本發明屬于藥物檢(jian)測，具(ju)體(ti)涉及(ji)一種靶向pcsk9基因的寡(gua)核苷酸藥物的中間(jian)體(ti)雜質(zhi)檢(jian)測方法。

背景技術：

1、近(jin)年(nian)來(lai)(lai)，治(zhi)(zhi)療(liao)用寡(gua)(gua)核(he)苷酸作為一種可能治(zhi)(zhi)療(liao)多種疾(ji)病的(de)藥(yao)(yao)物(wu)模式，越來(lai)(lai)越受到(dao)市場的(de)關注，批準(zhun)的(de)治(zhi)(zhi)療(liao)最初僅限于治(zhi)(zhi)療(liao)罕見疾(ji)病。然而，隨(sui)著靶(ba)向pcsk9基因的(de)英克司蘭(lan)鈉注射液被批準(zhun)用于動脈粥(zhou)樣硬化性心血管(guan)疾(ji)病患者的(de)降膽固醇治(zhi)(zhi)療(liao)后，該類(lei)寡(gua)(gua)核(he)苷酸藥(yao)(yao)物(wu)的(de)研發和生產(chan)工作受到(dao)越來(lai)(lai)越多相(xiang)關企業的(de)重視。

2、目(mu)前寡(gua)核苷(gan)酸藥物(wu)主要使(shi)用固相磷酸酰胺(an)化(hua)學法(fa)進行合成，其過程包(bao)括迭(die)代偶聯、蓋帽、氧(yang)化(hua)和(he)(he)脫保(bao)護步驟，從而延長核苷(gan)酸序列(lie)。然而，由于各步驟反應效率均無法(fa)達到100%，這使(shi)得中(zhong)間體(ti)和(he)(he)成品中(zhong)會含有較多序列(lie)相關雜質(zhi)。序列(lie)相關雜質(zhi)的存在(zai)使(shi)得寡(gua)核苷(gan)酸藥物(wu)在(zai)使(shi)用過程中(zhong)具有一定(ding)的安全(quan)性風險(xian)，為了(le)提(ti)高使(shi)用安全(quan)性，需要對(dui)合成過程中(zhong)產生的雜質(zhi)進行鑒(jian)定(ding)和(he)(he)分(fen)離(li)。

3、質(zhi)譜和液相(xiang)(xiang)色(se)(se)譜在(zai)(zai)寡核苷酸藥物(wu)質(zhi)量(liang)研究方面的(de)引入(ru)，為治(zhi)療性(xing)寡核苷酸藥物(wu)的(de)快(kuai)速臨床(chuang)應用提供了技術基(ji)礎。理論上(shang)來看，通過液相(xiang)(xiang)色(se)(se)譜對雜(za)質(zhi)進行分(fen)離，再通過質(zhi)譜分(fen)析相(xiang)(xiang)應的(de)雜(za)質(zhi)，不僅可以實現(xian)(xian)對成品的(de)質(zhi)量(liang)控制，并能快(kuai)速指(zhi)導工藝優化(hua)，節約成本投入(ru)。然(ran)而，實際生產(chan)過程中(zhong)(zhong)發現(xian)(xian)，液相(xiang)(xiang)色(se)(se)譜和質(zhi)譜的(de)聯用方案在(zai)(zai)寡核苷酸藥物(wu)及其(qi)中(zhong)(zhong)間體(ti)的(de)鑒定(ding)和純化(hua)中(zhong)(zhong)應用仍存(cun)在(zai)(zai)諸多(duo)問題和限制。

4、例如：

5、quality?aspects?of?oligonucleotide?drug?development:srecificationsfor?active?pharmaceutical?ingredients[j]。drug?information?journal,?2012,?46(5):611-626提出了(le)可以分別(bie)利用(yong)質譜和液相色(se)譜進行寡核(he)苷酸的鑒(jian)別(bie)和純(chun)度檢測，但在液相色(se)譜中僅(jin)能(neng)使用(yong)保留時間作為鑒(jian)別(bie)的可靠方式，但由于寡核(he)苷酸雜質眾多，分離狀況欠(qian)佳，且(qie)僅(jin)依據(ju)單(dan)一(yi)的液相或質譜的方式進行序列(lie)鑒(jian)別(bie)并(bing)不足夠有力。

6、assay,?purity,?and?impurity?profile?of?phosphorothioateoligonucleotide?therapeutics?by?ion?pair–hplc–ms[j].nucleic?acidtherapeutics,?2022,?32(3):206-220建立了液質(zhi)(zhi)連用的(de)方法(fa)分析不(bu)同硫代寡核苷(gan)酸(suan)藥物(wu)有關物(wu)質(zhi)(zhi)，但(dan)其提(ti)供(gong)的(de)方法(fa)中，不(bu)完全硫代序(xu)列雜質(zhi)(zhi)(p=o)1未(wei)分離，只能(neng)通過eic提(ti)取(qu)離子流進行(xing)含量檢測，且未(wei)提(ti)出鑒別寡核苷(gan)酸(suan)的(de)方式。

