專利名稱：終點明顯的時間溫度指示劑的制作方法
技術領域：
本發明涉及用以指示產品的時間-溫度歷程的指示劑體系。更具體地說，本發明涉及一種改進的新型時間溫度綜合指示劑，用以監測食品或其它物質冷藏貯存的安全極限。
檢測食品是否經歷過有害溫度條件的必要性已得到公認，在專利文獻中已敘述了許多這種指示劑裝置。這些指示劑中特別普遍的一類是用來檢測冷凍食品是否曾經解凍過的指示劑。通常，這些冷凍指示劑包括一種冷凍物質，它在某個預先選定的溫度下融化，從而以化學的或物理的方式使一種指示劑不可逆地活化。這些裝置中典型的是在美國專利3，437，010及其它文獻所提到的那些裝置。大多數冷凍食品指示劑裝置只發出解凍的信號，并不試圖測量產品的解凍時間或產品正在或曾經解凍時所達到的溫度。
另一類已知的食品指示劑采用燈芯或類似的可滲透元件的擴散或毛細作用來劃分等級，美國專利3，414，415和3，479，877中提到的那些是其中的幾個例子。
現已認識到，各種天然的和合成的物質，即使采取了諸如冷藏貯存、惰性氣氛中包裝、殺菌和加入防腐劑等預防措施，也會隨著時間的推移而變質。例如，食物、薄膜、藥物、生物制劑等，即使經過滅菌或保存在足夠低的溫度下以防止微生物分解作用，也都會隨著時間的推移而分解。分解的原因可能各式各樣，包括純粹的化學反應，例如氧化和酶促反應。因此，各類物質的允許保存期限通常都有一極限，超過此期限則某些性質會發生可覺察的變化。在食品包裝工業中希望有一種體系能夠指示何時超過此時間極限。
在這些過程中涉及的變質動力學可能極其復雜。一般來說，變質是溫度的函數，但是，產品變質的速度可以隨溫度而變，于是，在第一個溫度下觀察到一個變質速度，而在第二個溫度下則觀察到不同的變質速度。變質的總量則取決于產品在每個溫度下保存的時間，即取決于時間和溫度的綜合值。例如，由同時包裝的兩個相同的食物樣品可以看出這一點的實際影響。對于這兩個樣品都可能有一個一定的時間溫度綜合值，在這之后食物品質將發生可覺察的變化。如果一份包裝在其銷售或貯存過程中溫度升高10°或20°或更高，與在整個貯存期間保持適當的較低冷藏溫度的另一包裝相比，其品質保存期限將縮短。假如這兩個樣品都存放在通常的冷藏陳列柜中，打算購買這些包裝的消費者將無法判斷他們要購買的產品在溫度歷程上的差別。
曾有人提出過用來監測產品溫度歷程的各種體系。美國專利2，671，028在指示劑系統中使用一種酶，例如胃蛋白酶。美國專利3，751，382公開了一種酶指示劑，其中脲酶將尿素分解，反應產物使體系的PH改變。酶的活性及由其造成的分解速度依賴于溫度，于是由酶活性造成的PH變化可以用常規的酸指示劑監測。美國專利3，768，976描述了另一種體系，其中用氧化還原染料監測透過薄膜的氧而得到時間溫度綜合值。
最后，在美國專利3，942，467中描述了一種時間溫度綜合指示劑，其中包括一種產生有機酸的組分，該組分以第一反應速度發生溶劑分解作用，生成已知數量的酸。溶劑或溶劑分解介質含有已知數量的堿性物質，它足以中和在指定時間內和指定的反應溫度下由于溶劑分解而產生的酸。溶劑化反應的速度隨溫度升高而加快。用一種對PH敏感的染料指示何時已產生了數量足以中和所有堿性物質的酸。在一個優選實施方案中，使用兩個分開的、堿度不同的堿性物質與一種以上的PH敏感染料相組合。根據這一優選實施方案，指示劑溶液顯示第一種顏色，直到第一種堿性物質已被中和到足以使指示劑的PH降至第一中間區的程度，從而使顏色變成第二種中間顏色。第二種顏色保持到第二種堿性物質被中和，指示劑的PH移至酸性范圍，此時整個指示劑變成第三種顏色。
根據這一先有技術指示劑，觀察到指示劑逐漸改變顏色，產生可覺察的顏色變化的時滯比某些指示劑應用中所希望或所需要的要長。另外，由該專利顯然可見，酸性前體物質的溶劑分解需要使用特殊的溶劑組合以增加溶劑化反應的半壽期。在該專利中建議的助溶劑包括二噁烷，這一點現在看來是不理想的。這些助溶劑一般要有節制地使用。
在研制令人滿意的時間溫度綜合指示劑過程中的一個基本問題是，時間溫度分解過程的二階導數(單位溫度變化造成的速度變化)隨產品而異。因此，某些水果和漿果的單位溫度變化造成的變質速度變化與瘦肉的速度變化很不相同。奶制品的數值與漿果和肉類均不相同。因此，一種依賴于單一酶促反應或指定膜的透性的體系只適合作為某些物質的指示劑，這些物質的某種分解反應的速度變化與溫度的關系曲線有相似的斜率。
時間溫度綜合指示劑體系不限于用來在低于室溫的溫度下長期貯存期間進行監測。同樣的考慮也適用于較短的時間間隔和高溫。例如，這些體系可以用來確保產品已經充分地加熱滅菌。因此該指示劑極其適合于保證高壓滅菌的罐裝食品的確經歷了足夠的時間與溫度綜合值，滿足達到必要的微生物殺滅程度的需要。在這種情況下，以指示劑著火作為已達到或超過必要的滅菌參數的信號。類似地，這類指示劑可以用來保證外科器械已經歷了適當的滅菌條件，或是藥物的貯存時間尚未超過允許期限。同樣，這類指示劑可用在乳品工業中指示奶制品已經經過適當的巴氏滅菌處理等。
