定量檢測25-羥基維生素d的免疫層析試劑條及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物技術領域，具體涉及定量檢測25-羥基維生素D的免疫層析試劑條及其制備方法。
【背景技術】
[0002]維生素D為類固醇衍生物，屬脂溶性維生素。人體中的維生素D僅有小部分來源于食物，體內所需的維生素D的95%來源于陽光中紫外線照射皮膚產生。維生素D經血液循環進入肝臟，在25-羥化酶作用下轉化為25-羥基維生素D，然后在腎近端小管上皮細胞線粒體內α羥化酶系統的作用下轉變為1，25-二羥基維生素D，它是維生素D最大的生物作用形式，可以促進腸道鈣結合蛋白的合成。而25-羥維生素D是代謝中的主要循環形式，能反映機體的維生素D儲存水平并與維生素D缺乏的臨床癥狀相關聯，因此25-羥基維生素D是衡量維生素D體內水平的最可靠的臨床指標。
[0003]維生素D的主要作是調節鈣、磷代謝，靠促進鈣和磷在腸道內的吸收，以及腎小管重吸收鈣磷的方式，來提高血液中的鈣磷水平，并用鈣化的方法，與甲狀旁腺激素和降鈣素以及其他激素共同作用，使骨質變得堅硬。除了具有傳統意義上的骨骼效應，還具有影響自身免疫疾病、心血管病、糖尿病、腫瘤等非骨骼效應。研宄發現，維生素D缺乏會直接影響人類基因的表達，這些基因與風濕性關節炎和糖尿病等眾多疾病有關。維生素D缺乏會導致少兒佝僂病和成年人的軟骨病。研宄還表明維生素D缺乏可能使某些癌癥、心血管疾病、自身免疫性疾病和感染性疾病的發病風險升高。
[0004]臨床上對維生素D的定量檢測已成為常規檢測項目和體檢項目。建立一種快速，簡便，靈敏，準確可靠的檢測維生素D水平的方法尤為重要。目前25-羥維生素D的測定方法主要有酶聯免疫法、放射免疫法、液相色譜-質譜檢測法以及化學發光法。酶聯免疫法自動化程度不高，且受人為因素影響較大。放射免疫法存在著環境污染問題；液相色譜質譜操作復雜，用時較長；而化學發光法靈敏度雖高，但檢測成本較高，需要特定化學發光儀，這些原因導致其應用范圍較小。
【發明內容】
[0005]本發明為避免上述現有技術所存在的不足之處，提供一種定量檢測25-羥基維生素D的免疫層析試劑條及其制備方法，具有采樣容易、操作簡便、敏感度高、特異性強、穩定性好等優點，適合在基層醫院、診所以及體檢中心等單位使用，對于降低維生素D檢測成本、普及人體維生素D檢測、減少臨床盲目用藥具有重要意義。
[0006]為了實現上述發明目的，本發明提供以下技術方案:
一種定量檢測25-羥基維生素D的免疫層析試紙條，包括依次設置的加樣區、結合物釋放區、反應區和吸水區；所述結合物釋放區為包被膠體金(或量子點或上轉換發光材料UCP)的鼠抗人25-羥基維生素D單克隆抗體的玻璃纖維素膜；所述反應區為測試區和控制區，測試區包被25羥基維生素D-偶聯蛋白，控制區包被羊抗鼠IgG抗體的硝酸纖維素膜。
[0007]所述膠體金、量子點、上轉換發光材料都是作為免疫層析技術中的標記物，間接讀出待測物的濃度。
[0008]膠體金已發展成為免疫層析技術中最常用到的標記物。但是其主要進行定性或半定量檢測，限制了它的應用范圍。
[0009]膠體金的定量免疫層析技術的原理:膠體金顆粒在特定波長下，對光的吸收和散射與膠體金顆粒的量相關，通過光電感應器檢測膠體金顆粒對光的吸收和散射，從而獲得待測抗原的量。
[0010]量子點是一種半導體納米晶，它激發光譜寬，呈連續分布，而發射光譜窄，單色性好且顏色可調，發光強度是傳統有機熒光素的20~50倍，并且具有持久的光化學穩定性，其獨特的光學性質使其作為一種新型的熒光探針而得到廣泛關注。量子點作為標記物較之膠體金具有更高的靈敏度。
[0011]量子點缺點:制備條件茍1刻、反應步驟比較復雜、試劑成本高、毒性較大等。
[0012]上轉換發光技術是免疫層析原理與光電轉換原理相結合的免疫檢測技術，以上轉換發光顆粒作為示蹤物，經過紅外光激發后上傳發光顆粒發射可見光，實現能量的上轉，通過對光學信號的轉換，能夠快速對待測物進行定量檢測。
[0013]上轉換發光材料的優點:可以有效降低光致電離作用引起基質材料的衰退；不需要嚴格的相位匹配，對激發波長的穩定性要求不高；輸出波長具有一定的可調協性。
[0014]上轉換發光材料的缺點:反應時間較長；標準曲線范圍相對較窄；發光效率較低，穩定性較差。
