一種管內固相微萃取技術用于牛奶中磺胺類抗菌藥的快速檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及磺胺類抗菌藥的檢測方法，特別是涉及一種采用管內固相微萃取-毛 細管電泳-激光誘導熒光檢測聯用技術檢測磺胺類抗菌藥的分析方法，屬于分析化學-食 品安全檢測技術領域。
【背景技術】
[0002] 磺胺類抗菌藥是一類具有廣譜抗菌活性的化學藥物（SAs)，被廣泛應用于畜牧業 上細菌感染性疾病的預防和治療，低劑量使用還可促進畜禽生長。但過度使用該類藥物會 導致動物性食品的藥物殘留，甚至會引起過敏反應和癌變，進而危害人類的健康。為保證人 類的食品安全，許多國家對食品中SAs的殘留制定了最高允許量，我國農業部發布的《動物 性食品中獸藥最高殘留限量》規定磺胺類藥物在動物源性食品中的最高殘留限量（MRLs)為 100ug/kg。因此，磺胺類抗菌藥的檢測對食品安全的質量監控至關重要。
[0003] 目前用于磺胺類抗菌藥的檢測方法主要有生物檢測法，免疫分析法，色譜法，色/ 質譜聯用技術等。其中微生物檢測法檢測速度快，但靈敏度和準確度不高，且只能定性檢 測；免疫分析技術是一種粗篩選方法，雜質干擾大的動物源性樣品的檢測結果會不準確，且 其難以解決非特異性吸附的問題；薄層色譜法雖然選擇性好，但重復性差；高效液相色譜 法較為通用，具有高靈敏度和低檢出限等優點，但其樣品預處理時間較長、操作復雜，不適 宜作為藥物殘留的快速檢測；而色質聯用技術綜合了色譜的高分離能力和質譜的高定性能 力，但質譜儀器較為昂貴，對操作人員的要求也較高，限制其應用范圍。

【發明內容】

[0004] 本發明的目的在于針對現有技術的不足，提供一種快速、準確檢測牛奶中磺胺類 抗菌藥的方法，即管內固相微萃取-毛細管電泳-激光誘導熒光檢測聯用技術。這是一種 利用石墨烯嵌入的多孔聚合物整體柱作為管內固相微萃取的固定相對目標分析物進行高 效富集，并采用高靈敏度、低檢測限的激光誘導熒光檢測器檢測磺胺類抗菌藥的檢測方法。 本方法分離檢測步驟僅需3min，磺胺類抗菌藥的檢測限能達到20yg/L，實際樣品中定量 濃度可低至3.7yg/L，回收率在91. 1% -93. 8%之間，可以滿足食品樣品的檢測要求。
[0005] 為實現上述目的，本發明采用的技術方案如下：
[0006] -種管內固相微萃取-毛細管電泳-激光誘導熒光檢測聯用技術快速檢測牛奶中 磺胺類抗菌藥（磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶）的方法，包括如下步驟：
[0007] S1.待測樣品前處理：
[0008] 準確量取l-5mL牛奶，加入10-40mmol/L、pH= 3-6的磷酸鹽溶液稀釋至10-50mL， 渦旋混勻，離心，取上清液，再經濾膜過濾后備用。取l_5mL上清液至5mL棕色小瓶中備用。
[0009] S2.樣品的管內固相微萃取：
[0010] 取經步驟1處理后的牛奶的上清液1-500UL于一小瓶中，在壓力驅動下，待測樣 品溶液進入萃取柱，目標分析物被留在毛細管內的萃取相上，在流出端放置一離心管收集 流過萃取柱的溶液。
[0011] S3.樣品的解析：
[0012] 取5-50yL解析溶劑，在壓力驅動下，解析溶劑進入萃取柱，將萃取柱上的目標分 析物洗脫，流出端的離心管收集洗脫下的目標分析物。
[0013] S4?樣品的衍生：
[0014] 將收集到的含有目標分析物的解析溶劑加入5-50yL乙酸鹽溶液，再加入 0? 2-2yL熒光胺衍生試劑，在20-50°C衍生10_40min。
[0015] S5?樣品的檢測：
[0016] 經衍生后的目標分析物溶液通過液位差法進樣，再經毛細管電泳-激光誘導熒光 檢測器分離檢測待測樣品中磺胺類抗菌藥，并用外標法定量。
[0017] 所述的檢測方法，其中，步驟1中牛奶樣品的過濾使用0. 22ym的Nylon濾膜。
[0018] 所述的檢測方法，其中，步驟1中離心的轉速是5000-15000r/min，離心的時間 10_30minD
