一種富集與檢測低濃度酚類有效成分的方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于天然藥物的提取制備領域。它設及一種新型，高靈敏度的提取富集技 術，用于富集與檢測低濃度酪類有效成分。
【背景技術】
[0002] 植物中具有許多具有生物活性的化學成分，因此其提取工藝受到人們的廣泛關 注。目前，常見的提取植物化學成分的技術有回流萃取法，超聲萃取法，液液微萃取法，固相 微萃取法，微波萃取法，酶萃取法等。其中，固相微萃取技術是一種在固相萃取的基礎上發 展而來的一種集采樣、預濃縮、微萃取、進樣于一體的新型萃取分離技術。它與常見的分離 技術相比，具有操作簡單快速，有機和有毒溶劑的用量很少，靈敏度高等優點。此外，該技術 可W聯合多種先進的現代儀器，例如：氣相色譜，液相色譜，毛細管電泳，質譜等。固相微萃 取技術多使用納米材料作為吸附劑，常見的吸附劑有單壁碳納米管、磁性納米粒、多壁碳納 米管等，它們能在樣品制備中獲得很高的萃取效率。但是，據我們所知，沒有使用殼聚糖分 散的多壁碳納米管作為吸附劑用于固相微萃取的相關報道。
[0003] 碳納米管是一種新型碳質納米材料，具有獨特的機械性能，較大的比表面積和化 學性質穩定等優點。碳納米管可分為多壁碳納米管，單壁碳納米管和雙壁碳納米管。其中多 壁碳納米管具有較強的吸附能力，能吸附多種物質，已被廣泛應用于分離濃縮多種金屬離 子和有機化合物。但是，多壁碳納米管的水溶性很差，需要通過其他官能團或聚合物修飾才 能穩定分散均勻。殼聚糖是甲殼素在堿性條件下通過脫己酷基后形成的衍生物，具有生物 相容性、生物可降解、無毒和良好的成膜能力。殼聚糖能通過共價鍵與多壁碳納米管作用， 從而使碳管穩定分散，得到均勻的殼聚糖分散的多壁碳納米管溶液。
[0004] 菊花為菊科多年生植物的頭狀干燥花序，最早W鞠華之名被載于《神農本草經》 一書中，又名甘菊，后因產地和加工藝的不同且其在市場上流通廣泛，菊花逐漸形成了不 同的商品名稱，如貢菊、毫菊、杭白菊、川菊和祁菊等名稱。菊花品種繁多且用途廣泛，可分 為食用菊、茶用菊、藥用菊、W及觀賞菊，因此深受各國人民的關注與喜愛。據記載，開封 人喜愛菊花，一直保留著吃菊花的習俗，在當地，菊花可W做成多種食品，如菊花粥、菊花 羹、菊花糕、菊花餅、菊花啤酒、菊花慢頭、菊花面包等。菊花還可W用來泡茶飲用，俗語有 云：常飲菊花茶，老來眼不花。菊花茶沁屯、爽口，香氣濃郁，不僅能解渴，還能解除困乏， 起到提神的效果，是一種老少皆宜的常用飲品，此外，菊花還是一種重要的藥材，據《本 草綱目》記載，菊花味甘平，稍苦，無毒，具有清風熱，治頭暈目眩，療眼疾與肌膚濕搏，輕身 耐老延年之功效，此外，現代的藥理研究證明其還具有解熱、抗炎、抗衰老、抗誘變、抗氧化、 抗癌、抗突變、抗病原微生物等作用。菊花的主要化學成分包括綠原酸、黃酬類化合物W及 微量元素等。綠原酸具有活性經基，可W發生一系列氧化反應，因此具有抗氧化活性；此 夕h最新研究表明綠原酸具有抗病毒、抗血凝W及保護屯、血管等多種生物活性。黃酬類是 W 2-苯基色原酬為基礎的一些化合物，具有抗氧化、抗衰老、抗癌、抗肺瘤、降血脂、降膽固 醇、保護屯、腦血管W及鎮痛和免疫調節等多種廣泛的藥理作用。因此，提取和定量分析菊花 的化學成分具有重要的理論和實際意義。
[0005] 基于上述背景，有效檢測菊花中酪類成分將有助于菊花分析工作的開展。目前，已 有較多文獻報導對菊花中酪類成分的檢測，但檢測的方法和使用的吸附劑較為單一。截止 目前，W殼聚糖分散的多壁碳納米管作為吸附劑在中藥的固相微萃取方面應用偏少。且該 方法在菊花提取、富集環節尚未見報道。

【發明內容】

