京康為世紀生物科技有限公司，產品目錄號為CWM007 ；山羊抗小鼠I gG (H+L) -HRP :北京康為世紀生物科技有限公司，產品目錄號為CffO102 ；K8 :孟山都(Mosanto)耐草甘膦材料mon810的提取液。。實施例I、雜交瘤細胞株的獲得及抗G2_aroA蛋白單克隆抗體的制備Balb/C小鼠北京維通利華實驗動物有限公司Sp2/0 :北京康為世紀生物科技有限公司、
一、免疫原S780的制備將序列I所示的DNA片段連接到原核表達載體pET_28a(+)的多克隆位點中，得到表達G2_aroA蛋白的原核表達載體pET-28a-G2_aroA。將pET-28a-G2_aroA轉化大腸桿菌BL21中，用IPTG誘導其表達G2-aroA蛋白，收集菌體后，將菌體通過超聲波破碎，將所表達蛋白釋放到提取液中，后用His標簽蛋白純化試劑盒(購自北京康為世紀生物科技有限公司，目錄號CW0009A)純化，G2-aroA蛋白經純化后進行SDS-PAGE電泳檢測。SDS-PAGE電泳鑒定結果如圖I所示。經page膠鑒定，純度能夠達到95 %，經eppendorf蛋白核酸測定儀biophotometer plus測定濃度為I. 3mg/ml,將純化后的G2-aroA蛋白作為免疫原S780。
G2-aroA蛋白的氨基酸序列為序列表中序列9。二、動物免疫以5只6周齡的雌性Balb/C小鼠為試驗動物，按照如下免疫程序及流程進行免疫I、免疫前采用斷尾采血法采集血清，用作陰性對照。2、初次免疫將濃度為O. 64 μ g/ μ I的G2_aroA蛋白溶液經無菌過濾器過濾后加入等體積弗氏完全佐劑，用磁力攪拌器充分攪拌乳化，直到滴入水中不擴散，得到免疫原。用乳化好的免疫原采用背部皮下多點注射的方法免疫Balb/C小鼠，注射劑量為每只小鼠注射80 μ g的G2-aroA蛋白(250 μ I乳化好的免疫原)。3、第一次加強免疫初次免疫21天后，將濃度為O. 32 μ g/μ I的G2_aroA蛋白溶液經無菌過濾器過濾后加入等體積弗氏不完全佐劑，用磁力攪拌器充分攪拌乳化，直到滴入水中不擴散，得到免疫原。用乳化好的免疫原采用背部皮下多點注射的方法免疫Balb/C小鼠，注射劑量為每只小鼠注射40 μ g的G2-aroA蛋白(250 μ I乳化好的免疫原)。4、第二次加強免疫第一次加強免疫14天后，進行第二次加強免疫。具體方法同步驟3的第一次加強免疫。5、終加強免疫第二次加強免疫14天后，將濃度為O. 8 μ g/μ I的G2_aroA蛋白溶液經無菌過濾器過濾后，得到免疫原。用所得免疫原脾內注射加強免疫Balb/C小鼠，注射劑量為每只小鼠注射80 μ g的G2-aroA蛋白(100 μ I的免疫原)。三、細胞融合和克隆化在第二次加強免疫14天后，斷尾采血法采集血清，并用間接ELISA法(以S780為包被抗原)測定血清效價。在上述步驟一終加強免疫后第3天，選擇上述間接ELISA法測定血清效價最佳的小鼠(效價為I : 720000)取脾細胞，再將脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞按9 I (數量配比)的比例，用PEG(PEG4000)常規融合方法進行細胞融合。融合后的第3天和第6天進行換液處理，第7天采用間接ELISA法(以S780為包被抗原)對融合細胞上清進行篩選，選取陽性細胞孔，將孔內細胞分別轉入24孔培養板擴增培養。待細胞長至顯微鏡視野1/3時，收集細胞上清液，采用間接ELISA法(分別以S780、K8 (孟山都(Mosanto)耐草甘膦材料mon810提取液)、陽性(耐草甘膦材料提取液)、陰性(非轉基因材料提取液)作為包被抗原)進行復篩，從中選擇與S780及陽性反應均較強，同時與K8和陰性均未反應的細胞(表I中的粗體的5F11)，應用有限稀釋法進行亞克隆。經過3次亞克隆最終獲得穩定分泌抗G2-aroA蛋白的單克隆雜交瘤細胞株，命名為AntiG2-5Fll。該雜交瘤細胞株已于2012年2月7日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCCJia :北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編100101)，保藏編號為CGMCC No. 5772。上述作為包被抗原的K8 (孟山都(Mosanto)耐草甘膦材料mon810提取液)、陽性(我公司耐草甘膦材料提取液)、陰性(非轉基因材料提取液)具體按照如下方法制備得到取O. 