7、cn118050441a公(gong)開(kai)了一(yi)種分離(li)并(bing)鑒定(ding)(ding)(ding)(ding)寡核(he)苷(gan)酸n及其n-1雜質(zhi)的方法(fa)，該方法(fa)使用陰離(li)子交(jiao)換色譜柱(zhu)進(jin)行了寡核(he)苷(gan)酸n及其n-1雜質(zhi)的分離(li)和(he)鑒定(ding)(ding)(ding)(ding)，但其主(zhu)要依賴于保(bao)留時間來進(jin)行鑒定(ding)(ding)(ding)(ding)，且使用的流(liu)動相為不揮發性鹽溶(rong)液，與質(zhi)譜兼容性差，無法(fa)聯用質(zhi)譜進(jin)行雜質(zhi)鑒定(ding)(ding)(ding)(ding)。

8、因此，亟需開發(fa)重現(xian)性好、可以有效兼容質譜儀的寡核苷酸藥(yao)物鑒(jian)別和純度(du)分析方法(fa)。

技術實現思路

1、針對現有技術(shu)中存在(zai)的(de)上述(shu)缺陷和不足，本發明提供了(le)一種靶向pcsk9基因(yin)的(de)寡核苷酸藥物的(de)中間體雜質檢測(ce)方法。

2、本(ben)發明提(ti)供的方法可同(tong)時鑒(jian)別和分(fen)離中間體中正(zheng)義鏈和反義鏈的縮短(duan)序(xu)(xu)列(lie)雜(za)(za)質(zhi)、硫代不完(wan)全序(xu)(xu)列(lie)雜(za)(za)質(zhi)和增長序(xu)(xu)列(lie)雜(za)(za)質(zhi)，具有良好的除雜(za)(za)效果。而且，該(gai)方法在各批次(ci)間重(zhong)現性良好，可用于中間體的質(zhi)量控制。

3、本發明的(de)(de)(de)(de)(de)發明人發現(xian)，在采用(yong)液(ye)相(xiang)色譜(pu)(pu)和質(zhi)(zhi)譜(pu)(pu)聯(lian)用(yong)的(de)(de)(de)(de)(de)方(fang)式對(dui)寡核苷(gan)酸類(lei)藥物或其中間體進行(xing)雜(za)質(zhi)(zhi)分離(li)（又可(ke)稱(cheng)為“除(chu)雜(za)”）和純(chun)度鑒(jian)定(ding)時，液(ye)相(xiang)色譜(pu)(pu)的(de)(de)(de)(de)(de)流(liu)動(dong)相(xiang)選(xuan)(xuan)擇十分重要。一方(fang)面(mian)，不(bu)同的(de)(de)(de)(de)(de)流(liu)動(dong)相(xiang)對(dui)于寡核苷(gan)酸的(de)(de)(de)(de)(de)分離(li)具有不(bu)同的(de)(de)(de)(de)(de)效果，尤其是流(liu)動(dong)相(xiang)中離(li)子的(de)(de)(de)(de)(de)選(xuan)(xuan)擇和用(yong)量的(de)(de)(de)(de)(de)調整，對(dui)試劑(ji)(ji)的(de)(de)(de)(de)(de)組成(cheng)種(zhong)類(lei)和濃度的(de)(de)(de)(de)(de)調整等(deng)，可(ke)以影響雜(za)質(zhi)(zhi)和主成(cheng)分的(de)(de)(de)(de)(de)分離(li)情況；另一方(fang)面(mian)，液(ye)相(xiang)色譜(pu)(pu)和質(zhi)(zhi)譜(pu)(pu)聯(lian)用(yong)技術(shu)需要色譜(pu)(pu)選(xuan)(xuan)用(yong)的(de)(de)(de)(de)(de)流(liu)動(dong)相(xiang)具有良好的(de)(de)(de)(de)(de)可(ke)揮發性，若使(shi)用(yong)揮發性差的(de)(de)(de)(de)(de)流(liu)動(dong)相(xiang)添加劑(ji)(ji)，揮發后殘(can)留的(de)(de)(de)(de)(de)鹽會(hui)導致質(zhi)(zhi)譜(pu)(pu)儀堵(du)塞及損壞(huai)。

4、基(ji)于此(ci)，本發(fa)明提供(gong)(gong)一種(zhong)靶向pcsk9基(ji)因的(de)寡核苷(gan)酸藥物的(de)中間體雜(za)質(zhi)檢(jian)測方法，其(qi)(qi)包(bao)括采(cai)用高(gao)效(xiao)液(ye)相色譜(pu)對含有所述(shu)寡核苷(gan)酸藥物中間體的(de)供(gong)(gong)試溶液(ye)進行(xing)雜(za)質(zhi)分離(li)和(he)檢(jian)測，其(qi)(qi)中，液(ye)相色譜(pu)的(de)條件包(bao)括：

5、采用的色(se)譜柱(zhu)選自固定相采用十八烷基(ji)硅烷鍵合硅膠為填(tian)充劑(ji)的色(se)譜柱(zhu)；以及(ji)