先有技術時間溫度綜合指示劑的一個主要問題是它們的時間響應通常不合格。要顯現出足以使觀察者可區分的顏色，常常要花長達指示劑壽命30%至100%的時間。
目前，隨著用于延長新鮮熟食室溫存放期限的改良充氣包裝以及更新、更安全的防腐劑的出現，消費者已經逐漸喜愛許多從前得不到的味道新鮮的高品質食品。不將食品制成冷凍形式或罐裝形式，可以將新鮮熟食進行處理，裝在改良充氣包裝中，在冷藏條件下存放足夠長的時間，以使消費者可以得到這些較新鮮的食品。一個說明性的實例是午餐盤，包括各種午餐肉，例如火雞、火腿和奶酪。使這類產品得以出現的改進已經將這些包裝內的產品的室溫存放穩定性從大約數小時到一天延長到幾天至一周。這就使得食品銷售網能夠在更長的存放時間內向消費者提供食品供其立即消費。
在理論上，對于變質情況處于監測中的貯存制品，它的某種性質在某一溫度下的變化速度與在較低溫度下的變化速度之比隨物質而異。這一比值經常按10°增量表示，用Q10表示攝氏度、a10表示華氏度下的數值。例如，在0°至-20℃范圍內生肥肉和熟肥肉的腐敗值Q10約為3，而生瘦肉和熟瘦肉的腐敗值Q10在5至6之間。蔬菜的腐敗值Q10一般在7至8之間，而水果和漿果則約為13。任何指示劑體系的組分配方都應該選擇成使單位溫度變化引起的信號顯現速度的變化與對所監測制品要求的參量相適配。指示劑的Q10值一般應該與所測指定一類食品的某一性質的Q10值接近。為實現這種適配，通常需要根據美國專利3，942，467中所述的方法正確選擇指示劑成分并適當控制這些成分的相對濃度，上述專利的方法在本文中專門引用作為參考。
因此，本發明的目的之一是提供一種改進的新型時間溫度綜合指示劑，用于適合室溫或冷藏貯存的食品，此指示劑能對產品的安全性和質量作出即時的可見指示。
本發明的另一目的是提供一種用于食品的時間溫度綜合指示劑，一旦達到安全存放極限，該指示劑就立即迅速顯現出明顯的終點信號。
本發明的又一目的是提供一種改進的新型時間溫度綜合指示劑，它可以用于多種食品和多種包裝形式中。
根據這些目的和其它目的，本發明提供了一種改進的新型時間溫度綜合指示劑，該指示劑含有由一種活性試劑和對該活性試劑有特異性的底物構成的第一特異反應對。第一特異反應對的組元，即，活性試劑及其特異底物，容易發生反應形成第一反應產物。這種第一反應產物會使指示劑的PH值向偏離中性的酸性或堿性第一方向改變或移動。
該指示劑還含有由一種活性試劑和對該活性試劑有特異性的底物構成的第二特異反應對。第二特異反應對的組元也容易發生反應形成第二反應產物。第二反應產物會使指示劑的PH向著與第一方向相反的第二方向改變或移動，最好是超出中性范圍。
指示劑組合物另外還含有至少一種對PH敏感的染料，該染料在堿性PH范圍內的PH下顯示一種顏色，而在酸性PH范圍內的PH下顯示出不同的第二種顏色。
根據本發明，第一特異反應對中底物的數量在化學計量上超過第二特異反應對中底物的數量。第一反應產物和第二反應產物容易發生反應形成第三反應產物。第三反應產物包含一種穩定的PH緩沖劑，它將指示劑的PH值保持在處于中性的第二方向一邊的某個穩定數值，直到第二反應產物不再生成。當第二特異反應對用的底物起始物質已消耗或用盡時，指示劑中的第二反應產物停止生成。在發生這種情況時，PH緩沖劑的緩沖容量很快就被第一反應產物超出，指示劑的PH由緩沖劑的PH值很快變到在中性的第二方向一邊的不同PH值。在這一過程中，指示劑顯示出從第一種顏色到第二種顏色、或從第二種顏色到第一種顏色的快速而明顯的顏色變化。
選擇指示劑組合物，使得它在相對恒定的預定溫度或溫度范圍內經過一段預定的時間后發生劇烈的顏色變化。另外，由于第一和第二特異反應對的反應速度依賴于溫度，指示劑組合物處在高于預定溫度范圍的高溫時會使兩個反應都以更快的速度進行。因此，第三反應產物將以更快的速度形成，第二反應對的底物也將在更短的時間內耗盡。結果是，與處在較低溫度下的情形相比，在更短的時間內就超過了緩沖容量而發生顏色變化。
由兩個速度依賴于溫度但一般是獨立的兩個特異反應形成一種穩定的緩沖劑，所達到的劇烈而明顯的顏色變化比先有技術的指示劑體系要快得多，先有技術的指示劑體系不是象本發明一樣從中性底物出發，而是用高酸性或高堿性的起始溶液。在這些先有技術指示劑中，隨著指示劑中各反應組分之間反應的進行，產生的反應產物逐漸有效地中和了起始溶液。由于曲線的中和部分造成的滯后時間，任何顏色變化的顯現都很緩慢。
