專利名稱：用作病毒感染標記活化核糖核酸酶l的制作方法
愛滋病(獲得性免疫缺陷綜合癥)是二十世紀公眾健康的主要威脅。由于愛滋病生物學上的可變性質、它在個體之間難于捉摸的傳播方式以及它的不能輕易探測到其真正存在的疾病“潛伏期”，使愛滋病迅速陷入規模空前的流行病困境。事實上，即使已投入了龐大的財力和物力來提高診斷能力，可利用的技術仍然達不到在任何一部分人群中有力地控制這一問題所必需的要求。例如參見題為“利用HTLV-Ⅲ抗體試驗的經驗，有關篩選的最新資料、實驗室與流行病相關性”的專題討論會會議錄，該討論會由國立衛生研究所，FDA、醫藥和生物中心及疾病防治中心聯合發起，1985年7月31日在馬里蘭州Bethesda的國立衛生研究所舉行，還可參見Budiansky.S的“Nature”316卷96頁1985年7月11日。
人體免疫缺陷病毒(HIV)存在幾個不同的名稱，LVA是法國巴黎Pasteur研究所分離出來的愛滋病病毒的名稱;HTLV-Ⅲ是美國馬里蘭州Bethesda的國家衛生研究所分離出來的該病毒的名稱。在本文中，這種HIV病毒經常被稱為一般命名的HTLV-Ⅲ或LAV或HIV，而不打算在它們之間進行區分。此外，本說明書中的術語“HIV”包括與產生愛滋病相關的任何一種病毒和所有其它病毒，不論它們是否被分離出來。單數形式的HIV指包括任何一種類型的HIV，而不管它們的基因內容是什么。類似地，愛滋病癥狀一般指的是包括HIV(如上定義)、ARC或AIDS相關的綜合癥、淋巴結病綜合癥(LAS)和其它引起基本類似臨床狀況的病毒引起的癥狀。
當前的治療考慮采取二個方法中的一種對病毒本身的免疫性(產生疫苗)進攻或直接的攻擊(抗病毒療法)。雖然，疫苗的產生最初似乎極有希望，但是，至少在理論上說，病毒結構的新知識顯著地影響和破壞了這種希望;即病毒顯然容易突變或改變它的基本生化結構，以致于關鍵的病毒抗原“決定子”(它對疫苗有效是必需的)容易經受突變和改變。例如，近來人們發現加里福尼亞、馬里蘭和英格蘭州的HTLV-Ⅲ分離株在嚴格分析它們的基因組內容時是彼此不同的。這些研究的含意在于接種抗HIV疫苗將不會具有像歷史上大多數其它疫苗、如抗脊髓灰質炎病毒、麻疹病毒等疫苗所具有的令人確信的有益/耐久效果這樣廣泛持久的好處。
在第二種方法或直接抗病毒方法中，其它科學家已經試驗了包括AET、HPA-23Suramin(蘇拉明)、ribavirin(三氮唑核苷)、干擾素和fascart等的幾個化合物。這些化合物至今以其有限或有保留的治療成功的跡象已被用在實驗室或臨床研究之中。事實上，幾乎每一個病例都報導了高毒性和/或嚴重副作用的一致跡象(例如M.Clark寫的概要，“Newsweek”71頁，1985年8月5日;還有C.Wallis“Time”40-47頁，1985年8月12日)。這些藥沒有一個真正是新的或者能夠有選擇性地針對這種根本的紊亂;即在某些細胞中HIV的增殖。例如，HPA-23是重金屬的一種組合物(使人想起在本世紀二十年代或使用青霉素年代之前利用砷來治療性病);蘇拉明(Suramin)實際上是一種抗寄生蟲(剛果錐蟲病)化合物，而fascart是一種抗皰疹病毒化合物。這后面提到的兩個化合物可以抑制一種被稱為“逆轉錄酶”的HIV相關酶，但是沒有多少證據說明這種酶的抑制事實上會導致任何有意義的治療改進或疾病的預防/轉好。AZT可能會稍微延長愛滋病患者的生命，但是，它是高毒性的，也不能消滅HIV(R.Yarchoan等人，“Lancet”，575頁1986年3月15日;R.E.Chaisson等人“NewEnglandJournalofMedicine”315卷1611頁，1986年)。