6、流動相a選自1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇(chun)和正己胺(an)的水(shui)溶液；

7、流動相b選自甲(jia)醇和乙腈(jing)的(de)混合溶液；

8、所(suo)述寡核苷(gan)(gan)酸藥(yao)物包括正(zheng)(zheng)義(yi)(yi)鏈(lian)和反義(yi)(yi)鏈(lian)，所(suo)述正(zheng)(zheng)義(yi)(yi)鏈(lian)的(de)核苷(gan)(gan)酸序列如(ru)seq?id?no:7所(suo)示(shi)，所(suo)述反義(yi)(yi)鏈(lian)的(de)核苷(gan)(gan)酸序列如(ru)seq?id?no:8所(suo)示(shi)；

9、所(suo)述雜質包括核苷酸序列(lie)如seq?id?no:1-6所(suo)示的序列(lie)雜質中的一(yi)種或多種。

10、本發明中，“雜(za)質(zhi)”主(zhu)要(yao)指核苷(gan)酸(suan)序(xu)列(lie)雜(za)質(zhi)（又可(ke)稱(cheng)為“序(xu)列(lie)雜(za)質(zhi)”），即與目標寡核苷(gan)酸(suan)序(xu)列(lie)不同(tong)(tong)（包(bao)括核苷(gan)酸(suan)序(xu)列(lie)的長度、核苷(gan)酸(suan)種類和排(pai)布(bu)等不同(tong)(tong)，也包(bao)括核苷(gan)酸(suan)序(xu)列(lie)上的修(xiu)飾不同(tong)(tong)）的其他寡核苷(gan)酸(suan)序(xu)列(lie)。

11、采用本發明提供(gong)的方法可以檢出選自(zi)以下中的任意一種或多種雜質：

12、寡核苷酸藥物中(zhong)間體的縮短序列雜(za)質(zhi)(zhi)、增長序列雜(za)質(zhi)(zhi)和硫(liu)代不完全雜(za)質(zhi)(zhi)；

13、其中，所(suo)述(shu)縮短(duan)序列雜質包括在正義鏈和(he)/或(huo)反義鏈的(de)序列上缺失(shi)至少1個堿基的(de)寡核(he)苷(gan)酸序列；

14、所述增(zeng)長序(xu)(xu)列雜質包括在正義鏈(lian)和/或(huo)反義鏈(lian)的序(xu)(xu)列上增(zeng)加至少(shao)1個堿(jian)基的寡核苷酸序(xu)(xu)列；

15、所述硫代不完全序(xu)列(lie)雜質包括(kuo)在正(zheng)義鏈(lian)(lian)和/或反義鏈(lian)(lian)的(de)序(xu)列(lie)上至少1個目(mu)標堿基沒有(you)被硫代修飾的(de)寡核苷酸序(xu)列(lie)。

16、本(ben)發明(ming)(ming)中(zhong)(zhong)，縮短序(xu)(xu)列雜(za)質對于核(he)(he)(he)(he)苷(gan)酸(suan)(suan)(suan)缺失的具(ju)體位(wei)置沒有特別限(xian)(xian)制，只要與(yu)目(mu)標(biao)寡(gua)(gua)核(he)(he)(he)(he)苷(gan)酸(suan)(suan)(suan)序(xu)(xu)列相比(bi)，在寡(gua)(gua)核(he)(he)(he)(he)苷(gan)酸(suan)(suan)(suan)序(xu)(xu)列（無(wu)論(lun)正義(yi)(yi)鏈(lian)還(huan)是反義(yi)(yi)鏈(lian)）中(zhong)(zhong)缺失了(le)(le)至少一個核(he)(he)(he)(he)苷(gan)酸(suan)(suan)(suan)即為(wei)所述(shu)縮短序(xu)(xu)列雜(za)質。本(ben)發明(ming)(ming)中(zhong)(zhong)，增(zeng)長序(xu)(xu)列雜(za)質對于核(he)(he)(he)(he)苷(gan)酸(suan)(suan)(suan)增(zeng)加(jia)的位(wei)置沒有特別限(xian)(xian)制，只要與(yu)目(mu)標(biao)寡(gua)(gua)核(he)(he)(he)(he)苷(gan)酸(suan)(suan)(suan)序(xu)(xu)列相比(bi)，在寡(gua)(gua)核(he)(he)(he)(he)苷(gan)酸(suan)(suan)(suan)序(xu)(xu)列（無(wu)論(lun)正義(yi)(yi)鏈(lian)還(huan)是反義(yi)(yi)鏈(lian)）中(zhong)(zhong)增(zeng)加(jia)了(le)(le)至少一個核(he)(he)(he)(he)苷(gan)酸(suan)(suan)(suan)即為(wei)所述(shu)增(zeng)長序(xu)(xu)列雜(za)質。本(ben)發明(ming)(ming)中(zhong)(zhong)，硫(liu)代不完全(quan)序(xu)(xu)列雜(za)質對于目(mu)標(biao)堿基未(wei)被硫(liu)代修(xiu)飾(shi)的位(wei)置也沒有特別限(xian)(xian)制，只要與(yu)目(mu)標(biao)寡(gua)(gua)核(he)(he)(he)(he)苷(gan)酸(suan)(suan)(suan)序(xu)(xu)列相比(bi)，在寡(gua)(gua)核(he)(he)(he)(he)苷(gan)酸(suan)(suan)(suan)序(xu)(xu)列（無(wu)論(lun)正義(yi)(yi)鏈(lian)還(huan)是反義(yi)(yi)鏈(lian)）中(zhong)(zhong)應當為(wei)具(ju)有硫(liu)代修(xiu)飾(shi)的核(he)(he)(he)(he)苷(gan)酸(suan)(suan)(suan)位(wei)點未(wei)進行修(xiu)飾(shi)，或是進行了(le)(le)其他類別的修(xiu)飾(shi)，均可視(shi)為(wei)所述(shu)硫(liu)代不完全(quan)序(xu)(xu)列雜(za)質。