相反，本發明的指示劑由PH中性的底物溶液開始，生成一種在中性的指定一邊具有適度PH值的穩定PH緩沖劑。第一和第二特異反應同時進行，直到第二特異反應對的底物被耗盡。此時不再形成新的緩沖劑，通常能立即觀察到第一反應產物對PH的影響。
根據一種優選的用途，本發明的指示劑用于容易受生物影響而發生品質變化的產品，指示其時間-溫度歷程。一個典型的例子包括打算冷藏貯存的熟食品，該產品由于細菌或真菌的有害影響而隨時間發生生物降解作用。食品品質的變質速度將隨其存放時間以及存放期間內的溫度歷程而變。根據一個優選的實施方案，本發明的指示劑使用選自生物來源的第一和第二特異反應對組分，并且/或選擇所用的方法，使指示劑的總Q10值與所監測產品的Q10值相近。
更具體地說，根據一個優選的實施方案，這種改進的新型時間溫度綜合指示劑含有第一特異反應對，其中包括作為活性試劑的酶或酶活性組分，以及對該酶有特異性的底物，以便反應形成作為第一反應產物的酸。還包含有第二特異反應對，其中包括作為活性試劑的不同的第二種酶或酶活性組分，以及對第二種酶有特異性的第二種不同的底物。第二反應對的組元發生反應形成堿性的第二反應產物。
根據這一優選實施方案的指示劑包括一種對PH敏感的組合染料包裝，其中含有間硝基苯酚、對硝基苯酚和石蕊的組合物或混合物。這種PH染料的組合物能使指示劑在中性至堿性PH值(＞7.0)呈綠色，在酸性PH范圍(＜7.0)顯示截然不同的淺紅色。指示劑中第一特異反應對的底物數量在化學計量上超過第二特異反應對的底物數量。根據這一優選實施方案的時間溫度綜合指示劑，在相對恒定的溫度范圍內經過一段預定的時間之后，或是在高溫下經過較短的一段時間之后，顯示出從綠到淺紅的明顯顏色變化。這里優選這種組合染料包裝是因為它采用了或產生了目前通用的標志綠-紅來表示前進-停止或使用-不使用這些狀態。如果需要，也可以使用產生其它顏色和顏色變化的其它PH染料和染料組合物。
在優選實施方案中，第二種酶/底物特異反應對包含有脲酶/尿素特異反應對，第一種酶/底物特異反應對是脂酶/甘油三乙酸酯反應對。第一種酶/底物特異反應對中的脂酶最好是存在于或來源于對甘油三乙酸酯底物有脂酶活性的微生物源。一種優選的微生物是酵母。已經發現某些消化酶的微生物源可以根據本發明用在指示劑體系中，以便提供在最關心的溫度范圍內與所測變質情況相象的更準確的溫度響應曲線。
微生物作用對產品品質的有害影響可以按本發明的這一優選實施方案來監測，其作法是監測有關人工體系隨溫度和時間而變的活性，該體系中含有與目前優選的指示劑中所含微生物類似的微生物。換言之，根據本發明摻加了微生物作為試劑的指示劑使用同類物質測量同類物質。另外，使用第一和第二兩組酶/底物特異反應對，可以達到比只含一個酶/底物反應對的先有技術指示劑體系更快速、活性更強的溫度靈敏性。這是因為，作為指示劑組分使用的酶和/或具有酶活性的微生物，與上述美國專利3，942，467中使用的無機試劑相比，具有更高的Q10值。此外，使用兩種中性底物與酶試劑相組合形成的指示劑體系是均勻的溶液，這也有助于縮短指示劑的反應時間。如果食品在高溫下的暴露時間超過了安全水平，則要求或希望指示劑在數小時內，最好是在數分鐘甚至數秒鐘內發生快速而明顯的顏色變化，以便指示出腐敗狀態。
本發明的一個優選實施方案中，改進的新型指示劑依靠脲酶/尿素底物反應對來測量或計算出預定的時間溫度綜合值中的時間分量。尿素在脲酶存在下于水相介質中分解成銨離子和碳酸根離子的反應速度，在對新鮮的冷藏食品所預期的溫度范圍內，即約25°F至110°F，比對冷凍食品了解得更清楚。對于指定數量的脲酶，直到尿素底物向終產物氨和二氧化碳的轉化完成或消耗光所經歷的時間，取決于該溫度范圍內的反應速度和尿素底物的起始濃度。通過改變指示劑中尿素底物的起始濃度，可以調節耗盡尿素底物所需的時間，以便為這種組合的綜合指示劑確立所要求的最大期限或終點。
這種組合指示劑的溫度監測組分或熱歷程監測部分，是由指示劑的酵母或脂酶/甘油三乙酸酯底物競爭性第一特異反應對形成的。酵母/甘油三乙酸酯反應每消化-摩爾甘油三乙酸酯生成-摩爾甘油和三摩爾乙酸。
根據本發明，指示劑可以放在小袋內，小袋可以貼在銷售前的貯存和輸運期間打算保持在40°F的包裝上。一旦指示劑的各組分相互混合，它的兩個酶/底物轉化反應都分別以第一速度進行，這由40°F的溫度決定。如果冷藏過程出了故障，或是產品在炎熱的夏天停放在裝卸碼頭上未加以冷藏，該產品的溫度在短時間內就會升高若干度。溫度每升高10°F，酵母/脂酶甘油三乙酸酯反應速度的增加相當于脲酶/尿素反應速度增加的12倍。結果，當暴露于更高溫下時第一和第二反應產物急劇增多。反應產物之間相互反應形成穩定的PH緩沖劑，直到尿素底物被消耗光。在這之后，指示劑溶液的PH很快下降到酸性范圍。指示劑或是由于在恒定的40°F溫度下經過一段指定的時間而達到其終點，或是在較高溫度下經過相對較短的一段時間而達到其終點。