3g樣品材料(孟山都(Mosanto)耐草甘膦材料mon810,或實施例2所獲得的T6代mG2-aroA轉基因玉米，或未轉基因的玉米品種綜31)，液氮磨碎后，轉入2ml離心管中加入Iml樣品提取液，劇烈震動 ，4°C提取lh，12000轉/分離心10分鐘后取上清進行樣品測定。其中，樣品提取液配方為Tris-Cl(pH8. 0)25mm ;KC1 IOmm ;MgCl2 · 6H20 20mm ;DTT 1mm;PMSF Imm (用前加)。上述間接ELISA法的步驟具體如下I)包被在96孔酶標板中加入100 μ L的2 μ g/mL的抗原溶液，同時設置不包被抗原的對照，4°C包被過夜，用PBS緩沖液洗滌3次。上述抗原溶液可為S780、K8、陽性和陰性溶液。2)封閉加入150 μ L/孔的封閉液(3%牛血清蛋白)，在37°C孵育2h，棄封閉液，洗滌3次，拍干。置于4°C冰箱保存備用。3)加待測樣品a.對于血清效價檢測，第一個孔I : 1000稀釋，往下以I : 3的梯度倍比稀釋，37°C孵育30min，洗板4次，拍干。b.對于細胞上清檢測，吸取細胞上清100μ 1，加入對應的酶標板中，37°C孵育30min,洗板4次,拍干。同時設置未經免疫的小鼠血清/抗體/腹水/細胞上清的對照；以PBS代替待檢測樣品的對照(陰性對照孔)。4)加酶標二抗取山羊抗小鼠IgG(H+L)_HRP，按I 5000倍稀釋后，100 μ I/孔，37°C孵育20至30min，洗滌4次，拍干。5)顯色將 20 X TMB 稀釋至 1XTMB，按 100 μ I/孔加入，37°C顯色 15_30min。6)終止加入終止液(2M H2SO4) 50 μ I/孔。7)讀數以450nm單波長測定各孔OD值，以與陰性對照孔(以PBS代替待測樣品的對照)0D值的比值(P/N)大于2. I為限，作為判斷為陽性或確定效價的臨界點。ELISA結果判定方法⑴篩選陽性細胞時，若P/N > 2. 1，則判別為陽性細胞；若
I< P/N < 2. 1，則加大包被濃度后再次檢測，P/N > 2. I的仍判為陽性。(2)測定效價時，以P/N > 2. I的血清(或是腹水或是抗體)最大稀釋倍數表示。表I采用間接ELISA法對融合細胞上清進行復篩的結果
權利要求
1.一種檢測或輔助檢測G2-aroA蛋白的酶聯免疫試劑盒，其特征在于所述試劑盒中含有獨立包裝的抗所述G2-aroA蛋白的單克隆抗體；所述G2_aroA蛋白的氨基酸序列為序列表中序列9 ;所述單克隆抗體由雜交瘤細胞株AntiG2-5Fll CGMCC No. 5772產生。
2.根據權利要求I所述的酶聯免疫試劑盒，其特征在于所述酶聯免疫試劑盒中還含有分別獨立包裝的抗所述G2-aroA蛋白的多克隆抗體和/或所述G2-aroA蛋白標準品和/或用于標記所述單克隆抗體的標記酶；所述多克隆抗體是以所述G2-aroA蛋白為免疫原免疫脊椎動物得到的。
3.權利要求I或2所述的酶聯免疫試劑盒在檢測或輔助檢測G2-aroA蛋白中的應用；所述G2-aroA蛋白的氨基酸序列為序列表中序列9。
4.權利要求I或2所述的酶聯免疫試劑盒在鑒別或輔助鑒別轉G2-aroA基因植物中的應用；所述G2-aroA基因編碼氨基酸序列為序列表中序列9的蛋白質。
5.權利要求I或2所述的酶聯免疫試劑盒在定量檢測G2-aroA蛋白含量中的應用；所述G2-aroA蛋白的氨基酸序列為序列表中序列9。
6.由雜交瘤細胞株AntiG2-5FllCGMCC No. 5772產生的單克隆抗體在制備權利要求I或2所述的酶聯免疫試劑盒中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種檢測耐草甘膦蛋白G2-aroA的方法及其專用酶聯免疫試劑盒。本發明所提供的酶聯免疫試劑盒中含有獨立包裝的抗所述G2-aroA蛋白的單克隆抗體；所述G2-aroA蛋白的氨基酸序列為序列表中序列9；所述單克隆抗體由雜交瘤細胞株AntiG2-5F11 CGMCC No.5772產生。利用本發明所提供的酶聯免疫試劑盒可用于定性或定量檢測玉米等轉基因植物中耐草甘膦蛋白G2-aroA的表達情況，具有快速、靈敏、特異性強的優點。
文檔編號G01N33/573GK102645535SQ20121010740
公開日2012年8月22日 申請日期2012年4月12日 優先權日2012年4月12日
發明者劉素霞, 宋哲, 徐曄潁, 李雪峰, 郭旻, 韓庚辰 申請人:北京奧瑞金種業股份有限公司