本發明涉(she)及(ji)一種檢(jian)(jian)測(ce)阿爾茨海(hai)默病外(wai)周(zhou)血蛋(dan)白標志(zhi)物的(de)診斷(duan)試劑盒及(ji)其檢(jian)(jian)測(ce)方法(fa)，屬于體外(wai)診斷(duan)檢(jian)(jian)測(ce)技術(shu)領域。

背景技術：

阿(a)爾茨(ci)海默(mo)(mo)(mo)病(bing)(ad)是一種起病(bing)隱匿的(de)(de)(de)進行(xing)性(xing)發(fa)展的(de)(de)(de)神(shen)經系統退行(xing)性(xing)疾(ji)病(bing)。臨(lin)床(chuang)(chuang)(chuang)上(shang)以(yi)記(ji)憶障(zhang)礙、失(shi)(shi)語、失(shi)(shi)用(yong)、失(shi)(shi)認、視空(kong)間技能(neng)損害、執行(xing)功能(neng)障(zhang)礙以(yi)及人格和(he)行(xing)為改變等(deng)全面性(xing)癡呆表現為特征，病(bing)因迄今未明。由于(yu)(yu)阿(a)爾茲海默(mo)(mo)(mo)是一種發(fa)病(bing)進展緩慢(man)，隨著時間不(bu)斷惡化且不(bu)可(ke)逆(ni)的(de)(de)(de)中樞神(shen)經系統退行(xing)性(xing)疾(ji)病(bing)，患(huan)者通(tong)常(chang)會從早期的(de)(de)(de)近(jin)期記(ji)憶減(jian)退發(fa)展到(dao)喪(sang)失(shi)(shi)身體機能(neng)，最終導致死(si)亡。ad不(bu)但直接威(wei)脅(xie)生(sheng)命，還造成生(sheng)活(huo)質量嚴重下降(jiang)，連帶的(de)(de)(de)勞動力喪(sang)失(shi)(shi)和(he)護理成本更是不(bu)可(ke)計量；加上(shang)近(jin)十(shi)年(nian)來(lai)(lai)，針對(dui)(dui)ad治療(liao)的(de)(de)(de)十(shi)項大型iii期臨(lin)床(chuang)(chuang)(chuang)試驗均告失(shi)(shi)敗(bai)，對(dui)(dui)于(yu)(yu)ad的(de)(de)(de)藥(yao)物研發(fa)來(lai)(lai)說(shuo)更是雪上(shang)加霜。因此，近(jin)年(nian)來(lai)(lai)ad的(de)(de)(de)研究方向逐漸轉(zhuan)向了臨(lin)床(chuang)(chuang)(chuang)前(qian)期ad，科(ke)研人員希望通(tong)過在(zai)出現ad癥狀前(qian)找到(dao)能(neng)提示ad的(de)(de)(de)生(sheng)物標(biao)(biao)志物，從而(er)開發(fa)預(yu)(yu)防和(he)減(jian)緩ad的(de)(de)(de)藥(yao)物干預(yu)(yu)措施。ad的(de)(de)(de)生(sheng)物標(biao)(biao)志物(以(yi)下簡(jian)稱為“ad標(biao)(biao)志物”)不(bu)僅能(neng)夠準確診斷阿(a)爾茨(ci)海默(mo)(mo)(mo)病(bing)，還能(neng)指導臨(lin)床(chuang)(chuang)(chuang)治療(liao)和(he)療(liao)效的(de)(de)(de)監測，判斷阿(a)爾茨(ci)海默(mo)(mo)(mo)病(bing)的(de)(de)(de)預(yu)(yu)后。

目前已(yi)有腦脊(ji)液(ye)中β-淀(dian)粉(fen)樣(yang)蛋白(amyloid-β)和(he)微管相關蛋白(tau)作(zuo)為ad的公認生物(wu)標(biao)志(zhi)物(wu)，但是(shi)由于(yu)其需要侵入性(xing)(xing)(xing)采樣(yang)手段，在臨床應用(yong)有限(xian)。因此，各(ge)種不同類(lei)型的血清ad標(biao)志(zhi)物(wu)的聯合(he)并行檢測(ce)已(yi)成為必然，而多指標(biao)并行檢測(ce)的高通量迅(xun)速(su)性(xing)(xing)(xing)、準確性(xing)(xing)(xing)和(he)穩定性(xing)(xing)(xing)就更加至關重要。