根據本發明的一個特別優選的實施方案，現已意外地發現，在按照本發明的作法制得的指示劑中包含一種微生物源作為一個特異反應對中的至少一種酶活性試劑，則通過對微生物作休克處理能提高指示劑的溫度靈敏性。這種經過休克處理的優選指示劑在不良溫度下在較短時間內即發生可見的明顯顏色變化。另外，優選的休克指示劑在非應激的冷藏溫度下貯存時存放期限延長。
根據本發明的這一方面，在將指示劑裝在產品包裝上之前對含微生物的指示劑組合物進行休克處理，意外地改進了時間-溫度綜合指示劑。更具體地說，微生物的休克處理一般是這樣一種過程，它改變或部分改變了微生物的細胞結構，但是亞細胞結構或蛋白質不發生改變或變性。處理過的微生物的孢子可以直接使用。這里稱為休克處理的用來破壞或改變微生物細胞結構的示例性方法包括熱處理、巴氏滅菌法、超聲、輻射、用酸或堿化學處理或上述方法的組合。休克處理不應激烈到破壞微生物所提供的酶的生物特異活性，或破壞由微生物亞細胞結構提供的對消化作用或其它反應起決定作用的其它蛋白質結構。
熱休克過的微生物在不良溫度下的響應更快，為在指示劑的堿性一邊使用較高含量的尿素創造了條件。這一令人驚奇的意外發現意味著現在可以提供用來監測存放期限更長的產品的時間-溫度敏感性指示劑。雖然不打算討論任何具體的理論，但與未經休克處理的微生物相比，熱休克微生物的性能改進可能是由于微生物的細胞膜限制了溶液效應(例如擴散)，可能會減少底物分子和酶的接觸。在休克處理的微生物指示劑中，微生物的細胞膜已被破壞，使酶得以釋放到溶液中，底物分子來往于酶的擴散也更完全。
從經濟觀點看，這類用微生物試劑的指示劑也是很誘人的，因為只要很少量的微生物就能提供令人滿意的酶含量。很大數量的微生物可以比較便宜地制得。由于能夠對微生物進行休克處理從而得到被破壞的微生物，增加了使用這些材料的安全性而不使成本顯著增加。另外，可以使用未處理的微生物得到所要的酶，然后進行休克處理。與分離和純化酶的成本相比，這在經濟上也是誘人的。
本發明的這種改進的新型指示劑可以放在欲監測的產品上或其附近。這種綜合指示劑可以帶有許多形式之中的任何一種包裝。指示劑小袋或封套最好由被批準用于這類產品包裝的透明薄膜卷做成。在指示劑小袋內可以放一片濾紙，并可將很少量的預先混合的指示劑滴加到濾紙上形成一個指示劑斑。將小袋封口，然后放在包裝上，使得從產品包裝外面可以看見上述斑點。制得的指示劑小袋在使用前可以在低溫下貯存，最好是在0°以下貯存。使用時可以從低溫貯器中取出冷凍的小袋，用壓敏膠帶或其它合適的固定方法將其固定在產品包裝的外面。
或者是，指示劑體系可以做成二份組合物的形式，將其放在有兩個隔間的小袋中，固定在產品包裝上。獨立的兩份用易破裂的隔膜彼此分開，該隔膜可以裂開，以使指示劑的各組分在適當的起點混合，開始行使指示劑的功能。另外，可以將較小的一個裝有指示劑的密封袋或包裝薄膜材料的透明小袋放在產品包裝內易觀察的位置，或放在包裝的外面，以便提供新鮮程度的可見指示。正如上面曾提到的，可以用任何合適的方法，包括用膠粘劑和/或單面和雙面膠帶，將指示劑小袋固定在產品包裝上。當包裝品是食品如包裝肉時，最好將指示劑小袋放在包裝的外表面上以監測在肉或其它食品表面處產品所經受的溫度。采用這種方法，指示劑溶液通常與食品外表面處在同樣的較高溫度下，而外表面通常是產品最早開始腐敗的部位。
本發明的其它目的和優點，在以下對本發明和實施例的詳細說明中將變得顯而易見。
根據一個優選的實施方案，本發明的改進的新型時間-溫度綜合指示劑含有第一特異反應對，其中包括一種活性試劑和一種對所述活性試劑有特異性的底物。在此優選實施方案中，第一特異反應對能發生反應形成第一反應產物，該產物引起或傾向于引起指示劑組合物的PH值向中性值的酸性一邊的酸性第一方向變化。第一特異反應對是為了在指示劑中產生酸。
這里所說的“特異反應對”是指活性試劑及其底物的一種可觀察到的生物特異傾向，這種傾向使它們能發生反應形成指定的反應產物，而不管通常會阻礙或不利于非生物特異相互作用的其它因素存在與否，這些因素包括PH(在一定限度內)、溶液效應、反應物的相對濃度、溶液中其它物質存在與否等。作為示例的特異對反應包括酶及其底物之間的反應、酶-輔因子相互作用、抗體抗原反應、免疫反應及其它類型的生物特異相互作用，這里僅舉幾例。