[0006] 本發明的目的在于尋求一種比W往富集方法更加快捷、高效的技術，用于提取富 集天然產物中的活性成分。發明要點在于將微量的殼聚糖分散的多壁碳納米管作為一種 新型的吸附劑，巧妙地結合分散微固相萃取技術的優勢，再利用高靈敏度的UHPLC-QTOF-MS 進行檢測分析。
[0007] 本發明利用殼聚糖具有類似于陽離子表面活性劑的特點，將其用于分散多壁碳納 米管，從而克服了碳納米管難W分散在水中的缺點。此外，多壁碳納米管的表面積很大，能 對物質進行選擇性吸附，使得天然產物中活性成分的富集效果十分顯著。
[000引本發明具體提供了一種由微量殼聚糖分散的多壁碳納米管分散液作為新型吸附 劑的方法，可用于富集與檢測菊花植物提取液中的酪類有效成分。
[0009] 本發明采用的技術方案是：
[0010] 一種富集與檢測低濃度酪類有效成分的方法，所述酪類有效成分為綠原酸、木梶 草巧、蒙花巧、木梶草素、芹菜素、香葉木素、金合歡素中的一種或兩種W上，所述方法包括 W下步驟：
[0011] (1)配制殼聚糖-多壁碳納米管分散液；殼聚糖加入體積濃度0. 1%的己酸水溶液 中，振蕩均勻配制得到濃度為0. Img/mL的殼聚糖分散液，然后向殼聚糖分散液中加入多壁 碳納米管，超聲混合均勻，配制得到多壁碳納米管濃度為0. Img/mL的殼聚糖-多壁碳納米 管分散液；
[001引 似含有低濃度酪類有效成分的待測樣液中加入步驟（1)配制的殼聚糖-多 壁碳納米管分散液，配成混合液，使所述混合液中含有的多壁碳納米管的濃度為0. 25? 4. 00 y g/mU混合液的抑值為5?9,震蕩富集1?lOmin后，過濾，所得固體用洗脫劑洗 脫，收集洗脫液，即為富集樣液，禍旋、離屯、后取上清液用液質聯用儀扣HPLC-Q-TOF/M巧檢 巧。，得到富集樣液中酪類有效成分的總離子流色譜圖和各成分的提取離子色譜圖；
[001引 做W綠原酸的對照品配制不同濃度的對照品溶液，按照步驟似中富集樣液的 同樣條件用液質聯用儀檢測，獲得綠原酸對照品的提取離子色譜圖，W綠原酸對照品溶液 的提取離子色譜圖中色譜峰的峰面積為橫坐標，W綠原酸對照品的進樣量為縱坐標，制作 綠原酸標準曲線，按同樣方法制作木梶草巧標準曲線、蒙花巧標準曲線、木梶草素標準曲 線、芹菜素標準曲線、香葉木素標準曲線、金合歡素標準曲線；根據富集樣液的各成分的提 取離子色譜圖中色譜峰的峰面積及各成分的標準曲線，計算得到富集樣液中綠原酸、木梶 草巧、蒙花巧、木梶草素、芹菜素、香葉木素、金合歡素的含量；
[0014] (4)計算富集倍數；
[0015] 取綠原酸對照品，配制成濃度為0. 1 y g/mL的綠原酸稀釋液，按照步驟（2)的相 同的方法條件，加入殼聚糖-多壁碳納米管分散液進行富集、檢測，得到綠原酸稀釋液富集 后的樣液的提取離子色譜圖，并將綠原酸稀釋液w相同條件直接用液質聯用儀檢測，得到 綠原酸稀釋液的提取離子色譜圖，綠原酸稀釋液富集后的樣液的提取離子色譜圖中色譜峰 的峰面積與綠原酸稀釋液的提取離子色譜圖中色譜峰的峰面積之比，即為綠原酸的富集倍 數；
[0016] 按照上述方法分別計算木梶草巧、蒙花巧、木梶草素、芹菜素、香葉木素、金合歡素 的富集倍數；
[0017] (5)根據綠原酸、木梶草巧、蒙花巧、木梶草素、芹菜素、香葉木素、金合歡素各自的 富集倍數，富集樣液中綠原酸、木梶草巧、蒙花巧、木梶草素、芹菜素、香葉木素、金合歡素的 含量除W各自的富集倍數，換算得到待測樣液中酪類有效成分的含量。
[001引本發明所述低濃度酪類有效成分是指待檢測樣品溶液中的酪類有效成分中至 少有一種成分的濃度在0. 1 y g/mL W下，用常規液質聯用儀直接進樣難W檢測得到。具 體的，所述含有低濃度酪類有效成分的待測樣液是指待測樣液中含有的綠原酸、木梶草 巧、蒙花巧、木梶草素、芹菜素、香葉木素、金合歡素中的至少一種成分的濃度在0. lug/ mL W下，常規