愛滋病是隨受人體免疫缺陷病毒HIV感染引起的免疫系統逐漸惡化而來的。在愛滋病的早期，細胞中介免疫性由于損失了表達所謂T4抗原的T細胞(由胸腺來的)而受到損傷，T細胞的亞單元主要是T助體和誘導物細胞組成。T4細胞缺陷可能導致幾種細胞中介免疫性的缺陷，其中包括NK(天然殺傷細胞)、LAK(淋巴因子激活的殺傷細胞)和溶胞T細胞的缺陷。在愛滋病中還存在B細胞(骨髓得到的)缺陷。
雖然愛滋病從一個階段過渡到另一階段的速度是能改變的，但它似乎是一種逐漸發展的疾病。這些階段已經有了指定的分類。存在一些受HIV感染而無癥狀的個體，有時稱為血清陽性者，可由存在抗該病毒的循環抗體來判斷(M.G.Sarngadharan等人，“Science”224卷506頁，1984年)。如果他們沒有任何標記，按照WelterReed分類法(R.R.Redfield等人“NewEnglandJournalofMedicine”314卷131頁，1986年)，它們是WR1期病人。也稱他們為ARC(愛滋病相關綜合癥)前期病人，盡管這些個體中的某些人可能永遠不會發展成ARC癥狀。這些病人中的一些可能會發展成淋巴結病(WR2)並顯示出T4細胞缺陷(WR3)。接著，淋巴細胞經受抗原刺激的增生能力和抗原刺激的γ干擾素生成能力下降，這些WR4期病人開始喪失被延緩的皮膚過敏性。WR5期病人通常是無(細胞免疫)反應性的，他們出現帶狀皰疹感染、口腔念珠菌病(鵝口皰)、或者包括持續高燒、夜里盜汗、疲倦、腹瀉和/或體重下降在內的ARC癥狀，這種ARC階段通常還以進行性免疫力衰退為特征。最后，WR6期病人經愛機會致病菌的感染，構成“全爆發”型(full-blown)愛滋病，這種病人有50%在12個月內死亡(H.W.Murray等人“NewEnglandJournalofMedicine”310卷883頁，1984年)。


圖1是聚丙烯酰胺凝膠電泳板的照片，顯示了7條徑跡和沿每條徑跡的段或區;以及圖2是2′-5′寡腺苷酸/RNaseL途經的一個圖解說明。
已經發現了一種由感染人體免疫缺陷病毒的細胞釋放的或促使其釋放的抑制劑物質。這種抑制劑似乎是實際附著在酶RNaseL、2′-5′寡腺苷酸/RNaseL途經的最終產物上，引起整個免疫系統功能紊亂，使HIV不可控地增殖。這里公開的是通過RNaseL的缺少或RNaseL的失活，或通過在2′-5′A/RNaseL途經中存在生化中間產物的抑制劑來直接或間接識別這些抑制劑的技術，這種(些)抑制劑起著檢測HIV存在或者表現基本相似臨床條件的有關病毒存在的標記的作用。
還討論了這種標記對病人的“全爆發型”愛滋病發展階段的預后意義，特別是對于那些外周血液中和在包括血液、血液成分、移植器官的細胞和細胞提取物在內的組織中有HIV抗體的病人。還描述了用于激活RNaseL和/或除去或失活RNaseL抑制物質的步驟，失活RNaseL抑制物質或失活病毒相關的這種抑制劑的治療方法是本發明的一部分。本發明還包括利用一種RNaseL的特異抑制劑或在2′-5′A/RNaseL途經中的生化中間產物的病毒相關抑制劑作為抗原，在體內和體外制取這些病毒抗體的步驟。
因此，本發明包括使用一種藥物組合物形式的dsRNA和激活RNaseL、除去或失活RNaseL的一種特異抑制劑或動物和人體內2′-5′A/RNaseL途經中的生化中間產物的病毒相關抑制劑的方法，該組合物包括一種dsRNA和一種淋巴細胞活素的組合，這在以下要被說明。dsRNA最好是一種失配的dsRNA，而淋巴細胞活素例如像干擾素或者其作用會由于依賴dsRNA的2′-5′A途經的恢復和還原而被促進的特異的其它抗病毒物質。
該組合物含有dsRNA和干擾素的比例最好是0.01至1000毫克dsRNA比0.1至100，000IRU的干擾素。