在優選的第一特異反應對中，活性試劑具有與第一底物反應生成酸性的第一反應產物的活性，該活性試劑最好是一種酶或一種對該底物有酶活性的微生物或實體。特別優選的第一特異反應對包括以單獨的形式或以與添加的脂酶相組合的形式作為活性試劑的酵母和作為底物的甘油三乙酸酯。可以作為第一活性試劑使用的其它產酸微生物包括乳酸桿菌，它與葡萄糖反應產生乳酸。能消化各種糖或碳水化合物產生生物酸或有機酸(例如乳酸)的其它產乳酸有機體，包括乳酸桿菌、鏈球菌和足球菌，也可以與它們各自的碳水化合物底物一起使用而構成第一特異反應對。
作為第一特異反應對使用的活性試劑及其特異底物通常是市售商品，可以從許多途徑得到。例如，一種合適的酵母以商品名稱REDSTAR銷售。乳酸桿菌可以從MicrolifeTechnologies公司(Sarasota，Florida)以LACTACEL的商品名稱得到。甘油三乙酸酯和各種葡萄糖及碳水化合物溶液可以從許多商業機構得到。
指示劑中的第二特異反應對用來產生堿，它將指示劑的PH改變或傾向于改變到中性值的堿性一邊，并且將PH保持在堿性范圍，直到第二對底物被耗盡。
第二特異反應對也含有一種活性試劑和第二底物，活性試劑與底物作用生成堿性的第二反應產物。第二特異反應對中的活性試劑最好也是一種酶或是對選定用來生成堿的底物具有酶活性的生物或實體。在優選的實施方案中，第二特異反應對能發生反應形成包括氨在內的第二反應產物。因此，優選已知能產生氨的酶-底物對。特別優選的第二特異反應對的組元是脲酶和尿素，以及顯示出明顯的脲酶活性的微生物和尿素底物。其它已知能在蛋白質、氨基酸或含氮堿的消化、代謝或分解代謝中產氨的酶也可以成功地使用。脲酶有很多形式的市售商品。一種商品形式是Sigma化學公司的刀豆粉，其脲酶活性有文獻記載。用于脲酶/尿素這種酶/底物對的尿素底物是可以由許多來源得到的標準化學試劑。
脲酶的用量及尿素底物的相對用量可以在合理的限度內變化。例如，脲酶的濃度應當足夠高，以使指示劑最初顯示的PH緩沖劑特有的綠色足夠強。脲酶用量的上限可以用接近報酬遞減點的方法確定，即，在該點時加入更多的脲酶不會使指示劑中尿素分解產物的形成速度有明顯增加，但卻不必要地增加了花費。
加到指示劑中的尿素的相對比例可以改變指示劑功能中的時間分量。例如，對于給定數量的脲酶，改變加到指示劑中的尿素的濃度將會改變非溫度應激型指示劑樣品達到終點信號所需的時間。例如，在最初的尿素起始濃度下，指示劑可能在80°F下兩天后達到其變色時間終點信號，而在更高的起始濃度下，同樣的指示劑體系要花3.5天才達到其時間終點信號顏色變化。
本發明的改進的新型時間溫度綜合指示劑體系包含至少一種對PH敏感的染料。在優選的實施方案中，指示劑包含一種其中含有間硝基苯酚、對硝基苯酚和石蕊的PH敏感型組合染料包裝。間硝基苯酚和對硝基苯酚在PH7.0以上的堿性范圍顯黃色，在PH7.0或更小時急劇地變成無色。石蕊染料在高于PH7.0的堿性范圍內顯深藍色，在低于PH7.0的酸性范圍則顯示截然不同的淺紅色。因此，這種優選的組合染料使指示劑溶液顯綠色，直到尿素底物與第三反應產物PH緩沖劑完全耗盡，指示劑體系的PH已移至酸性范圍時，才快速而清晰地顯示出淺紅色。對PH敏感的染料包裝應該在中性區PH＝7.0附近產生明顯的顏色變化，而且最好是依靠不易弄錯的信號，例如從綠變成紅，發出到期警告。雖然上述包裝是優選的，但是也可以使用其它組合，例如溴百里酚藍和中性紅組合。如果采用后一種組合，指示劑最初呈綠色，在酸性范圍內則變成橙紅色。
指示劑溶液最好是水溶液或是所有成分的混合物，可以含有可有可無的其它組分，例如磷酸二氫鈉緩沖劑和/或供微生物用的碳水化合物能源(例如，最好可以提供葡萄糖)。指示劑還可以包含一種與水混溶的助溶劑，例如任何極性有機溶劑，包括低級鏈烷醇(如乙醇)、液態酮(如丙酮或甲乙酮)等。
根據本發明，剛好在食品一起包裝之前將指示劑溶液的各組分預混合。這就開始了指示反應的化學過程，因此，在混合后立即由第二酶/底物對穩定地產生出氨，其反應速度由環境溫度決定。組成本發明指示劑的各組分的總量由下述考慮決定，例如制造工藝成本、材料的相容性、用途等，這些因素本身又在很大程度上由方便程度或設計選擇決定。因為一旦將各組分混合或相互接觸，指示劑體系就開始反應，所以顯然這些組分可以保持分離，直到希望指示劑被啟動為止。因此，構成指示劑的各組分可以封裝在與食品包裝連接的易破裂的容器內，或是使用一種簡單的單囊小袋或封裝容器。在一種分成兩部分的包裝中，指示劑的包裝方式可以是，使易破裂隔膜包裝的一部分裝入酶和負責至少提供第二酶組分的微生物。美國專利3，977，945中敘述了一種分兩部分的包裝實例。染料和底物可以放在隔膜包裝的另一間中。使用時，擠壓泡形包裝使兩部分之間的隔膜破裂，以便混合形成指示劑。產品的包裝材料最好是透明的并且由化學上惰性的彈性材料制成，例如聚乙烯薄膜。另外，指示劑小袋的包裝最好也由聚乙烯薄膜制成。小袋或封套可以帶有粘性背襯或可以以其它方式固定在食品包裝上。