17、例(li)如，縮短序列雜質可以(yi)為(wei)相對(dui)于目標正義鏈（seq?id?no:7）而(er)言，缺失(shi)其中(zhong)任意1-20個(ge)核(he)苷酸(suan)的(de)寡(gua)核(he)苷酸(suan)序列。例(li)如核(he)苷酸(suan)的(de)缺失(shi)量可以(yi)為(wei)1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個(ge)，或者也可以(yi)為(wei)上述任意兩(liang)個(ge)值構成的(de)范(fan)圍，或是該范(fan)圍中(zhong)的(de)任意中(zhong)間值。

18、例如，縮短序列(lie)雜(za)質可以(yi)為(wei)相(xiang)對于(yu)目(mu)標反義鏈（seq?id?no:8）而言，缺失其中任意(yi)(yi)1-22個(ge)(ge)核(he)苷(gan)酸的(de)寡核(he)苷(gan)酸序列(lie)。例如核(he)苷(gan)酸的(de)缺失量可以(yi)為(wei)1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22個(ge)(ge)，或者也可以(yi)為(wei)上(shang)述任意(yi)(yi)兩個(ge)(ge)值構成(cheng)的(de)范(fan)(fan)圍，或是該范(fan)(fan)圍中的(de)任意(yi)(yi)中間值。

19、例如(ru)，增長序(xu)列雜(za)質可以為相對于(yu)正義鏈(lian)（seq?id?no:7）或(huo)(huo)是反義鏈(lian)（seq?id?no:8），在其序(xu)列中的(de)任(ren)意(yi)(yi)位置增加至少一個核苷酸所得到的(de)寡核苷酸序(xu)列。例如(ru)增加的(de)核苷酸數量(liang)可以為1-100個，如(ru)1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、30、40、50、60、70、80、90、100個，或(huo)(huo)者(zhe)也可以為上(shang)述任(ren)意(yi)(yi)兩個值(zhi)構成的(de)范圍，或(huo)(huo)是該(gai)范圍中的(de)任(ren)意(yi)(yi)中間(jian)值(zhi)。

20、優選地(di)，所述硫代(dai)不(bu)完全(quan)序(xu)(xu)列(lie)(lie)雜(za)質包括在正(zheng)義(yi)(yi)鏈的(de)(de)序(xu)(xu)列(lie)(lie)上(shang)2個(ge)(ge)目標堿基（即正(zheng)義(yi)(yi)鏈5’→3’的(de)(de)第(di)(di)(di)一位(wei)(wei)g和第(di)(di)(di)二位(wei)(wei)a）中的(de)(de)其中至少(shao)1個(ge)(ge)沒有(you)被硫代(dai)修(xiu)飾的(de)(de)寡核苷酸序(xu)(xu)列(lie)(lie)。例如可以為正(zheng)義(yi)(yi)鏈5’→3’的(de)(de)第(di)(di)(di)一位(wei)(wei)g未(wei)被硫代(dai)修(xiu)飾、第(di)(di)(di)二位(wei)(wei)a未(wei)被硫代(dai)修(xiu)飾，或是第(di)(di)(di)一位(wei)(wei)g和第(di)(di)(di)二位(wei)(wei)a均未(wei)被硫代(dai)修(xiu)飾。

21、優(you)選地，所述硫(liu)代不完全(quan)序(xu)列雜質包括在反義(yi)鏈的(de)序(xu)列上(shang)4個目標堿基（即反義(yi)鏈5’→3’的(de)第(di)二(er)(er)位(wei)a、第(di)三(san)位(wei)a、第(di)二(er)(er)十(shi)二(er)(er)位(wei)a和第(di)二(er)(er)十(shi)三(san)位(wei)a）中(zhong)至少(shao)1個沒有被硫(liu)代修飾的(de)寡(gua)核苷酸序(xu)列。例如(ru)可以(yi)為反義(yi)鏈5’→3’的(de)第(di)二(er)(er)位(wei)a、第(di)三(san)位(wei)a、第(di)二(er)(er)十(shi)二(er)(er)位(wei)a和第(di)二(er)(er)十(shi)三(san)位(wei)a中(zhong)的(de)任(ren)意(yi)1個、任(ren)意(yi)2個或任(ren)意(yi)3個未被硫(liu)代修飾，或是上(shang)述四個位(wei)點均未被硫(liu)代修飾。