本發明還包括一個賦予一種最好是人產生的生物液體或最好是人產生的細胞抵抗病毒感染能力的方法，它增加了對病毒感染的抵抗力或減輕HIV感染的效應，該方法包括將這些生物液體或細胞與抑制HIV、激活RNaseL有效量的dsRNA混合或接觸。生物液體可以例如是用于輸液或透析的人的血液或血液成分。細胞可以由建議的皮膚移植片或可移植的器官得到。
此外，本發明還包括一個由一處理非腸胃液體的裝置去除或失活抑制RNaseL形成的物質或減輕HIV感染效應的方法，該方法包括將該裝置與包含抑制HIV、激活RNaseL有效量的一種dsRNA的組合物接觸。
本發明還包括用于治療HIV感染的個體、包括愛滋病狀況在內的方法和組合物，它是通過抑制或消除一種HIV特異的RNaseL抑制劑或者抑制、消除在2′-5′A/RNaseL途經中的生化中間產物的病毒相關抑制劑，或激活RNaseL實現治療的。該組合物包括了一種dsRNA和一種藥物學上可接受的載體或稀釋劑，以及用于治療還原病毒或T細胞促淋巴病毒誘發的癥狀、例如AIDS或通過激活不活動的RNaseL會干擾其增殖的其它人類病毒的治療說明。
以下通過實例方式來公開有選擇性地抑制人類病毒、特別是HIV而對正常細胞無很大毒性的治療方法;抑制、推遲或防止人感染HIV的方法;在人體中防止或治療AIDS相關的綜合癥或AIDS相關的功能紊亂的方法;處理人的生物液體、細胞或組織產物以防止或制止HIV感染或污染的方法;以及制止與HIV有關的特異損害的方法，包括人免疫系統中細胞上失去干擾素受體和免疫系統選擇性細胞中細胞內2′-5′A合成酶的削減或減少和RNaseL的失活以及細胞內dsRNA的減少或損失這樣的損害。還公開了用于這些方法中的藥物組合物。除了人外，對動物的治療也在本發明的范圍之內。
使用dsRNA適合于制止與HIV感染有關的特異損害，包括在免疫系統各種關鍵細胞上損失RNaseL以及與dsRNA有關的酶(例如蛋白激酶)、免疫/人體防御系統中各種關鍵細胞中細胞內2′-5′A合成酶的削減/減少以及細胞內的dsRNA的減少或損失和具有在免疫/人體防御系統中各種關鍵細胞中生物活性的2′-5′A寡聚物的減少或損失。
愛滋病中細胞內的“第一防御線”(2′-5′寡腺苷酸途經)中的紊亂各種各樣的研究表明，2′-5′寡腺苷酸途經(醫學文獻中也稱為干擾素2′-5′途經)在愛滋病中發生故障。該途經是人體抗感染防御系統的一個組成部分。在愛滋病及各種先期狀態(例如(ARC)或LAS(淋巴結綜合癥)中，該途徑中最接近的酶/因子被“打開”或激活，但是愛滋病病毒仍然增殖。例如，干擾素水平典型地升高，並且酶2-5A合成酶也升高。然而，這些升高的機理，特別是至少是部分打開的該途經不能甚至在一定程度上抑制HIV的機理直到這里報導的研究成果之前完全是個謎。
作為我研究的結果，我已識別出一種抑制劑、HIV感染的伴生物，它存在而且就是這種抑制劑使得對“全爆發”(full-blown)愛滋病起作用的抗病毒防御系統癱瘓。
圖1給出了在dsRNA(AMPLIGEN ，美國馬里蘭州Rockv Rockville的HEM研究公司的一種注冊商標)治療期間迅速清除外周血液中HIV負荷的ARC/AIDS病人的RNaseL的特性。在病人外周血液單核細胞(PBMC)的細胞質提取物中存在或不存在活化的RNaseL是按照K.Kariko和J.Ludwig，在“Biochem.Biophys.Research Communication”128卷695頁，1958;D.H.Wreschner等人“Nucleic Acid Research”9卷1571頁，(1981年)的步驟由28S和18SrRNA產生特異分裂產物(SCP)來確定的。核糖體的RNA(包括兩個被命名為28S和18S的分子物質)在可以由激活的RNaseL、而不是失活的RNaseL分裂方面具有和病毒(例如HIV)RNA相似的性質。被激活的RNaseL的特征在于它具有使它的分子結構與2-5A寡聚物結合的優勢，而很少與抑制劑結合(如果有的話)。這些研究的結果被表示在圖1、一張聚丙烯酰胺凝膠電泳板的照片上。表1是從10個接受Ampligen治療的病人中收集到的數據的總結。