另一種方法當然也可以將指示劑的各組分在制造過程中混合在一起裝入單室容器中密封起來。在一個優選的實施方案中，將指示劑加到一片濕濾紙上，濾紙放入小袋或封套中，粘貼在食品容器的外表面。根據這種單室法，可以將一卷吸收基底帶打開，使其通過一個處理工段。可在處理工段將混合的指示劑組合物涂敷在基底帶上形成濕指示劑帶。可以將濕帶重新卷在卷軸上并冷凍之，直到可以將它切成小片插入小袋封套中。如果愿意，也可以將濕帶切割并裝入小袋或連續的一串小袋長條中，隨后冷凍之。指示劑溶液的冷凍可能有助于防止發生反應，也可以大大減小反應速度，以便使指示劑在冷凍或冷藏時被有效地“固定”或“停住”，直到它們準備使用。
由以下工作實施例可以明顯地看出本發明的其它目的和優點。
實施例1一種改進的新型時間-溫度綜合指示劑制備如下為制得過濾滅菌的2%冷脲酶試劑溶液，將2克具有脲酶活性的刀豆粉(Sigma化學公司)與100毫升去離子水混合，加入硅藻土助濾劑。將混合物經過0.2微米的Millipore濾膜冷過濾，得到約100毫升透明的、基本上無菌的脲酶水溶液。
指示劑的A部分是通過配制以下物質的溶液制得的2.0克0.4M NaH2PO46.0克甘油三乙酸酯1.0克葡萄糖0.4克尿素5.0克以上制得的2%冷過濾脲酶溶液0.1克干酵母用于指示劑組合物B部分的溶液制備如下在裝有約50毫升去離子水的100毫升容量瓶中加入0.01克間硝基苯酚、0.01克對硝基苯酚和0.05克石蕊，將混合物攪動，直到每種對PH敏感的染料都完全溶解，形成透明溶液。
然后在容量瓶中的B部分染料溶液中加入10克A部分的溶液，溶液轉變成適中的綠色。再加入10克試劑級乙醇，用去離子水將容容量瓶中的混合溶液稀釋到體積為100毫升。
為了把指示劑溶液摻加到適用于食品包裝的指示劑標簽中，先從白濾紙上切下直徑1/4英寸的圓片。將圓紙片放在封套或小袋中，封套和小袋由厚度為2密耳的低密度線性聚乙烯薄膜制成，其大小約為1/2英寸見方。小袋的三個邊在一臺DYNO包裝機上熱封。將濾紙插入這樣做成的小袋的內腔。然后用自動移液器將30微升綠色的指示劑溶液加到濾紙圓片上，用DYNO包裝機立即封上小袋的頂部開口。
將裝有指示劑的小袋轉移到一臺保持80°F的控溫箱中。在這些條件下，實施例1的指示劑組合物在2.0天內從綠色的圓片變成鮮艷的淺紅色圓片。
實施例2用實施例1中的同樣方法制備另一種指示劑溶液，但是加到A部分溶液中的尿素數量從0.04克增加到0.1克。
將這種指示劑放在指示劑小袋標簽中，按照實施例1的方法在80°F進行試驗。實施例2的指示劑在3.5天內從綠色變成淺紅色。
實施例3-5以下實施例說明了將摻混到指示劑組合物中的微生物進行休克處理所獲得的性能改進。
用含有0.05%石蕊、0.01%對硝基苯酚、0.01%間硝基苯酚和10%試劑乙醇的溶液，將含有0.0011%磷酸鈉、6%甘油三乙酸酯、1%葡萄糖、0.4%尿素、0.1%刀豆粉和0.1%酵母的水溶液稀釋1到10倍。直接使用干酵母或將它與水混合并在180°F、190°F、200°F的水浴中加熱1小時。然后冷卻至37°F。
將半英寸的圓紙片(SchleicherandSchnell公司)浸入溶液中，放進聚乙烯小袋里，在-65°F冷凍，真空密封并在80°F貯存。
所得結果列在如下的表1中。
表1熱休克處理對指示劑性能的影響實施例處理方式在80°F達到終點的天數A未受熱3.343180°F1小時 3.094190°F1小時 2.715200°F1小時 2.22實施例6-13用不同數量的尿素重復實施例3-5的同樣溶液制備方法。
將用于試驗樣品的酵母與水混合，在蒸汽臺上加熱1/2小時(溫度達到165°F)。將指示劑保持在80°F和40°F。
所得結果列在如下的表2中表2在熱休克過的指示劑中改變尿素底物濃度的影響實施例6 B7 C8D9E尿素含量(重量％)0.1% 0.1%0.2%0.2% 0.3% 0.3% 0.4% 0.4%到達終點的時間(天)在80°F.0.4 1.04 1.211.831.772.342.63 3.34在40°F.- －－－－－－－
表2(續)實施例10F 11G 12 H 13I尿素含量 0.1% 0.1%0.2%0.2%0.3%0.3%0.4%0.4%(重量％)達到終點的時間(天)在80°F.- - - - --- -在40°F 16.5016.5144.0142.0354.9042.43 88.00 67.14試驗樣品的平均Q10值(每改變10℃的反應速度變化)約為13.5，而對照樣品為9.0。