22、應當注意的(de)是，以上針對硫(liu)代(dai)不(bu)完全雜質的(de)說明中(zhong)，“未被硫(liu)代(dai)修(xiu)(xiu)(xiu)飾(shi)(shi)(shi)”是指(zhi)目(mu)標(biao)序(xu)列中(zhong)本應當進行硫(liu)代(dai)修(xiu)(xiu)(xiu)飾(shi)(shi)(shi)的(de)位(wei)點(dian)沒有進行硫(liu)代(dai)修(xiu)(xiu)(xiu)飾(shi)(shi)(shi)，其既可(ke)以包(bao)括(kuo)(kuo)該(gai)位(wei)點(dian)沒有進行任何(he)修(xiu)(xiu)(xiu)飾(shi)(shi)(shi)，也可(ke)以包(bao)括(kuo)(kuo)該(gai)位(wei)點(dian)進行了硫(liu)代(dai)修(xiu)(xiu)(xiu)飾(shi)(shi)(shi)之(zhi)外的(de)其他(ta)任意類型的(de)修(xiu)(xiu)(xiu)飾(shi)(shi)(shi)。

23、根據本發(fa)明(ming)的一些(xie)優選實(shi)施方(fang)案，其中(zhong)，所(suo)述雜(za)質(zhi)包括seq?id?no:1-6中(zhong)的至少一種所(suo)示的序(xu)(xu)(xu)(xu)列(lie)(lie)(lie)(lie)。需(xu)要說明(ming)的是，seq?id?no:1-6中(zhong)僅為示例性的列(lie)(lie)(lie)(lie)出(chu)了幾種與(yu)(yu)目(mu)標正義(yi)(yi)鏈(lian)(lian)序(xu)(xu)(xu)(xu)列(lie)(lie)(lie)(lie)或目(mu)標反義(yi)(yi)鏈(lian)(lian)序(xu)(xu)(xu)(xu)列(lie)(lie)(lie)(lie)結構十分(fen)接近，從而(er)較難(nan)與(yu)(yu)目(mu)標序(xu)(xu)(xu)(xu)列(lie)(lie)(lie)(lie)分(fen)離的雜(za)質(zhi)序(xu)(xu)(xu)(xu)列(lie)(lie)(lie)(lie)（例如(ru)利用現有技術(shu)(shu)中(zhong)的方(fang)法無法將這(zhe)(zhe)些(xie)雜(za)質(zhi)序(xu)(xu)(xu)(xu)列(lie)(lie)(lie)(lie)與(yu)(yu)目(mu)標序(xu)(xu)(xu)(xu)列(lie)(lie)(lie)(lie)分(fen)離）。本領域(yu)技術(shu)(shu)人員應(ying)當(dang)能夠理(li)解到，在本發(fa)明(ming)提供的方(fang)法可以去(qu)除(chu)(chu)核(he)苷酸序(xu)(xu)(xu)(xu)列(lie)(lie)(lie)(lie)如(ru)seq?id?no:1-6中(zhong)任(ren)一項所(suo)述的雜(za)質(zhi)序(xu)(xu)(xu)(xu)列(lie)(lie)(lie)(lie)的情況下，該方(fang)法對(dui)于具有其他結構的雜(za)質(zhi)序(xu)(xu)(xu)(xu)列(lie)(lie)(lie)(lie)應(ying)當(dang)也能夠去(qu)除(chu)(chu)，且可以得到與(yu)(yu)這(zhe)(zhe)些(xie)雜(za)質(zhi)序(xu)(xu)(xu)(xu)列(lie)(lie)(lie)(lie)至少相當(dang)的去(qu)除(chu)(chu)效果。

24、本發明提供的方法(fa)中(zhong)所涉及(ji)的寡核苷酸藥物中(zhong)間(jian)體以及(ji)雜質至少包(bao)括如下寡核苷酸序(xu)列結構信息表中(zhong)所列舉的寡核苷酸序(xu)列。下表中(zhong)：

25、標“_”的位(wei)置代表缺失1個堿基(ji)；

26、通過以下化學符(fu)號描述：

27、c=胞(bao)嘧啶(ding)，u=尿嘧啶(ding)，a=腺嘌呤，g=鳥嘌呤；m=2’-o-甲基修飾的(de)糖(tang)，f=2’-f修飾的(de)糖(tang)；evp=乙烯基磷酸酯鍵，s=硫代磷酸酯核苷間鍵；

