專利名稱：大片段脫氧核糖核酸芯片及其制造方法
技術領域：
本發明涉及一種用于生命信息儲存和處理的DNA(脫氧核糖核酸)芯片(DNAchip)的結構改進及其制造方法，具體地說，是一種將10K～200K核苷酸對、天然的、已知其在生物體基因組的物理圖譜上的精確位置的DNA片段固化在一基底(硅片、玻璃或云母片)上的DNA芯片。
20世紀90年代中期，美國Affymatrix公司等發明的高密度DNA芯片(DNAchip)，即又稱基因芯片(Gene chip)，它是寡聚核苷酸(Oligonucleotide)探針的高密度陣列，是在一基底上人工合成小片段DNA芯片，參見美國第5,445,934號專利，這一類DNA芯片以玻璃或硅片為基底，將約1平方厘米的基底劃分為成千上萬個方格，然后覆蓋一層光敏基團。在選定的方格內，進行光照后去掉光敏感基團對此點的保護，然后加上帶有相同光敏基團的核苷酸進行在位合成；重復以上操作，即可任意定位合成所需的寡聚核苷酸系列直至制成整個芯片。參見美國第5,571639號專利，核苷酸陣列的制作也可利用計算機的參與來完成。由此可見，上述專利所公開的技術方案，其優點是可合成高密度的寡聚核苷酸(小片段DNA，或稱DNA探針)陣列，例如，已達到40萬種陣列芯片，可以最大程度地體現平行處理的原則，因此，它獲得的信息也很豐富。但是，它也有其不足之處，概述如下1.生物體基因組中存在著大量的重復序列，且每個基因均由成千上萬個核苷酸對組成，而作為小片段DNA芯片中每一組成單元DNA探針，其所含核苷酸對小于20個，因此，用它去探測一個基因則可能導致誤差；2.由于芯片中相鄰小片段DNA之間沒有足夠的間隔空間，因此，無法進行拉直分子操縱，難以對DNA探測作出精確定位；3.使用小片段DNA探針，無法尋找完整的新基因，科學實驗已表明，通過信使核糖核酸(mRNA)及其互補DNA(cDNA，即基因中表達為蛋白質的那部分DNA序列)確實可找到DNA的表達區，但將這一段基因插入質粒(一種載體DNA)載體，再轉移至大腸桿菌中，但并不一定能表達，非得把與該基因相關的非表達區域一起轉移才能表達，因此尋找完整的新DNA不能簡單地從mRNA出發，必須從天然的大片段DNA鏈中去找。
4.某一基因的突變，往往會影響幾個基因，這就是許多常見病或癌癥與多基因相關的道理，因此，必須從基因組的觀念上從整體上去研究，已有的小片段DNA芯片無法勝任。
本發明的目的是提供一種大片段DNA芯片及制造方法，系將含有10K～200K核苷酸對天然片段DNA固化在一基底上，形成大片段DNA芯片。
本發明的另一目的是提供一種可使DNA分子拉直操縱的大片段DNA芯片。
根據本發明大片段DNA芯片的制作方法，其步驟包括a.芯片基底的表面處理將玻璃或云母或云母片表面用1％的3-氨基丙基硅烷(APS)水溶液處理活化，b.將光生物素(PHOTOBIOTIN)試劑均勻覆蓋上述經處理的基底表面，c.芯片基底的表面生物素化取經過表面活化的基底(2×2平方厘米)，在基底中間區利用虛線狀結構的掩膜(MASK)作光刻曝光處理，定位在大小為2微米×25微米的單元內將芯片基底生物素化，隨后清洗掉未曝光區間的光生物素，同一行單元之間的距離為25微米；每行共200個單元，行間距為100微米，共100行，整個芯片上共有100×200個單元；每個單元地址以AB來標記，其中A為行數，B為列數，d.加入抗生物素蛋白(AVIDIN)和末端帶有生物素的大片段DNA；用自動高速微量點滴儀器在芯片的已經結合生物素的單元上與濃度為1納克/微升、末端共價結合生物素的大片段DNA以及抗生物素蛋白相互作用20分鐘，采用“生物素—抗生物素蛋白—生物素—DNA”的方法固定DNA，e.重復步驟b～d，在芯片基底的每個單元固定不同的大片段DNA，f.用水清洗芯片，至此，完成了1型大片段DNA芯片的制作，g.分子操縱處理I型芯片經拉直操縱方法拉直其上的DNA，完成了II型大片段DNA芯片的制作。
