一種無患子皂甙的hplc檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種植物天然皂甙集合的檢測，尤其涉及一種無患子皂甙的高效液相色譜(High Performance Liquid Chromatography, HPLC)檢測方法。
【背景技術】
[0002]無患子(Sapindus mukorossi)為無患子屬無患子科落葉喬木，在世界范圍內，約有13個種類分布，主要產于亞洲、美洲和大洋洲；中國無患子屬共有4種，主要分布于長江流域以南地區。無患子果皮中含有多種生物活性物質，在抗菌、抗腫瘤、抗肝炎、抗胃潰瘍、殺精、殺螺等方面均有大量研宄報道，此外，由于無患子果皮中豐富的倍半萜和三萜皂苷含量，賦予其優秀的表面活性性能，讓其在開發為各日化用品方面具有巨大潛力而一度成為研宄的熱點。此外，其較強的抗菌、消炎、抗腫瘤、抗生育、促進微量元素及藥物吸收等能力，亦賦予了其在日化用品開發之外的潛在研宄價值。
[0003]目前無患子皂甙的檢測方法主要集中在用分光光度法測定，比色法如:五氯化銻、香草醛硫酸比色或香草醛-冰醋酸-高氯酸比色法測定。此外還有通過RP-HPLC法測定常春藤阜苷元(Hederagenin)或齊墩果酸(Oleanolic acid)的方法來間接測定；以巴拿馬樹皮提取物Quillaja Saponin(QS)為標準來測定無患子阜苷的含量。但以上方法過于粗略而不能準確反應無患子皂苷的真實成分分布和真實含量。
[0004]此外，報道有使用LC-MS法、電噴霧離子化ES1-MS、大氣壓電離子化質譜APC1-MS，對無患子皂甙進行檢測，雖然此類方法可以直接地對無患子總皂苷中各種皂苷成分進行分離鑒定和分子量測定，但檢測儀器昂貴，操作過程復雜，普遍推廣使用難度大。
[0005]印度國家藥物研宄中心⑶RI用HPTLC和LC-MS對無患子皂苷指紋圖譜進行過研宄，并用C18柱對無患子阜苷B (Sapindoside B)的HPLC檢測方法進行研宄，該方法的預處理過程十分復雜，梯度洗脫基線漂移嚴重，色譜分離效果較差，樣品測定結果的重現性、準確性等差。發明人按該方法而HPLC譜圖中一直未得到目標峰。
[0006]因此，本領域迫切需要提供一種運行時間適當，基線穩定，分離度良好，重現性好，準確度高的無患子皂甙的HPLC檢測方法，以為無患子的充分開發利用以及加快其商品化進程提供一種優秀，實效的工具。

【發明內容】

[0007]本發明旨在提供一種無患子皂甙的高效液相檢測方法。
[0008]在本發明中，上述目的是通過如下方案實現的:
一種無患子皂甙的檢測方法，包括將待檢測的無患子皂甙通過高效液相色譜分離，其流動相為兩種以上極性溶劑的混合溶劑，采用梯度洗脫。
[0009]作為優選，其中所述極性溶劑選自乙腈、乙醇、甲醇或水。
[0010]進一步的，其流動相為乙腈和水的混合物，采用梯度洗脫，乙腈的起始濃度為10-30vol.%，最終濃度為 50-80vol.V0o
[0011]發明人經過廣泛而深入的研宄，通過大量的試驗，摸索得到了一種無患子皂甙的HPLC檢測方法。發明人發現了有效分離、檢測無患子皂甙的乙腈和水的體積比，進一步地，發明人還發現在一定的時間內使乙腈和水的體積比逐步變化(即采用一定的濃度梯度洗脫方式)，可以得到更佳的分離、檢測效果。
[0012]作為優選，在本發明中，濃度梯度優選為如下五個階段:
1)洗脫劑中乙腈在0-20分鐘從10-30vol.%遞增到20-40VO1.% ；
2)洗脫劑中的乙腈在20-35分鐘，從20-40vol.%遞增至40_60vol.% ；
3)洗脫劑中的乙腈從35-45分鐘，保持在40-60vol.% ；
4)洗脫劑中的乙腈濃度在45-55分鐘，從40-60vol.%遞增到70_100vol.% ；