目前，對(dui)于(yu)ad標(biao)(biao)志(zhi)物的測(ce)定已有多(duo)種檢測(ce)方法，包括(kuo)免疫熒光分(fen)(fen)(fen)析(xi)(xi)、酶聯免疫分(fen)(fen)(fen)析(xi)(xi)(elisa)、放射免疫分(fen)(fen)(fen)析(xi)(xi)(ria)、磁分(fen)(fen)(fen)離酶聯免疫分(fen)(fen)(fen)析(xi)(xi)(eima)等(deng)。但(dan)是這(zhe)些技(ji)術一次只能針對(dui)一種標(biao)(biao)志(zhi)物進行(xing)檢測(ce)，且操作繁(fan)瑣、靈敏度較差(cha)，不(bu)能真正滿足臨床(chuang)診斷檢測(ce)的需(xu)要。而固相生(sheng)物芯片技(ji)術存在著可重(zhong)復性差(cha)、靈敏度不(bu)夠好以及操作繁(fan)瑣等(deng)缺點(dian)。

液相(xiang)芯片(pian)技術(xmap))是一種(zhong)可廣泛應用于蛋白質(zhi)、基因、受(shou)體/配(pei)體等多種(zhong)生物(wu)(wu)反應的(de)生物(wu)(wu)芯片(pian)技術平臺(tai)，主(zhu)要包括微球(qiu)、探(tan)(tan)針(zhen)(zhen)分(fen)子(zi)、被檢(jian)測物(wu)(wu)和(he)報(bao)(bao)告(gao)分(fen)子(zi)四(si)種(zhong)成分(fen)。在微球(qiu)的(de)制造過(guo)程當中，摻入了兩種(zhong)不(bu)(bu)同的(de)紅色(se)(se)分(fen)類熒(ying)光(guang)，根據(ju)這三(san)種(zhong)熒(ying)光(guang)的(de)比(bi)例不(bu)(bu)同，把(ba)球(qiu)形(xing)基質(zhi)分(fen)為500種(zhong)，可以標(biao)記上500種(zhong)不(bu)(bu)同的(de)探(tan)(tan)針(zhen)(zhen)分(fen)子(zi)，能(neng)同時對(dui)一個樣品(pin)中多達500種(zhong)不(bu)(bu)同的(de)目(mu)標(biao)分(fen)子(zi)進(jin)行檢(jian)測。反應過(guo)程中，探(tan)(tan)針(zhen)(zhen)和(he)報(bao)(bao)告(gao)分(fen)子(zi)都分(fen)別與目(mu)標(biao)分(fen)子(zi)特異性結(jie)合(he)。反應結(jie)束后，使單個的(de)微球(qiu)通過(guo)檢(jian)測通道，使用紅、綠(lv)雙(shuang)色(se)(se)激光(guang)同時對(dui)微球(qiu)上的(de)紅色(se)(se)分(fen)類熒(ying)光(guang)和(he)報(bao)(bao)告(gao)分(fen)子(zi)上的(de)綠(lv)色(se)(se)報(bao)(bao)告(gao)熒(ying)光(guang)進(jin)行檢(jian)測，可確定所結(jie)合(he)的(de)檢(jian)測物(wu)(wu)的(de)種(zhong)類和(he)數量。

本(ben)發明基于(yu)液(ye)相芯片技術(shu)的(de)高(gao)靈敏度(du)、高(gao)通(tong)量、檢測(ce)迅速等突出優點，對(dui)ad的(de)多(duo)種外周血蛋白標志(zhi)物進行并行檢測(ce)，能夠在臨床檢測(ce)上得到更好(hao)的(de)應用(yong)。