增加尿素含量延長了指示劑在40°或更低的冷藏溫度下的存放期限。但是，在本體系中使用濃度有限的尿素，因為未經處理的微生物在80°F或更高的不良溫度下對于產生指示劑的可見變化響應緩慢。“熱休克”的微生物在不良溫度下響應較快，從而有可能使用較高濃度的尿素。于是，研制出一種對溫度敏感的指示劑，它在不良溫度下于較短的時間內產生可見的變化，而在冷藏的溫度下則在較長的時間內產生可見變化。
微生物的處理可能不限“熱休克”。其它的實例可能包括巴氏滅菌、超聲、輻射、化學處理、酸度、堿度或它們的任何組合。一般來說，任何能改變或部分改變微生物細胞(但不是孢子)的方法都被認為是適當的。可以采用直接使用純孢子的方法。
實施例14另一種改進的新型時間-溫度綜合指示劑制備如下按下述方式制備一種無酸的生物酶活性試劑由MicrolifeTechnologies公司(Sarasota，Florida)得到以商品名稱LACTACEL115銷售的冷凍的足球菌漿體樣品。LACTACEL115是作為制作香腸用的起子培養物出售的。將0.5克冷凍漿體樣品解凍。解凍后的細菌溶液的PH約為5.0。將2.5盎司(約75毫升)解凍的LACTACEL置于燒瓶中，用去離子水沖稀至450毫升。稀釋過的樣品在一臺International離心機上以2000轉/分離心30分鐘。小心地倒掉上層的水。用去離子水將濃細菌再稀釋到450毫升，再離心。再次小心地將上清液倒掉。將剩下的細菌殘余物重新懸浮在去離子水中至體積為75毫升。洗滌過的LACTACEL產品的PH為7.0。將這75毫升洗滌過的樣品冷凍，保持-60°F備用。
根據本發明的另一種指示劑組合物是通過配制以下成分的100毫升溶液而制得的5.0毫升解凍并漂洗過的LACTACEL115;
4.62克APT培養液;
5.0克2%的刀豆粉溶液(制備方法同實施例1);
5.0克葡萄糖(可以用乳糖代替);
0.09克尿素;
0.04克間硝基苯酚;
0.004克中性紅;
0.01克溴百里酚藍。
將以上各成分攪動短時間直到形成透明的綠色溶液。
按照實施例1的方法制備指示劑標簽，包括直徑1/4英寸的圓濾紙片和1/2英寸見方的聚乙烯薄膜小袋。將30微升實施例14的指示劑溶液加到每個小袋中，在Dyno包裝機上密封。
將一部分小袋轉移到保持80°F的控溫箱中，另一組小袋則放在40°F的冰箱中。在這些條件下，實施例14的指示劑在80°F連續存放2.0天后，從綠色變成淺紅橙色的標簽。在40°F保存的小袋在至少95天后保持不變。
實施例15根據此實施例，取1000磅新鮮的火雞胸脯肉用含90%水的鹽水溶液注射。每塊火雞胸脯肉的重量為2.5磅至約3.75磅。將它們放在爐內的架子上在高濕度和160°F的干球溫度下燒烤2小時，然后在170°F的干球溫度下烤至火雞胸脯肉的內部溫度約為160°F。燒烤后，將火雞胸脯肉從爐中取出進行四分切割，然后涂上防腐液。接著將其冷卻到約32°F，真空包裝在乙烯乙酸乙烯酯與偏氯綸層壓材料的防潮隔氧薄膜中。
按照實施例14的方法制備一種指示劑標簽小袋，用壓敏膠貼在真空包裝胸脯肉的外表面上。先前的試驗表明，當這些真空包裝火雞胸脯肉小心地在40°F或更低溫度下冷藏貯存時，它們的平均存放期限約為65天。如果樣品謹慎地保持在受控的40°F條件下，則指示劑不會變色。但是，如果從40°F的冷藏儲器中取出樣品并且暴露在80°F的不良條件下，則指示劑一天就要變色。
實施例16根據此實施例，用含90%水的鹽水注射若干新鮮的火雞胸脯肉。每塊火雞胸脯肉約重9，0磅。將火雞胸脯肉真空包裝在市售的乙烯乙酸乙烯酯/偏氯綸層壓薄膜中。然后將真空包裝的火雞胸脯肉在高濕度烤箱中烘烤，直到胸脯肉的內部溫度達到160°F。然后從烤箱中取出火雞胸脯肉，令其冷至室溫。然后將冷卻的包裝放在40°F的冷藏器內。根據本發明和實施例15的方法，用膠粘劑將裝有實施例13制備的指示劑溶液的指示劑標簽小袋貼在外包裝上。指示劑標簽能有效地監測產品的時間和溫度歷程，依賴于產品試樣的貯存條件，在數天之內發生明顯的顏色變化。
實施例17可以以下述的自動化方式大量制備本發明的時間溫度指示劑。
裝備一臺指示劑小袋組裝設備，其中包括一個縱向延伸的進料軸，沿此軸安置一個濾紙卷供料器、一對分成上下兩部分的包裝薄膜卷供料器、低溫指示劑溶液槽、濾紙沖切臺、密封熔結臺(用來將包圍著濕指示劑小片的相對兩卷薄膜熔結以形成斷續分開的指示劑小袋)、打孔臺(在長條帶上打上相鄰標簽小袋之間的撕裂線)、以及一個膠帶粘貼臺(向構成小袋的其中一個薄膜卷的外表面上涂一細條膠粘劑和不干膠薄片。在該設備的下游設一臺卷帶盤。卷起的帶撕裂線的小袋條帶可以放在冷凍箱內備用。以后準備使用時可以從冷凍箱中取出卷起的條帶。沿孔線撕開，可以從卷起的條帶上剩下的小袋中取下單個的指示劑小袋。然后可從膠粘帶上撕下防粘片，將膠粘帶和小袋對著產品包裝壓按，使指示劑標簽貼在產品包裝外面。或者是，各個指示劑標簽不用膠粘帶和防粘片組合件，而是簡單地將它以清楚可見的方式放在產品包裝的外面，或者，如果產品有雙重包裝，放在兩個包裝層之間。