作為核糖體RNA源的HL929細胞(RNaseL不足)提取物在不存在(第一徑跡)或存在(第二徑跡)Ampligen治療(第3和4徑跡分別是3號和7號病人治療前的試樣)前從健康的對照試驗者或ARC和AIDS病人得到的PBMC細胞質提取物的情況下培養1小時。如由凝膠SCP區域的光帶所表明的那樣，第1、3和4徑跡沒有顯示出任何激活的RNaseL的跡象。根據布達佩斯條約，HL929細胞寄存在美國典型培養物收集中心，寄存號是_。
在治療之前，所有ARC/AIDS病人的提取物即使加入外源性生物活性的寡腺苷酸〔2′5′-P3A3(10-8M)〕時(凝膠未畫出)也沒有顯示出激活作用(無SCP)，這證實了在進行Ampligen治療之前，病人淋巴細胞中沒有任何可供利用的功能性RNaseL分子。對照之下，在Ampligen治療的同時，在3號ARC病人中(8星期治療時是第5徑跡，而16周治療時是第6徑跡);在7號AIDS病人(8周時是第7徑跡)以及表1的各種病人(凝膠未示出)中，觀察到體內逐漸發展的RNaseL活性。箭頭指示了RNaseL的特異分裂產物(SCP)的位置。只有5號病人在dsRNA治療中不能激活RNaseL，而且作為很可能的后果，他死于伴隨的機會致病菌感染。
情況1-正常人、包括克服了HIV感染個體的生物途徑被表示在圖2上。
情況2-愛滋病和一些前期疾病，包括ARC，LAS和逐漸發展成AIDS的無癥狀的HIV血清陽性者等(參照圖2)-因為
RNaseL在抑制劑中被束縛住〔步驟D不起作用〕，所以步驟〔A〕、〔B〕和〔C〕作用過度;因此，由于缺少“反饋控制”該途經不能適當地關閉，盡管干擾素、2-5合成酶和有生物活性的2-5寡聚物(2-5A的三聚物和四聚物特別有活性)的濃度很高，HIV仍然增殖。
實驗數據-首先在愛滋病所有臨床范圍里的未被治療病人中，觀察到2-5A寡聚物以顯著的濃度存在。但是與正常人(圖1中聚丙烯酰胺凝膠的第2徑跡)不同，在未被治療的ARC和AIDS病人(第3和4徑跡)中，RNaseL是失活的。還進一步觀察到，如果我從ARC/AIDS病人得到失活的RNaseL制劑，並(在測定之前)徹底地清洗它們，包括使用三氯乙酸(TCA)，那么RNaseL制劑就會恢復功能，即它們對特異分裂(在凝膠中稱為SCP)或大分子RNA有催化作用，所以被稱為具有活性的。通過一系列的重組實驗，確定了RNaseL抑制劑已被洗提或斷落，它如果再一次被加回去的話，將終止、也就是抑制RNaseL的反應活性。
至今獲得的證據表明，細胞內RNaseL的狀態(活性的對失活的)構成HIV的一個重要的預后參數，以及用雙股RNAs的特異治療計劃能夠逆轉這些HIV特異損害。以無癥狀的HIV攜帶者(例如表1中的8號)到早期疾病(例如ARC或LAS;2、3、9、10、1和4號病人)到全爆發型AIDS的一系列臨床病人被用dsRNA來治療以確定這種抑制劑是否按希望那樣會被迫從RNaseL上脫開，使得這樣一種分子事件會引起HIV負荷的減少和極大的臨床改善。一些個體(體重約60公斤)每周用50-250毫克的稱為Ampligen的一種特異dsRNA治療兩次。人們知道，2′-5′寡A合成酶是依賴dsRNA的一種酶，所以有理由推斷，有可能通過使用一種人造的(合成的)dsRNA來急劇增加細胞內特異生物活性的2′-5′寡聚物的濃度結果使這種抑制劑從RNaseL中被置換出來。