28、g5=[[（1r，2r，3r，4r）-1-[[28-[[2-（乙(yi)酰氨基(ji)(ji)）-2-脫氧(yang)(yang)-β-d-吡(bi)喃(nan)半乳(ru)糖基(ji)(ji)]氧(yang)(yang)基(ji)(ji)]-13,13-雙[[3-[[3-[[5-[[2-（乙(yi)酰氨基(ji)(ji)）-2-脫氧(yang)(yang)-β-d-吡(bi)喃(nan)半乳(ru)糖基(ji)(ji)]氧(yang)(yang)基(ji)(ji)]-1-氧(yang)(yang)代(dai)戊(wu)基(ji)(ji)]氨基(ji)(ji)]丙基(ji)(ji)]氨基(ji)(ji)]-3-氧(yang)(yang)代(dai)丙氧(yang)(yang)基(ji)(ji)]甲基(ji)(ji)]-11,18,24-三氧(yang)(yang)代(dai)-15-氧(yang)(yang)雜(za)-12,19,23-三氮雜(za)二十八烷-1-基(ji)(ji)]氧(yang)(yang)基(ji)(ji)]-2-甲氧(yang)(yang)基(ji)(ji)-5-β-d-呋喃(nan)核糖基(ji)(ji)]磷酸氫。

29、

30、根(gen)據本(ben)發明(ming)的優(you)選實(shi)施(shi)方案，其中，所(suo)述雜(za)質為(wei)核苷酸序列如(ru)seq?id?no:1-6所(suo)示的序列雜(za)質的混合物。

31、根據(ju)本(ben)發(fa)明(ming)的優(you)選實施方案(an)，其中(zhong)，流動(dong)相a中(zhong)，1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙(bing)醇的濃(nong)度為100-300mmol/l；正己(ji)胺的濃(nong)度為10-30mmol/l。

32、例如，流動(dong)相a中(zhong)，1,1,1,3,3,3-六氟(fu)-2-丙醇的(de)(de)濃度可以為100mmol/l、120mmol/l、140mmol/l、160mmol/l、180mmol/l、200mmol/l、220mmol/l、240mmol/l、260mmol/l、280mmol/l、300mmol/l，或(huo)者(zhe)也可以為上(shang)述(shu)任意兩個值(zhi)構(gou)成(cheng)的(de)(de)范(fan)(fan)圍(wei)，或(huo)是該范(fan)(fan)圍(wei)中(zhong)的(de)(de)任意中(zhong)間值(zhi)。

33、例如，流動相a中(zhong)，正己胺的(de)濃度可(ke)以(yi)為(wei)10mmol/l、12mmol/l、14mmol/l、16mmol/l、18mmol/l、20mmol/l、22mmol/l、24mmol/l、26mmol/l、28mmol/l、30mmol/l，或者也(ye)可(ke)以(yi)為(wei)上述任(ren)意(yi)(yi)兩個(ge)值(zhi)構成的(de)范(fan)圍(wei)，或是該范(fan)圍(wei)中(zhong)的(de)任(ren)意(yi)(yi)中(zhong)間值(zhi)。

34、優選地，流(liu)動(dong)相a中，1,1,1,3,3,3-六(liu)氟-2-丙醇的濃(nong)度為200?mmol/l。

35、優(you)選地，流(liu)動(dong)相a中，正己(ji)胺的濃度(du)為(wei)25mmol/l。

36、根據(ju)本發明的優選實施方案，其中，流動相b中，甲醇和乙腈(jing)的體積比(bi)為1:1。

37、根(gen)據本發明(ming)的(de)優(you)選實施方案(an)，其中，色譜柱的(de)填充劑(ji)粒徑為1.7-2.7μm。

38、例如，色(se)譜(pu)柱的填充(chong)劑粒徑可以(yi)為1.7μm、1.8μm、1.9μm、2μm、2.1μm、2.2μm、2.3μm、2.4μm、2.5μm、2.6μm、2.7μm，或(huo)者也可以(yi)為上述任(ren)意兩(liang)個值構(gou)成的范(fan)圍(wei)，或(huo)是(shi)該范(fan)圍(wei)中的任(ren)意中間值。

39、優選地，色譜柱的填充劑粒徑為1.7μm。

40、根據本發明(ming)的(de)優選實(shi)施(shi)方(fang)案(an)，其中，色譜柱的(de)規格為2.1-4.6mm×50-150mm。

41、例如，色譜(pu)柱的規格可以為4.6mm×100mm、4.6mm×250mm和2.1mm×150mm中(zhong)的任一種(zhong)。

42、優(you)選地，色(se)譜柱的規(gui)格為(wei)2.1mm×150mm。

43、在本發明的一(yi)些(xie)優選實(shi)施方案(an)中，所(suo)述液(ye)相(xiang)色譜(pu)條件中，洗脫梯(ti)度為：

44、

45、也即，所述液相(xiang)色(se)譜(pu)的洗脫(tuo)梯度為：

46、0-20min時，?流動(dong)相(xiang)b體積(ji)從25%變化至50%；

47、20-22min時，流動相b體積從50%變化至60%；

48、22-22.1min時，流動相b體積從60%變化至25%；

49、22.1-27min時，流動相(xiang)b體積維持(chi)在25%。

50、根據本發明的(de)優選實(shi)施方(fang)案，其中，所(suo)述供試溶液中，所(suo)述寡(gua)核苷酸(suan)藥物的(de)濃度為0.1-1mg/ml。（即，正(zheng)義(yi)鏈的(de)濃度為0.1-1mg/ml，或者(zhe)，反(fan)義(yi)鏈的(de)濃度為0.1-1mg/ml）