5)洗脫劑中的乙腈在55-60分鐘，從70-100vol.%遞減到50_80vol.%。
[0013]進一步的，在本發明中，濃度梯度優選為如下五個階段:
(1)所述流動相中乙腈在0-20分鐘從23vol.%遞增到30vol.% ；
(2)流動相中的乙腈在20-35分鐘，從30vol.%遞增至55vol.% ；
(3)流動相中的乙腈從35-45分鐘，保持在55vol.% ；
(4)流動相中的乙腈濃度在45-55分鐘，從55vol.%遞增到80vol.% ；
(5)流動相中的乙腈在55-60分鐘，從80vol.%遞減到50vol.%。
[0014]在本發明中，所述HPLC使用反相C18色譜柱，柱溫保持在30_40°C，UV檢測器檢測波長為 200-210nm。
[0015]在另一優選例中，無患子阜式樣品的進樣濃度為l_3mg/ml。
[0016]在另一優選例中，步驟(I)前還包括步驟:
將無患子原料果皮粉碎，以80被％乙醇按照￠:5:4)的量提取，合并提取液，旋干，真空干燥，研磨。稱取一定量原料粉末，加純化水超聲溶解，定容于1ml容量瓶中，使其成終濃度3-8mg/ml的無患子原料溶液，用0.45um水系有機濾膜過濾，HPLC備用。
[0017]據此，本發明提供了一種運行時間相對較短、基線穩定、分離度良好的檢測無患子皂苷的HPLC方法。
[0018]本發明的主要優點在于:
1、填補國內外無患子檢測方法專利的空白，并優化該檢測方法，使目標峰的理論塔板數大大提高，且基線平穩，出峰時間適宜，試劑用量小，峰之間分離度好，能較好地呈現無患子皂甙的譜圖峰特點，讓HPLC檢測無患子皂甙真正達到了高效、準確的目的；
2、運行時間相對較短，為60min;出峰早，10分鐘左右即出現第一個皂甙吸收峰。
【附圖說明】
[0019]圖1是無患子主要阜式sapindosideB的結構圖。
[0020]圖2-9為實施案例1-8的無患子樣品以UV作為檢測器的HPLC檢測圖譜。
【具體實施方式】
[0021 ] 下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。
[0022]本發明中的重量體積百分比中的單位是本領域技術人員所熟知的。
[0023]除非另行定義，文中所使用的所有專業與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用于本發明中。文中所述的最佳實施方法與材料僅作示范之用。
[0024]本發明實施例中的實驗條件如下:
儀器和色譜條件:
儀器:Shimadzu LC-20AT高效液相色譜儀(Shimadzu SFOjOA型號檢測器、二元泵) 色譜柱:ffondasil C18for herb medicine 流動相A:去離子水(UP)
流動相B:乙腈中流速:1.0ml/min 柱溫:40°C
檢測波長:選用200nm-210nm作為檢測波長。
[0025]溶液的制備
對照品溶液:常春藤阜苷元(Hederagenin)用甲醇超聲溶解，用0.45um—次性針孔過濾后，HPLC備用。
[0026]樣品溶液:精密稱取一定量事先制備好的干燥的無患子原料粉末，加純化水超聲溶解，定容于1ml容量瓶中，使其成終濃度3-8mg/ml的無患子原料溶液，用0.45um水系有機濾膜過濾，作為樣品溶液，HPLC備用。
[0027]實施例1
起始流動相A:流動相B = 75:25,隨后，流動相B連續性遞增從25%逐漸升到50%洗脫25分鐘，隨后在接下來的35分鐘內，流動相B繼續連續性遞增，從50%逐漸升至55%，平衡。此方法下，7分鐘后開始出現第一組峰，分離度較好，35分鐘以后峰分離不明顯，如，RT = 39.123min處峰，分