按照本發明方法制成的大片段DNA芯片，包括基底和以陣列有序集成固接在其表面的片段DNA，其特征在于該每一片段DNA系為10Kb-200Kb的天然的大片段DNA，該大片段DNA的地址與細菌人工染色體庫或酵母人工染色體庫的地址存在確定的對應關系，在芯片中的大片段DNA陣列單元，其每一行上置設的大片段DNA形成一虛線結構，且相鄰行上的大片段DNA位置成相交錯布設，而同一列相鄰單元之間的距離至少等于大片段DNA的分子拉直長度，并且DNA分拉直操縱系沿與該虛線垂直朝下方向。具體地說，本發明之大片段DNA芯片的面積為2×2平方厘米，其分成100×200個單元，每個單元為2微米×25微米，同一行單元之間的距離為25微米，每行共200個單元，行距為100微米，共100行，也即在每一平方厘米基底上固化2×104種大片段DNA，最后，還要指出，根據本發明對大片段DNA芯片的檢測方法，系采用納米顯微術，包括采用原子力顯微鏡和掃描近場光學顯微鏡來探測大片段DNA芯片上的分子標記或熒光信號的分布及定量分析。
本發明與已有技術相比具有實質性的進步1.本發明大片段DNA芯片，其每一大片段DNA探針含10K-200K堿基對，而已有技術中的芯片DNA探針含＜20堿基，因此，大大擴展其應用范圍及達到更高的層次，例如，可用于完整新DNA定位、尋找；用于單個核苷酸多態性位點(SNPS)系統搜索尋找和監視；用于DNA組遺傳作圖、DNA組物理圖譜補缺，DNA測序有序化探索；2.在芯片的制造工藝上，除了噴墨法，點滴法外，特別是與DNA分子操縱相結合，經拉直操縱方法將芯片上的大片段DNA拉直，從而可作精確測量定位；3.制成的芯片可用熒光顯微鏡和能對大樣品精確定位的納米顯微鏡(原子力顯微鏡AFM、掃描近場光學顯微鏡SNOM系統)予以檢測。
本發明的


如下圖1是本發明的制造方法流程示意圖。
圖2是本發明的大片段DNA芯片結構示意圖。
圖3是本發明的大片段DNA芯片特定DNA陣列大小示意圖。
圖4是本發明的I型DNA芯片結構示意圖，顯示其未作DNA拉直操縱，其可由熒光信息定性顯示單個核苷酸多態性(SNP)的分布情況。
圖5是本發明的II型大片段DNA芯片中特定單元結構示意圖。
圖6是對本發明II型大片段DNA芯片自動大規模拉直的DNA的原子力顯微鏡照片，線條即為拉直的DNA。
圖7是對本發明II型大片段DNA芯片帶分子標記的拉直的DNA的原子力顯微鏡照片，DNA為線性的，其上的亮點為分子標記。
根據圖1～圖5給出本發明較好的實施例。
實施例一參閱圖1，如圖所示，本發明的大片段DNA芯片的制作方法，先提供表面極其平整的基底如硅片、玻璃或云母片進行硅烷化處理，并且用生物素進行處理，再根據生物素(Biotin)-抗生物素蛋白(Avidin)的強烈的專一性相互作用，在基底—生物素上接上抗生物素蛋白，將某個生物體DNA組(例如水稻的DNA組)的大片段DNA(10,000～200,000核苷酸對)末端也接上生物素，采用噴墨法或定位點滴的方法，將不同DNA片段有序地集成在基底上。
另又如圖2、圖3所示，本發明的大片段DNA芯片，每一DNA陣列大小為25微米×2微米，在1厘米×1厘米的芯片上，將有200×100個不同陣列，其上可固化20,000種不同的大片段DNA。