[0019] 所述的檢測方法，其中，步驟2中所使用的管內固相微萃取多孔聚合物整體柱的 制備方法如下：
[0020] 本發明中石墨烯嵌入的甲基丙烯酸類多孔聚合物整體柱的制備采用光引發原位 聚合的方法，將含有石墨烯的有機聚合物溶液注入到硅烷化的毛細管中，在紫外光催化/ 反應箱中反應10-60min，即可得到所需的整體柱。實驗室制備的有機聚合物溶液由功能單 體、交聯劑、致孔劑、引發劑和石墨烯構成，其中功能單體為甲基丙烯酸正丁酯，交聯劑為乙 二醇二甲基丙烯酸酯，致孔劑為N，N-二甲基甲酰胺和聚乙二醇6000,引發劑為安息香雙 甲醚。實驗中通過改變單體與致孔劑的比例、功能單體和交聯劑的比例以及致孔劑中兩種 組分的比例來調節孔徑和粒徑都符合要求的整體柱，以實現合適的滲透性和比表面積的目 的。選用的毛細管內徑為25-500ym。通過SEM表征有石墨烯的存在以及良好的多孔結構。
[0021] 所述的檢測方法，其中，步驟2中萃取施加的壓力為100-500psi。
[0022] 所述的檢測方法，其中，步驟3中解析施加的壓力為100_500psi。
[0023] 所述的檢測方法，其中，步驟3中解析溶劑是60% -100%甲醇水溶液，百分比為體 積百分比。
[0024] 所述的檢測方法，其中，步驟4中加入乙酸鹽的pH值為2-5。
[0025] 所述的檢測方法，其中，步驟5中分離的毛細管為25-500ym內徑、15-50cm總長 (有效長度l〇-45cm)熔融石英毛細管。
[0026] 所述的檢測方法，其中，步驟5中采用液位差進樣，進樣高度為5-lOcm，進樣時間 為 5-20s。
[0027] 所述的檢測方法，其中，步驟5中毛細管電泳分離條件：分離緩沖溶液為 20-100mmol/L、pH= 5-9的磷酸鹽緩沖溶液，分離電場強度為100-500V/cm。
[0028] 本發明可以獲得如下效果：
[0029] 本發明提供了一種利用管內固相微萃取-毛細管電泳-激光誘導熒光檢測聯用技 術快速檢測磺胺類抗菌藥的方法，該方法采用管內固相微萃取技術對樣品進行前處理，并 采用高靈敏度、低檢測限的激光誘導熒光檢測器檢測。是一種將富集、分離、檢測于一體的 新型綠色環保的分析方法。
[0030] 本發明中所述的管內固相微萃取柱是通過光聚法制備的石墨烯嵌入的甲基丙烯 酸類多孔聚合物整體柱，石墨烯的加入顯著增加了萃取柱的比表面積和穩定性，其與許多 有機物質能發生共軛作用，提高了萃取柱的萃取容量。該萃取柱還具有良好的滲透 性和低傳質阻力的特點。其可以實現對復雜樣品體系中目標分析物的快速、高效的富集。
[0031] 利用本發明中所述的管內固相微萃取柱對待測樣品進行萃取，得到的解析液經衍 生后直接進行毛細管電泳分離-激光誘導熒光檢測，能夠方便、快捷的檢測出待測樣品中 微量甚至痕量的目標分析物。本發明通過衍生產生熒光進行檢測提高靈敏度，減少物質干 擾。該方法對牛奶中磺胺類抗菌藥的檢測范圍為20-500yg/L，且線性良好，線性相關系數 (R2)為0. 9983-0. 9993,檢出限為20yg/L，滿足低殘留量時的檢測要求。
【附圖說明】
[0032] 圖1是本發明制備的石墨烯嵌入的甲基丙烯酸正丁酯-乙二醇二甲基丙烯酸聚合 物萃取柱的800倍掃描電鏡圖。
[0033] 圖2是本發明制備的萃取柱的4000倍掃描電鏡圖。
[0034] 圖3是本發明的萃取裝置示意圖。
[0035] 圖中，1.樣品離心管，2.多孔聚合物萃取柱，3.收集離心管。
[0036] 圖4是100yg/L的三種磺胺類抗菌藥混合標準溶液萃取解析后的電泳譜圖，出峰 順序為磺胺二甲基嘧啶（SMZ) :2. 053min;磺胺甲嘧啶（SMR) :2. 373min;磺胺嘧啶（SDZ): 2. 767min〇
[0037] 圖5是磺胺二甲基嘧啶定量標準曲線。
[0038] 圖6是磺胺甲基嘧啶定量標準曲線。
[0039] 圖7是磺胺嘧啶定量標準曲線。
[0040] 圖8是牛奶樣品萃取解析后與未萃取的電泳譜圖。
【具體實施方式】
[0041] 為了使本技術領域的人員更好的理解本發明方案，下面結合附圖與具體實