表1表示如何使用失配dsRNA來真正做到使得治療病人血清中的HIV水平產生顯著的減少。通過將表1的最后一列(“病毒學”)與圖1的結果進行比較，可以清楚地看出，RNaseL的活性與HIV負荷減少相關聯並導致臨床的改善。匹配的dsRNA可能也是合適的，而且劑量會是足夠低以避免有害的反應，匹配的dsRNA像PolyI·Polyc，一種由Lampson制備的dsRNA。如果更高的劑量是適當的，那么最好使用失配dsRNA。
dsRNA最好是由于促進的生物有效性、適合于激活2′-5′A寡聚物的生成而不產生副作用的結構，或由于施用后相對短的半衰期向產生細胞內的2′-5′A寡聚物必需的高濃度以置換RNaseL抑制劑，同時不存在縮主毒性。
失配雙股RNA是大分子RNA的一種已知的形式(見美國專利4024222和4130641)，在大分子RNA中，雙螺旋的不穩定阻止了堿基配對。失配dsRNA因為它的干擾素誘導特性而被眾所周知，這種特性表明了一個與干擾素誘導本身無關的機理(如歐洲專利申請83305426.5，申請日1983年8月15日，題目是“AntiproliferativeActionofdsRNAonTumorCells”)。
失配雙股RNA一個典型的治療實例是由多核糖肌苷酸和多核糖胞苷酸/尿苷酸復合物形成的合成dsRNA，如rInr(Cx，U或G)n，其中x的值從4到29，例如在這里被稱為Ampligen的rInr(C12U)n。已經對特性類似于Ampligen的許多失配dsRNA進行了研究，失配dsRNA超過其它型式天然和/或合成dsRNA的主要治療優點是它們在動物和人中被減低的毒性。例如，Lampson等人的美國專利3666646描述了一些能夠觸發各種干擾素相關效應的早期dsRNA復合物，但是，這些化合物的毒性排除了它們在癌癥或有關疾病治療中的任何臨床應用。
發明人已在他最近的有關該主題的一些教科書中(例如見紐約MarcellDekker公司1984年出版的由R.M.Ottenbrite和G.B.Butler編輯的“AnticancerandInterferonAgents”中發明人寫的一章;也見1984年紐約和Heidelberg的Springer-Verlag出版的、由P.E.Come和W.A.Carter編輯的“HandbookofExperimentalPharmacologyonInterferons”535-555頁，詳細描述了dsRNA的已知性質)詳細地描述了各種干擾素、干擾素誘導物和dsRNA的已知活性。
現已知道，失配dsRNA，如Ampligen，對人的某些癌癥、尤其是腎癌有治療作用。雖然當前認為dsRNA僅僅是一種“干擾素誘發物”，但是dsRNA對完全耐受干擾素本身的人的某些癌癥是有效的，這在本申請人是發明人的歐洲專利申請83305426.5中已作了詳細的描述。
在另一份專利申請中(見歐洲專利申請86306582.7，申請日1986年8月26日，題為“ModulationofVirus-RelatedEventsbyDouble-StrandedRNAs)，發明人描述了用Ampligen作為原型dsRNA時dsRNA對人體細胞培養物中愛滋病病毒的抑制作用。
用“匹配dsRNA”來指對應兩個股之間的氫鍵(堿基的堆積)相對來說是完整的那些dsRNA，即在每29個依次接續的堿基殘基中，中斷平均小于1個堿基對。因此，應當相應地理解術語“失配的dsRNA”。
這種dsRNA可以是包含一定比例、如1/5至1/30的尿嘧啶基或胍嘧啶基的多肌苷酸和多胞苷酸的復合物PolyI·Poly(C4-29X＞U或G)。該dsRNA可以是PolyI·Polyc，U，其中C與U之比約是13比1，並且PolyI和Polyc，U的沉降系數都小于9，並在彼此的兩個單位之內，最好都在0.5至7.5。
該dsRNA可以具有通式rIn·(C12-13U)n.，以下將討論dsRNA的其它合適的例子。