技術實現要素：

本發明的目的是提(ti)供一種(zhong)檢(jian)測(ce)(ce)阿爾茨海(hai)默病外周血蛋白標志物的診斷試劑盒及(ji)其檢(jian)測(ce)(ce)方法(fa)，該檢(jian)測(ce)(ce)方法(fa)及(ji)試劑盒包括(kuo)針對complementc4、sap、bdnf、cathepsind、ncam、pai-1、agt、opn和ssod2等(deng)九種(zhong)ad標志物的聯合并行(xing)檢(jian)測(ce)(ce)，具有高(gao)靈敏(min)度、高(gao)特異性、穩定性好、檢(jian)測(ce)(ce)迅速(su)等(deng)優點(dian)。

本發明的技術方案，一種檢測多(duo)種阿(a)爾(er)茨海(hai)默(mo)病相關(guan)蛋(dan)白標志物的診(zhen)斷(duan)試劑(ji)盒(he)，主要包括以下組(zu)分：

(1)偶(ou)(ou)(ou)(ou)聯(lian)(lian)(lian)(lian)抗(kang)(kang)(kang)(kang)體(ti)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)微(wei)(wei)(wei)(wei)(wei)球(qiu)(qiu)：含有(you)9種(zhong)偶(ou)(ou)(ou)(ou)聯(lian)(lian)(lian)(lian)了(le)捕(bu)(bu)(bu)獲(huo)(huo)(huo)抗(kang)(kang)(kang)(kang)體(ti)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)羧基微(wei)(wei)(wei)(wei)(wei)球(qiu)(qiu)(微(wei)(wei)(wei)(wei)(wei)球(qiu)(qiu)編號(hao)為(wei)63、44、15、22、55、76、26、64和39)，即分(fen)別是(shi)：偶(ou)(ou)(ou)(ou)聯(lian)(lian)(lian)(lian)了(le)complementc4捕(bu)(bu)(bu)獲(huo)(huo)(huo)抗(kang)(kang)(kang)(kang)體(ti)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)微(wei)(wei)(wei)(wei)(wei)球(qiu)(qiu)63，偶(ou)(ou)(ou)(ou)聯(lian)(lian)(lian)(lian)了(le)sap捕(bu)(bu)(bu)獲(huo)(huo)(huo)抗(kang)(kang)(kang)(kang)體(ti)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)微(wei)(wei)(wei)(wei)(wei)球(qiu)(qiu)44，偶(ou)(ou)(ou)(ou)聯(lian)(lian)(lian)(lian)了(le)bdnf捕(bu)(bu)(bu)獲(huo)(huo)(huo)抗(kang)(kang)(kang)(kang)體(ti)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)微(wei)(wei)(wei)(wei)(wei)球(qiu)(qiu)15，偶(ou)(ou)(ou)(ou)聯(lian)(lian)(lian)(lian)了(le)cathepsind捕(bu)(bu)(bu)獲(huo)(huo)(huo)抗(kang)(kang)(kang)(kang)體(ti)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)微(wei)(wei)(wei)(wei)(wei)球(qiu)(qiu)22，偶(ou)(ou)(ou)(ou)聯(lian)(lian)(lian)(lian)了(le)ncam捕(bu)(bu)(bu)獲(huo)(huo)(huo)抗(kang)(kang)(kang)(kang)體(ti)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)微(wei)(wei)(wei)(wei)(wei)球(qiu)(qiu)55，偶(ou)(ou)(ou)(ou)聯(lian)(lian)(lian)(lian)了(le)pai-1捕(bu)(bu)(bu)獲(huo)(huo)(huo)抗(kang)(kang)(kang)(kang)體(ti)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)微(wei)(wei)(wei)(wei)(wei)球(qiu)(qiu)76，偶(ou)(ou)(ou)(ou)聯(lian)(lian)(lian)(lian)了(le)agt捕(bu)(bu)(bu)獲(huo)(huo)(huo)抗(kang)(kang)(kang)(kang)體(ti)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)微(wei)(wei)(wei)(wei)(wei)球(qiu)(qiu)26，偶(ou)(ou)(ou)(ou)聯(lian)(lian)(lian)(lian)了(le)opn捕(bu)(bu)(bu)獲(huo)(huo)(huo)抗(kang)(kang)(kang)(kang)體(ti)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)微(wei)(wei)(wei)(wei)(wei)球(qiu)(qiu)64，偶(ou)(ou)(ou)(ou)聯(lian)(lian)(lian)(lian)了(le)ssod2捕(bu)(bu)(bu)獲(huo)(huo)(huo)抗(kang)(kang)(kang)(kang)體(ti)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)微(wei)(wei)(wei)(wei)(wei)球(qiu)(qiu)39，每種(zhong)捕(bu)(bu)(bu)獲(huo)(huo)(huo)抗(kang)(kang)(kang)(kang)體(ti)分(fen)別抗(kang)(kang)(kang)(kang)一種(zhong)ad標志(zhi)物并(bing)且偶(ou)(ou)(ou)(ou)聯(lian)(lian)(lian)(lian)于不同編號(hao)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)微(wei)(wei)(wei)(wei)(wei)球(qiu)(qiu)，形成“捕(bu)(bu)(bu)獲(huo)(huo)(huo)抗(kang)(kang)(kang)(kang)體(ti)—微(wei)(wei)(wei)(wei)(wei)球(qiu)(qiu)”的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)二聯(lian)(lian)(lian)(lian)復(fu)合體(ti)；