如圖4所示，本發明之I型大片段DNA芯片，未作DNA拉直操縱，由熒光信息，可知單個核苷酸多態性(SNP)的分布情況，而本發明之II型大片段DNA芯片中的特定單元，例如地址(Add1)之特定單元，由原子力顯微鏡(AFM)成像和檢測，如圖5所示，精確測定了單個核苷酸多態性(SNP)的位置，依如下公式計算離端點的堿基對D＝d(微米)×K(堿基對/微米)，其中d-物理距離，D-堿基對(bps)數目，K-拉直系數，約等于2000。
本實施例的制作過程是
云母表面用1％的3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APS)水溶液處理3分鐘，真空干燥。將每毫升10毫克的生物素-N-羥基丁二酰亞胺酯(BNHS)的二甲亞砜(DMF)與等體積每升0.2摩爾的碳酸氫鈉(NaHCO3)水溶液的混合，取經APS處理的云母2平方厘米，在云母上利用點滴方法滴加上述混合溶液；20分鐘后，用蒸餾水沖洗云母表面，再與每毫升1毫克的抗生物素蛋白水溶液相互作用20分鐘，用蒸餾水沖洗；接著與濃度為每微升1納克、末端共價結合生物素的DNA相互作用20分鐘。將比較DNA樣品和熒光標記的單個核苷酸多態性(SNP)酶與云母表面DNA相互作用，在熒光顯微鏡下，根據其熒光分布及強弱，可發現其單個核苷酸多態性(SNP)酶的分布，也即SNPS的分布情況。
實施例二云母表面用1％的3-氨基丙基硅烷(APS)水溶液處理3分鐘，真空干燥。將每毫升10毫克的生物素-N-羥基丁二酰亞胺酯(BNHS)的二甲亞砜(DMF)與等體積每毫升0.2摩爾每升的碳酸氫酸氫鈉(NaHCO3)水溶液的混合，取經APS處理的云母表面，在云母上利用點滴方法滴加上述混合溶液。20分鐘后，用蒸餾水沖洗云母表面，再與每毫升1毫克的抗生物素蛋白水溶液相互作用20分鐘，用蒸餾水沖洗；接著與濃度為每微升1納克、末端共價結合生物素的DNA相互作用20分鐘。用水沖洗，然后經“動態分子梳”方法拉直在云母片上的DNA。將比較DNA樣品和熒光標記的單個核苷酸多態性(SNP)酶與云母表面上拉直的DNA相互作用，然后經原子力顯微鏡成像，并精確測定單個核苷酸多態性(SNP)酶在拉直的DNA鏈上離DNA末端固定點的距離。
實施例三1.云母表面用1％的3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APS)水溶液處理活化。光生物素(PHOTOBIOTIN)試劑均勻皙蓋上述經處理的云母表面。
2.然后進行有序化分區，整個1×1平方厘米的云母上共分100×200個單元；同一行單元之間的距離為25微米，每行共200個單元；行間距為100微米，共100行。每個單元的地址以AB來標記，其中A為行數，B為列數。
3.取上述經過表面活化并分區的云母，利用虛線狀結構的掩膜(MASK)作光刻曝光處理，定位地在大小為2微米×25微米的單元內將芯片基底生物素化。隨后清洗掉未曝光區的光生物素。
4.加入抗生物素蛋白(AVIDIN)和末端帶有生物素的大片段DNA用自動高速微量點滴儀器在芯片的已經結合生物素的單元(即已經與光生物素相互作用的單元)上與濃度為1納克/微升、末端共價結合生物素的大片段DNA以及抗生物素蛋白相互作用20分鐘，采用“生物素—抗生物素蛋白—生物素—DNA”的方法固定DNA；5.重復2-4步驟，從而使芯片的每個單元均固定上不同的大片段DNA。這些DNA可以來自細菌人工染色體(BAC)或酵母人工染色體(YAC)庫，其在芯片上的位置按照AB的方式確定的，而每一個地址上的DNA均與其細菌人工染色體(BAC)或酵母人工染色體(YAC)庫中的DNA有序地聯系起來了；用水清洗芯片，并經拉直操縱方法拉直其上的DNA；將上述芯片與樣品DNA、SNPS酶相互作用，利用原子力顯微鏡及掃描近場光學顯微鏡精確測定SNP位點。本實施例的結果如圖6和圖7所示。