組合物可以包括dsRNA和一種像淋巴細胞活素，如干擾素或像IL-2的白細胞介素這樣的HIV抑制促進劑。表2上表示了各種各樣的組合物。在AIDS病人的各種細胞中，包括T、NK、LAK、B細胞和單核細胞中將看到RNaseL的缺陷、或其它類似的依賴dsRNA的酶的缺陷(見表2)。
如在本說明書中解釋的那樣，dsRNA可被認為是用于治療和制止幾種HIV損害的一種“基本生物制品”。在表2中，隨著七種特異HIV缺陷或損害一起給出了dsRNA與另外(一種或一些)治療劑可能的治療組合。
表2dsRNA作為制止幾種AIDS損害的“基本生物制品”AIDS′缺陷與dsRNA可能的治療組合1.急性HIV感染dsRNA/AZT2.慢性HIV感染dsRNA/三氮唑核苷(ribavirin)dsRNA/γ干擾素3.T，NK，或LAK缺陷dsRNA/IL-2dsRNA/retinoids(視網類體)dsRNA/胸腺肽4.B細胞缺陷dsRNA/γ干擾素5.單核細胞缺陷dsRNA/γ干擾素6.卡波氏肉痛dsRNA/α干擾素dsRNA/γ干擾素dsRNA/IL-27.中樞神經(CNS)損害dsRNA/三氮唑核苷dsRNA/AZT在本發明中使用的失配dsRNA最好是以從Poly(Cx，U)和Poly(Cx，G)中選出的共多核苷酸為基礎，其中n是數值從4到29的一個整數，並且它是通過修改rIn·rCn以便沿多核糖胞苷酸(rCn)股的方向加入不配對的堿基(尿嘧啶基或胍基)形成的多核糖肌苷酸和多核糖胞苷酸復合物的失配類似物。另一方面，可以通過修改多核糖肌苷酸(rIn)的核糖基主鏈，例如通過加入2′-O-甲基核糖基殘基、從Poly(I)·Poly(C)dsRNA得到這種失配dsRNA。這些rIn·rCn失配類似物最好是具有通式rIn·r(C12，U)n的那些，它們在Carter和TS′O的美國專利4130641和4024222中被描述，它們的公開內容通過引用被結合到本申請中。那里所描述的dsRNA總的來說是適合用于本發明的。
在本發明中使用的失配dsRNA的具體例子包括Poly(I)·Poly(C4，U)Poly(I)·Poly(C7，U)Poly(I)·Poly(C13，U)Poly(I)·Poly(C22，U)Poly(I)·Poly(C20，G)Poly(I)·Poly(C29，G)以及Poly(I)·Poly(Cp)23G＞P本發明的藥物組合物包含失配dsRNA，可選擇性地還含有一種干擾素或其它的免疫調節劑(淋巴細胞活素)以及一種藥物學上可接受的載體或稀釋劑。本發明設想的藥物組合物包括在一種合適的藥物載體中的適合于不經胃腸道施用的那些組合物。
于是，例如，非腸胃道的溶液、懸浮體、分散體都可以根據需要用滅菌的或無熱源的、可選擇性地加或不加生理上可接受的鹽的水作為溶劑/稀釋劑，按照公知的制藥技術被制備。
施用失配dsRNA的量最好足以使在遠離注輸點的地方，在注入后不久，全身血液循環中得到從每毫升0.01微克的dsRNA直至每毫升1000微克。當同時施用干擾素時，最好包含的量使得每毫升體液有0.1至100，000IRU的水平。通常，要施用的量取決于病情的嚴重性，特別是取決于可利用的細胞內的生物活性dsRNA、2′-5′寡A分子或2′-5′A合成酶的水平以及RNaseL抑制劑的相對水平。作為用在這里的術語“體液”是血清溶液、維生素等，它在生物體內循環並浸潤組織。對醫生來說，病人預計的體液容積當然是知道的，這些預計的容積已經以通常可得到的圖、表形式被出版。
下面通過對使用dsRNA實例的說明來描述本發明。
在水溶液中配制失配dsRNA，例如Ampligen，使得它加到各種人細胞中時能夠得到每毫升液體(浸泡細胞)0.01微克至250微克的短暫濃度。使用了各種各樣不同的細胞，即所有可能的用HIV感染的目標。