(2)生(sheng)(sheng)物素(su)標(biao)記(ji)(ji)(ji)(ji)的(de)(de)(de)(de)檢(jian)(jian)(jian)測(ce)(ce)抗(kang)(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)：含(han)(han)(han)有生(sheng)(sheng)物素(su)標(biao)記(ji)(ji)(ji)(ji)的(de)(de)(de)(de)complementc4檢(jian)(jian)(jian)測(ce)(ce)抗(kang)(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)，生(sheng)(sheng)物素(su)標(biao)記(ji)(ji)(ji)(ji)的(de)(de)(de)(de)sap檢(jian)(jian)(jian)測(ce)(ce)抗(kang)(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)，生(sheng)(sheng)物素(su)標(biao)記(ji)(ji)(ji)(ji)的(de)(de)(de)(de)bdnf檢(jian)(jian)(jian)測(ce)(ce)抗(kang)(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)，含(han)(han)(han)有生(sheng)(sheng)物素(su)標(biao)記(ji)(ji)(ji)(ji)的(de)(de)(de)(de)cathepsind檢(jian)(jian)(jian)測(ce)(ce)抗(kang)(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)，含(han)(han)(han)有生(sheng)(sheng)物素(su)標(biao)記(ji)(ji)(ji)(ji)的(de)(de)(de)(de)ncam檢(jian)(jian)(jian)測(ce)(ce)抗(kang)(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)，含(han)(han)(han)有生(sheng)(sheng)物素(su)標(biao)記(ji)(ji)(ji)(ji)的(de)(de)(de)(de)pai-1檢(jian)(jian)(jian)測(ce)(ce)抗(kang)(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)，含(han)(han)(han)有生(sheng)(sheng)物素(su)標(biao)記(ji)(ji)(ji)(ji)的(de)(de)(de)(de)agt檢(jian)(jian)(jian)測(ce)(ce)抗(kang)(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)，含(han)(han)(han)有生(sheng)(sheng)物素(su)標(biao)記(ji)(ji)(ji)(ji)的(de)(de)(de)(de)opn檢(jian)(jian)(jian)測(ce)(ce)抗(kang)(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)，含(han)(han)(han)有生(sheng)(sheng)物素(su)標(biao)記(ji)(ji)(ji)(ji)的(de)(de)(de)(de)ssod2檢(jian)(jian)(jian)測(ce)(ce)抗(kang)(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)，其中，所述的(de)(de)(de)(de)每一種檢(jian)(jian)(jian)測(ce)(ce)抗(kang)(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)分別抗(kang)(kang)(kang)一種相應的(de)(de)(de)(de)ad標(biao)志物且對應于捕(bu)獲抗(kang)(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)，并(bing)與捕(bu)獲抗(kang)(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)分別結合于該生(sheng)(sheng)物標(biao)志物的(de)(de)(de)(de)不(bu)同(tong)抗(kang)(kang)(kang)原表位；