51、例(li)如，所(suo)述(shu)(shu)寡核苷(gan)酸藥物的(de)濃度(du)可以為0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.3mg/ml、0.4mg/ml、0.5mg/ml、0.55mg/ml、0.6mg/ml、0.65mg/ml、0.7mg/ml、0.75mg/ml、0.8mg/ml、0.85mg/ml、0.9mg/ml、0.95mg/ml、1mg/ml，或(huo)者也可以為上(shang)述(shu)(shu)任意(yi)(yi)兩個值構成的(de)范(fan)圍，或(huo)是該范(fan)圍中的(de)任意(yi)(yi)中間值。

52、優選地(di)，所(suo)(suo)述(shu)供試溶液中(zhong)，所(suo)(suo)述(shu)寡核苷酸(suan)藥物(wu)中(zhong)間體的(de)濃度為0.5-0.75mg/ml。

53、根據本發明的優選實施(shi)方案，其中，液相(xiang)色譜條(tiao)件還包括：柱溫為70℃。

54、根(gen)據本發明的優選(xuan)實施方案，其(qi)中，液相色譜條件還包括：流速(su)為0.27-0.33ml/min。例如可(ke)以(yi)為0.27?ml/min、0.28ml/min、0.29ml/min、0.3ml/min、0.31ml/min、0.32ml/min、0.33ml/min，或者也可(ke)以(yi)為上述任(ren)意兩個(ge)值構成(cheng)的范圍(wei)，或是該范圍(wei)中的任(ren)意中間值。

55、優選地，流速為(wei)0.3?ml/min。

56、根(gen)據本發明的優選實施(shi)方案，其中，液(ye)相色譜條(tiao)件還包括：檢測波長為(wei)258-262nm。例如可(ke)以為(wei)258nm、259nm、260nm、261nm、262nm，或者也可(ke)以為(wei)上述任意(yi)兩個值構(gou)成(cheng)的范圍，或是該(gai)范圍中的任意(yi)中間值。

57、優選地，檢測(ce)波(bo)長為260nm。

58、根據本發明的(de)優選實施方(fang)案，其中，液相(xiang)色譜條件還包括：進(jin)樣量(liang)為(wei)(wei)1-5μl。例如可以為(wei)(wei)1μl、2μl、3μl、4μl、5μl，或者(zhe)也可以為(wei)(wei)上(shang)述任意(yi)兩個值構成的(de)范圍(wei)，或是該(gai)范圍(wei)中的(de)任意(yi)中間值。

59、優選地，進樣(yang)量為(wei)2μl。

60、在一些更優選的(de)實施(shi)方案中，所述寡核苷酸藥物中間體和雜質的(de)保(bao)留時(shi)間包(bao)括：

61、

62、其中，保留時(shi)間(jian)的相對偏(pian)差rd小于1%。

63、根(gen)據(ju)本(ben)發明的(de)優(you)選實施方案，其中，所述(shu)(shu)方法(fa)還包括(kuo)配制供(gong)試溶液(ye)的(de)步驟，其包括(kuo)將所述(shu)(shu)寡核(he)苷(gan)酸藥物與稀釋劑接(jie)觸。

64、本(ben)發明中(zhong)，稀釋劑可以為(wei)任意可用于液相色(se)譜中(zhong)稀釋/溶解寡核苷(gan)酸(suan)藥物或其中(zhong)間體(ti)的試劑。

65、優選地，所述稀釋劑為水(shui)(shui)和/或甲醇。也即，稀釋劑可以為水(shui)(shui)（例(li)如去(qu)離子水(shui)(shui)、超純(chun)水(shui)(shui)等）、甲醇，或是甲醇的水(shui)(shui)溶(rong)液。

66、更優選地，所述甲醇(chun)的水溶液中，甲醇(chun)的含(han)量為(wei)5-15體(ti)(ti)積(ji)(ji)(ji)%。例如可以為(wei)5體(ti)(ti)積(ji)(ji)(ji)%、6體(ti)(ti)積(ji)(ji)(ji)%、7體(ti)(ti)積(ji)(ji)(ji)%、8體(ti)(ti)積(ji)(ji)(ji)%、9體(ti)(ti)積(ji)(ji)(ji)%、10體(ti)(ti)積(ji)(ji)(ji)%、11體(ti)(ti)積(ji)(ji)(ji)%、12體(ti)(ti)積(ji)(ji)(ji)%、13體(ti)(ti)積(ji)(ji)(ji)%、14體(ti)(ti)積(ji)(ji)(ji)%、15體(ti)(ti)積(ji)(ji)(ji)%，或(huo)者(zhe)也可以為(wei)上(shang)述任意兩個值構成的范圍，或(huo)是該范圍中的任意中間值。