雖然已參照一些優選實施方案對本發明作了說明，但是本領域技術人員可以作出修改和變化，而不偏離由所附權利要求書限定的本發明的范圍和要旨。
權利要求
1.一種時間溫度綜合指示劑，該指示劑含有第一特異反應對，包括一種活性試劑和對所述活性試劑有特異性的底物，所述第一特異反應對能發生反應形成第一反應產物，第一反應產物會使指示劑的PH值向偏離中性的酸性或堿性第一方向變化；第二特異反應對，包括一種活性試劑和對所述活性試劑有特異性的底物，所述第二特異反應對發生反應形成第二反應產物，所述第二反應，產物會使指示劑的PH值向與所述第一方向相反的第二方向變化并超出中性；所述第一反應產物和所述第二反應產物本身又發生反應形成第三反應產物，所述第三反應產物包括一種穩定的PH緩沖劑，它將指示劑的PH維持在中性值的第二方向一邊的某個穩定值，直到所述第二反應產物不再生成，所述第一特異反應對中所述底物的數量在化學計量上超過所述第二特異反應對中底物的數量；至少一種對PH敏感的染料，它在堿性PH范圍內的PH下顯示一種顏色，在酸性PH范圍內的PH下顯示第二種不同的顏色，從而使所述時間溫度綜合指示劑在相對恒定的溫度下經過一段預定的時間后，或是在較高溫度下經過相對較短的一段時間后，顯示出快速而明顯的顏色變化，從所述第一種顏色和第二種顏色中的一種顏色變成另一種顏色。
2.權利要求1限定的時間溫度綜合指示劑，其中所述第一反應產物是酸性的。
3.權利要求2限定的時間溫度綜合指示劑，其中所述第二反應產物是堿性的。
4.權利要求3限定的時間溫度綜合指示劑，其中所述第三反應產物含有一種穩定的堿性PH緩沖劑。
5.權利要求1限定的時間溫度綜合指示劑，其中所述的至少一種PH敏感性染料顯示的第一種顏色為綠色，第二種顏色為紅色。
6.權利要求1限定的時間溫度綜合指示劑，其中所述第一特異反應對和所述第二特異反應對都包含有一種作為活性試劑的酶活性試劑，以及一種酶底物作為對所述活性試劑有特異性的所述底物。
7.權利要求6限定的時間溫度綜合指示劑，其中所述第一特異反應對中的酶由一種微生物源提供。
8.權利要求6限定的指示劑，其中第二特異反應對是脲酶/尿素。
9.權利要求6限定的指示劑，其中所述第一特異反應對由酵母/甘油三乙酸酯構成。
10.權利要求9限定的指示劑，其中在所述第一酶/底物特異反應對中，第一種酶還包括脂酶。
11.權利要求7限定的指示劑，其中所述微生物是酵母。
12.權利要求7限定的指示劑，其中所述微生物是休克處理過的微生物。
13.權利要求6限定的時間溫度綜合指示劑，其中所述第一特異反應對包括一種具有產乳酸酶活性的微生物作為活性試劑和至少一種碳水化合物作為底物。
14.權利要求1限定的時間溫度綜合指示劑，其中所述的至少一種PH敏感性染料含有間硝基苯酚、對硝基苯酚和石蕊的混合物。
15.權利要求1限定的時間溫度綜合指示劑，其中所述的至少一種PH敏感性染料含有間硝基苯酚、溴百里酚藍和中性紅的混合物。
16.一種制備指示敏感產物和組合物貯存的時間-溫度歷程的指示劑的方法，該方法包括，將用來產生酸的第一特異反應對、用來產生堿的第二特異反應對和至少一種PH敏感性染料混合形成水溶液，所述第一特異反應對含有第一底物，其數量在化學計量上超過所述第二特異反應對中特異底物的數量。
17.權利要求16限定的方法，其中用來產生酸的第一特異反應對包含一種由微生物源提供的酶組分。
18.權利要求17限定的方法，其中所述微生物在加到指示劑溶液中之前先經過休克處理。
19.一種用于食品的室溫貯存及冷藏貯存的改進包裝，該包裝包括一個含有權利要求1限定的指示劑的標簽。
20.一種用于固定在包裝食品附近監測該包裝食品的時間和溫度歷程的指示劑小袋，所述小袋包括一個熱塑性小袋封套，該封套具有容納指示劑溶液的空腔，空腔中裝有肉眼可見數量的權利要求1限定的綜合指示劑組合物。
21.權利要求13限定的指示劑小袋，該小袋還包括裝在所述含指示劑溶液的小袋空腔內的一個基底片材。
全文摘要
一種改進的新型綜合指示劑體系，可用來指示監測產品溫度和時間歷程的一個或更多個預定時間溫度綜合值的到達，該體系采用二元的特異反應對體系，它們由兩種中性底物同時產生酸和堿。一種底物的含量超過另一種。這種優選的動態指示劑體系生成堿性范圍的恒定pH緩沖劑，直到一種底物被消耗光。此時指示劑溶液的pH快速改變到酸性范圍，造成pH敏感性染料的十分清晰可見的顏色變化。
文檔編號G01N31/22GK1068423SQ9210066
公開日1993年1月27日 申請日期1992年1月30日 優先權日1991年1月31日
發明者T·J·賈林斯基 申請人:奧斯卡邁耶食品公司