權利要求
1.一種大片段DNA芯片的制作方法，其步驟包括a.基底表面處理將玻璃或云母或云母片表面用1％的3-氨基丙基硅烷水溶液處理活化，b.將光生物素試劑均勻覆蓋上述經處理的基底表面，c.基底表面生物素化取經過表面活化的芯片在基底中間區利用虛線狀結構的掩膜作光刻曝光處理，定位在大小為2微米×25微米的單元內將芯片基底生物素化，隨后清洗掉未曝光區間的光生物素，同一行單元之間的距離為25微米；每行共200個單元，行間距為100微米，共100行，整個芯片上共有100×200個單元；每個單元地址以AB來標記，其中A為行數，B為列數，d.加入抗生物素蛋白和末端帶有生物素的大片段DNA用自動高速微量點滴儀器在芯片的已經結合生物素的單元上與濃度為1納克/微升、末端共價結合生物素的大片段DNA以及抗生物素蛋白相互作用20分鐘，采用“生物素—抗生物素蛋白—生物素—DNA”的方法固定DNA，e.重復步驟b～d，在芯片的每個單元固定不同的大片段DNA，f.用水清洗芯片，至此，完成了1型大片段DNA芯片的制作。
2.根據權利要求1所述的大片段DNA芯片的制作方法，其特征在于還有分子操縱處理1型芯片經拉直操縱方法拉直其上的DNA，完成了II型大片段DNA芯片的制作。
3.按照權利要求1所述的大片段DNA芯片的制作方法制成的大片段DNA芯片，包括基底和以陣列有序集成固接在其表面的片段DNA，其特征在于該每一片段DNA系為10Kb-200Kb的天然的大片段DNA。
4.根據權利要求3所述的大片段DNA芯片，其特征在于芯片中的大片段DNA的地址與細菌人工染色體庫或酵母人工染色體庫的地址存在確定的對應關系。
5.根據權利要求3所述的大片段DNA芯片，其特征在于芯片中的大片段DNA陣列單元，其每一行上置設的大片段DNA形成一虛線結構，而相鄰行上的大片段DNA位置成相交錯布設。
6.根據權利要求5所述的大片段DNA芯片，其特征在于芯片中同一列相鄰單元之間的距離至少等于大片段DNA的分子拉直長度。
7.根據權利要求6所述的大片段DNA芯片，其特征在于芯片中的大片段DNA分拉直操縱系沿與該虛線垂直朝下方向。
8.根據權利要求3所述的大片段DNA芯片，其特征在于芯片的面積為2×2平方厘米，其分成100×200個單元，每個單元為2微米×25微米，同一行單元之間的距離為25微米，每行共200個單元，行距為100微米，共100行。
9.根據權利要求8所述的大片段DNA芯片，其特征在于每一平方厘米基底上固化2×104種大片段DNA。
10.一種檢測大片段DNA芯片的方法，采用納米顯微術，包括采用原子力顯微鏡和掃描近場光學顯微鏡來探測大片段DNA芯片上的分子標記或熒光信號的分布及定量分析。
全文摘要
一種大片段DNA芯片及其制造方法,其制作步驟主要是先對基底作硅烷化處理,再行生物素處理、和對基底上的生物素接抗生物素蛋白,并將某個生物體基因組的大片段DNA末端也接上生物素,采用噴墨法或定位點滴法將不同DNA片段有序地集成在基底上。本發明的DNA芯片,其每一片段DNA系為10K～200K核苷酸對,每一行上的DNA片段呈虛線狀且相鄰行上的DNA片段成交錯布設,同一列上相鄰單元的間隔空間為DNA分子操縱拉直空間。
文檔編號G01N33/53GK1242430SQ9811096
公開日2000年1月26日 申請日期1998年7月17日 優先權日1998年7月17日
發明者李民乾, 胡鈞, 歐陽振乾, 張益 , 徐元森, 鄭養鉥, 趙建龍, 陳海寶 申請人:中國科學院上海原子核研究所, 中國科學院上海冶金研究所, 中國科學院上海有機化學研究所