67、根據本發明的(de)一些優選實(shi)施方案，其中(zhong)，稀釋劑為水。

68、根據(ju)本(ben)發(fa)明的一些優選實施方案，其中，所述方法還包括采用(yong)質譜對液相色譜得到(dao)的產物進(jin)行純度檢測的步(bu)驟。

69、優選(xuan)地，質譜的條件包括：離子源(yuan)為電噴霧離子源(yuan)。

70、優選地，質譜(pu)的(de)條件(jian)包括(kuo)：采集(ji)極性為負極性模式。

71、優選地(di)，質譜的條件(jian)包括(kuo)：采(cai)集范(fan)圍為m/z=600-3000。

72、優選地，質(zhi)譜的條件(jian)包括：毛細管電壓為3.0kv。

73、優選地，質(zhi)譜的條件包括：干(gan)燥(zao)氣體溫度為350℃。

74、本發明所取得的有益效果至少(shao)包(bao)括：

75、本發明提供了一種可同時鑒別和分離目標寡核苷酸(suan)中間體正(zheng)義鏈(lian)(lian)(lian)和正(zheng)義鏈(lian)(lian)(lian)雜(za)(za)(za)質(zhi)1（縮(suo)短(duan)序(xu)列(lie)5’n-1），雜(za)(za)(za)質(zhi)2（硫代不(bu)完(wan)全(quan)序(xu)列(lie)雜(za)(za)(za)質(zhi)）、雜(za)(za)(za)質(zhi)3（增長(chang)序(xu)列(lie)雜(za)(za)(za)質(zhi)5’n+gms），以(yi)及目標反(fan)義鏈(lian)(lian)(lian)和反(fan)義鏈(lian)(lian)(lian)雜(za)(za)(za)質(zhi)4（縮(suo)短(duan)序(xu)列(lie)雜(za)(za)(za)質(zhi)5’n-1），雜(za)(za)(za)質(zhi)5（硫代不(bu)完(wan)全(quan)序(xu)列(lie)雜(za)(za)(za)質(zhi)）、雜(za)(za)(za)質(zhi)6（增長(chang)序(xu)列(lie)雜(za)(za)(za)質(zhi)5’n+afs）的方(fang)法。

76、其中，正義鏈中雜(za)(za)質(zhi)1（縮短序(xu)列5’n-1），雜(za)(za)質(zhi)2（硫代(dai)不(bu)完全(quan)序(xu)列雜(za)(za)質(zhi)）、雜(za)(za)質(zhi)3（增長序(xu)列雜(za)(za)質(zhi)5’n+gms）與(yu)主峰(feng)間(jian)峰(feng)谷(gu)比均(jun)＞1.00，峰(feng)形明顯(xian)，能實現正義鏈主峰(feng)與(yu)3種(zhong)雜(za)(za)質(zhi)的分離。

77、反義(yi)(yi)鏈(lian)中(zhong)除雜(za)質(zhi)(zhi)(zhi)5（硫代不完(wan)全序(xu)列(lie)(lie)雜(za)質(zhi)(zhi)(zhi)）外，雜(za)質(zhi)(zhi)(zhi)4（縮(suo)短序(xu)列(lie)(lie)5’n-1），、雜(za)質(zhi)(zhi)(zhi)6（增(zeng)長(chang)序(xu)列(lie)(lie)雜(za)質(zhi)(zhi)(zhi)5’n+afs）與(yu)主峰(feng)間峰(feng)谷比均＞1.00，峰(feng)形明顯，能實(shi)現反義(yi)(yi)鏈(lian)主峰(feng)與(yu)2種雜(za)質(zhi)(zhi)(zhi)的分離。

78、在上(shang)述分離效果(guo)下，使用(yong)液相色(se)譜聯用(yong)高分辨(bian)質譜儀，進(jin)行(xing)正(zheng)義(yi)(yi)鏈(lian)和(he)反義(yi)(yi)鏈(lian)中間體(ti)的(de)鑒別檢測(ce)，根(gen)據正(zheng)義(yi)(yi)鏈(lian)和(he)反義(yi)(yi)鏈(lian)的(de)指紋圖譜中各峰的(de)質譜數(shu)據進(jin)行(xing)分析，識別了相應雜(za)質峰的(de)分子量(liang)，并推測(ce)了其(qi)堿基缺失情況，基于序列的(de)唯一(yi)性，通過分子量(liang)的(de)差異，有效實現(xian)了目標(biao)寡(gua)核苷酸序列的(de)鑒別。

79、此(ci)外，本發明提供的方法中通(tong)過甄選(xuan)液相(xiang)色譜(pu)選(xuan)用的色譜(pu)柱和(he)(he)流動相(xiang)，使(shi)得液相(xiang)色譜(pu)分(fen)離得到的產(chan)物可(ke)以繼續進(jin)行質譜(pu)鑒定，進(jin)一步提高分(fen)離產(chan)物的純度鑒定精度和(he)(he)準確性(xing)，檢測結果更加可(ke)信。