以下描述一個用H-9細胞、一種能夠用HIV急性或慢性感染的人淋巴樣細胞的典型實驗。細胞在標準條件下(例如見Mitsuya等人“Science”226卷172頁，1984年)生長並在幾個星期里分析HIV酶或HIV特異蛋白的存在。對這樣一些模擬的各種臨床條件，在該病毒之前、之后或同時加進各種濃度的Ampligen。最重要的是，進行細胞數目、形態等方面的仔細分析，以確定是否像Mitsuya用其它抑制劑已描述過的那樣，失配dsRNA對淋巴樣細胞的生長有各種各樣的非特異效應。在實驗期間不同的時刻上分離細胞並用Lee等人描述的方法(“Biochemistry”24卷551頁，1985年)通過2′-5′A寡聚物的HPLC分析進行研究。人們知道某一些A寡聚物出現時，就能使細胞具有抗病毒的能力，但是，以下這一點是以前從未描述過的或沒有的，即一種試驗化合物(人工合成的)能準確地、有選擇性地觸發這種固有的反應，結果加強了抗病毒(總的來說)、特別是抗HIV的天然防御機制。
表3-Ampligen對HIV感染的作用實驗A天%HTLP陽性細胞逆轉錄酶+藥-藥+藥-藥40501，41224，2879790144，6321，243，300實驗B003533237004001，20010058002，261142＞801，100112，247175＞901，2001，560，000實驗A是用比靶細胞多25倍的病毒(用感染單位表示)進行的，而實驗B是用比病毒多10倍的靶細胞(稱為H-9細胞)進行的。細胞陽性百分比是指由螢光免疫法確定的表示被稱為P24和P19的HIV標記的細胞;逆轉錄酶指用稱為PolyrA/dT的模板在該細胞上清液中測定的一種病毒酶。同時，進行細胞計數在所有的試驗Ampligen濃度下(高至每毫升300微克)，以正常生長速度增殖的細胞數。在實驗A和B中，Ampligen(每毫升50微克)在第1天被加入。HPLT分析顯示出(到實驗A或B的第3至第7天)2′-5′寡聚物分布的一個特異的轉換，使得較高(較低抗病毒的)分子量(MW)的寡聚物轉換成對選擇性地和有力地抑制HIV有貢獻的較低(更強抗病毒的)分子量的寡聚物。對RNaseL同時作出的測量(見圖1)表明，RNaseL的生物活性通過一系列dsRNA的處理得到了恢復。
用其它可能是HIV的體內靶的人細胞進行了相似的實驗這些實驗包括其它一些從功能上被確定是NK(天然殺傷劑)細胞，T助體細胞，T抑制細胞和單核細胞等的細胞。在所有這些例子中，失配dsRNA的各種濃度都能選擇性地制止和/或阻止HIV的增殖，而對正常細胞的生長和成熟沒有任何影響(也見表2)。T細胞在培養基中的增殖通過IL-2因子的標準添加劑被維持，這是細胞生物學領域專業人員都知道的。如由HPLC分析確定的那樣，由失配dsRNA產生對HIV的選擇性抑制作用總是在2′-5′-寡聚物的分布中伴隨一個特異的轉換或增大。
在有關的生物化學途經中，dsRNA在處于危險(有或沒有活性的HIV感染)的個體的生物化學損害下游或遠處的地方起作用，這樣就恢復正常的抗病毒應答能力。
dsRNA能非常有效地為細胞所吸收，因此不需要一個完整的IFN受體。而且，失配dsRNA還可以以生物活性的片段形式用來促進細胞內的吸收和分布。所以，dsRNA具有容易穿過血-腦屏障的能力，而這可能是某些個體中HIV的一個殘余集合地。
典型地，用于本發明中的dsRNA將具有美國專利4024222和4130641上舉例說明的分子大小，但是，以親代分子片段形式獲得的更低分子量的dsRNA也是有效的。它們例如可以具有前述典型的dsRNA物質一半至十分之一的大小。