[0015]本發明所述定量檢測25-羥基維生素D的免疫層析試紙條將包被有膠體金(或量子點或上轉換發光材料UCP)的鼠抗人25-羥基維生素D單克隆抗體的結合物釋放區與包被有25-羥基維生素D-偶聯蛋白的測試區連在一起，利用膠體金(或量子點或上轉換發光材料UCP)免疫層析法競爭性結合單抗原理，即被檢測者血清的25-羥基維生素與包被在硝酸纖維素膜上的25-羥基維生素D-偶聯蛋白競爭性結合25-羥基維生素D單克隆抗體的原理，通過檢測測試區的顏色深淺(或被激發的量子點的熒光強度或被激發的UCP顆粒的發光強度)，定量檢測人血清中的25-羥基維生素D。
[0016]當血清中不存在25-羥基維生素D時，膠體金(或量子點或上轉換發光材料UCP)的鼠抗人25-羥基維生素D單克隆抗體由于毛細管作用沿著結合物釋放區移動至測試區，與該測試區包被在硝酸纖維素膜上的25-羥基維生素D結合，從而在測試區出現一條紫紅色條帶(或經激發后產生強的熒光信號或經激發后產生強的發射光)；當血清中存在25-羥基維生素D時，膠體金(或量子點或上轉換發光材料UCP)的鼠抗人25-羥基維生素D單克隆抗體首先與血清中的25-羥基維生素D結合形成復合物，然后受毛細管作用沿著結合物釋放區移動至測試區，但沒有或僅有少量的膠體金(或量子點或上轉換發光材料UCP)的鼠抗人25-羥基維生素D單克隆抗體與測試區的25-羥基維生素D-偶聯蛋白結合，測試區線顏色消失或變淺(或經激發后只能產生弱的熒光信號或經激發后只能產生弱的發射光)，在一定條件下，測試區線顏色的深淺(或熒光的強度或發射光的強度)和樣品中的濃度呈負相關，采用相應的免疫層析儀可定量判斷人血清中的25-羥基維生素D濃度。
[0017]而控制區包被羊抗鼠IgG抗體，膠體金(或量子點或上轉換發光材料UCP)的鼠抗人25-羥基維生素D單克隆抗體與包被的羊抗鼠IgG抗體結合，從而在控制區出現一條紫紅色條帶(或經激發后產生強的熒光信號或經激發后產生強的發射光)，可判斷試紙條及檢測結果是否有效，也作為測定試劑的內控標準。如果控制區沒有產生紫紅色條帶(或經激發后沒有產生強的熒光信號或經激發后沒有產生強的發射光)，則說明試紙條失效。
[0018]進一步的，本發明所述25-羥基維生素D檢測試紙條還包括PVC背襯板，所述加樣區、結合物釋放區、反應區、吸水區依次相互搭接的粘貼在PVC背襯板上。
[0019]由于25-羥基維生素D的濃度最終由膠體金的顏色深淺(或量子點經激發后產生的熒光強度或上轉換發光材料UCP經激發后產生的發射光強度)來決定，因此25-羥基維生素D單克隆抗體扮演了連接膠體金(或量子點或上轉換發光材料UCP)和25-羥基維生素D這兩種物質的重要角色，既能與膠體金(或量子點或上轉換發光材料UCP)結合，又能與25-羥基維生素D結合，其中25-羥基維生素D單克隆抗體與25-羥基維生素D結合是一個自發的過程，而25-羥基維生素D單克隆抗體與膠體金(或量子點或上轉換發光材料UCP)的結合需要人為的促進。生產的一個重要步驟就是膠體金(或量子點或上轉換發光材料UCP)
25-羥基維生素D單克隆抗體。
[0020]其中，作為優選，本發明所述膠體金(或量子點或上轉換發光材料UCP)的25-羥基維生素D單克隆抗體的制備方法為向ImL pH7.4，50mM的磷酸鹽緩沖液中加入2 μ mol膠體金(或量子點或上轉換發光材料UCP)和Img鼠抗人25-羥基維生素D單克隆抗體，室溫下溫和振蕩2小時，然后12000r/min離心30min，取沉淀即得。
[0021]所述25羥基維生素D-偶聯蛋白的制備方法包括以下步驟:
將1mg維生素D溶解于100 μ L有機溶劑中，然后在攪拌條件下向10mL，濃度為5mg/mL的偶聯蛋白溶液中逐滴加入溶解后的維生素D，再逐滴加入體積百分比濃度為50%的戊二醛水溶液至溶液中戊二醛的體積百分比濃度為I %?3%，攪拌5min?20min后移至4°C下攪拌反應16h?18h，反應后的反應液用PBS緩沖溶液在4°C下透析8h，透析過程中換液2?3次，透析物離心后取上清液，最后將上清液用0.45 μm濾膜過濾，得到維生素D與偶聯蛋白的偶聯物，即25羥基維生素D-偶聯蛋白，_20°C保存備用。
[0022]其中，所述有機溶劑為三氯甲烷、甲醇、乙醇、正己烷、乙腈、二甲基亞砜、1，4_ 二氧六環中的一種。
[0023]其中，所述偶聯蛋白為牛血清白蛋白、卵清蛋白(OVA)或血藍蛋白(KLH)中的一種。
[0024]其中，所述鼠抗人25-羥基維生素D單克隆抗體、25-羥基維生素D和羊抗鼠IgG抗體是本領域技術人員公知的，可以通過商業途徑獲得或通過現有技術中公開的方法制備得到。
[0025]作為信號讀取的膠體金(或量子點或上轉換發光材料UCP)是試紙條定量檢測中的重點。膠體金(或量子點或上轉換發光材料UCP)的大小、均一度、穩定性都會影響產品的最后讀數。作為優選，本發明所述25-羥基維生素D檢測試紙