dsRNA活化2′-5′A聚合酶並在活性抗病毒寡核苷酸中比只用干擾素可能達到的增加500倍來促進這種合成。(dsRNA在1.6×108細胞中導致250毫微摩爾的2′-5′寡A，而200單位/毫升的干擾素只導致0.5毫微摩爾的2′-5′寡A)。
處在發生AIDS危險中或具有明顯AIDS個體的NK細胞中，申請人觀察到類似的現象，AIDS/ARC病人的天然殺傷細胞活性水平方面，存在著相似的情形，但是，關于NK調節機理方面知道得很少。AIDS/ARC病人和處于危險群體中的健康成員往往具有弱的免疫監視能力(功能性NK和T淋巴細胞)，而且不能通過干擾素再激活。Ampligen能在病區的遠側起作用，並能激活有細胞毒性的淋巴細胞。
權利要求
1.一種用于確定人體免疫缺陷病毒或引起大致類似臨床狀況病毒存在的方法，包括在一種動物細胞提取物中利用RNase底物確定被活化的RNaseL，一種存在HIV或HIV指示的遺傳信息的標記物，的存在。
2.一種按權利要求1所述的確定隱伏在人體生物液體或細胞中的人體免疫缺陷病毒存在的方法，包括探測該生物液體或細胞中的被活化的RNaseL的存在。
3.一種按權利要求2所述的方法，其中該生物液體是血液或它的成分。
4.一種按權利要求2所述的方法，其中該細胞來自皮膚移植片或可移植的人器官。
5.一種確定HIV侵入動物體內可能性的診斷試驗，包括檢查該動物組織的一種提取物並確定存在或不存在權利要求1的被活化的RNaseL分子，不存在這種被活化的RNaseL分子肯定地表明存在HIV的侵入。
6.一種監測從HIV或引起類似生物化學和/或臨床狀況的病毒中得以逐漸恢復的方法，該方法包括如下步驟(1)確定在一個病人的細胞提取物中存在或不存在被活化的RNaseL，如果沒有檢測到被活化的RNaseL，(2)施用一定量的dsRNA，其量要足以減少HIV誘發條件的RNaseL抑制劑或引起類似生化和/或臨床狀況的這樣一些其它病毒的RNaseL抑制劑的量，以及(3)繼續施用dsRNA直到病人的臨床癥狀穩定或改善。
7.一個按權利要求1或6所述的方法，其中通過測量由28SrRNA和18SrRNA產生的預定分裂產物的存在以及在病人細胞提取物中有生物活性的2′-5′A寡聚物的存在來確定RNaseL的存在。
8.一個按權利要求6所述的方法，其中dsRNA是一種失配的dsRNA。
9.一個按權利要求8所述的方法，其中dsRNA是一種包含從1/5到1/30的尿嘧啶基或胍基的多核糖肌苷酸和多核糖胞苷酸的復合物，並最好具有通式rIn·(C12U)n。
10.一種賦予對HIV免疫力的方法，包括給動物施用RNaseL的一種HIV特異抑制劑或施用在2′-5′A/RNaseL途經中的生化中間物的一種病毒相關抑制劑作為一種抗源。
11.一種治療HIV感染的方法，包括對HIV感染的動物施用一種有效劑量的物質，該物質能去除RNaseL的AIDS特異抑制劑或在2′-5′A/RNase L途經中的生化中間產物的病毒相關抑制劑，並繼續施用直到該抑制劑有明顯改變為止。
12.一種按權利要求11所述的方法，其中，施用一種dsRNA，最好是失配dsRNA。
全文摘要
抗包括引起愛滋病的病毒在內的許多病毒的細胞防御第一線是稱為2′—5′寡腺苷酸/RNase L途徑的細胞內生化系統的活化作用。現已識別出一種在HIV感染細胞中釋放出來的抑制劑物質、或者2′—5′A/RNase L途徑中生化中間產物的一種病毒相關抑制劑，它通過明顯地實際連接到其末端產物(RNase L)上，使整個系統發生故障，于是它允許HIV不可控制地增殖。這種新分離出的抑制劑在細胞內的相對水平對于“全爆發型”愛滋病的發展情況和最終死亡有預后意義。
文檔編號G01N33/569GK1030140SQ88102050
公開日1989年1月4日 申請日期1988年3月3日 優先權日1987年3月3日
發明者威廉·安·卡特 申請人:Hem研究公司