(3)鏈霉親(qin)和素—藻紅蛋(dan)(dan)白(streptavidin-pe)：其(qi)中鏈霉親(qin)和素可(ke)與生物素特異性結(jie)合，形成(cheng)帶(dai)藻紅蛋(dan)(dan)白(pe)熒(ying)光素標(biao)記的檢(jian)測(ce)抗體，通過液相(xiang)芯片(pian)儀的綠色激(ji)光激(ji)發藻紅蛋(dan)(dan)白進行熒(ying)光檢(jian)測(ce)；

(4)標準品(pin)：包含各種ad的生物標志物(抗(kang)原)的標準品(pin)；

(5)質控(kong)品(pin)：包含陽(yang)性對照(zhao)(zhao)和陰性對照(zhao)(zhao)。

其(qi)中所述的捕(bu)獲(huo)抗(kang)(kang)體(ti)和(he)檢測(ce)抗(kang)(kang)體(ti)是針對以下9種(zhong)可以自由組合的ad標(biao)志物的捕(bu)獲(huo)抗(kang)(kang)體(ti)和(he)檢測(ce)抗(kang)(kang)體(ti)：complementc4，sap，bdnf，cathepsind，ncam，pai-1，agt，opn，ssod2。

一種阿(a)爾(er)茨海默病蛋白(bai)標志物的液相芯片(pian)聯合并行檢測方法(fa)，包括以(yi)下步(bu)驟：

(1)將不同編號的(de)、表面羧(suo)基修飾的(de)微球(beads，編號分別為(wei)63、44、15、22、55、76、26、64和39)活化后，使相(xiang)應的(de)捕獲抗(kang)體(抗(kang)ad標(biao)(biao)志(zhi)物的(de)抗(kang)體)與相(xiang)應的(de)微球偶聯，形(xing)成(cheng)“捕獲抗(kang)體-微球”二(er)聯復合體，所(suo)述的(de)每一(yi)種捕獲抗(kang)體分別抗(kang)一(yi)種ad標(biao)(biao)志(zhi)物，從而使待(dai)測樣品中的(de)ad標(biao)(biao)志(zhi)物與捕獲抗(kang)體形(xing)成(cheng)“ad標(biao)(biao)志(zhi)物-捕獲抗(kang)體-微球”三聯復合體；

(2)將(jiang)不(bu)同的(de)檢測抗(kang)(kang)(kang)體(ti)進行(xing)生物(wu)(wu)素(biotin)標(biao)記，其中所述的(de)每(mei)一種(zhong)檢測抗(kang)(kang)(kang)體(ti)分別抗(kang)(kang)(kang)一種(zhong)ad標(biao)志物(wu)(wu)且(qie)對應(ying)于捕(bu)獲抗(kang)(kang)(kang)體(ti)，并與捕(bu)獲抗(kang)(kang)(kang)體(ti)分別結合于該標(biao)志物(wu)(wu)的(de)不(bu)同抗(kang)(kang)(kang)原表位(wei)；

(3)將(jiang)步(bu)驟(1)形成的(de)三聯復合體(ti)(ti)與步(bu)驟(2)中的(de)含(han)有生物(wu)素標記的(de)檢測抗體(ti)(ti)混合，從而形成“生物(wu)素標記的(de)檢測抗體(ti)(ti)-ad標志物(wu)-捕獲抗體(ti)(ti)-微球”四聯復合體(ti)(ti)；

(4)將步驟(3)中(zhong)的四聯復合體與(yu)鏈霉親和素-藻(zao)紅蛋白(streptavidin-pe)結合后，檢測出不同微球(qiu)的熒(ying)光(guang)信(xin)號，從而確(que)定(ding)待檢測樣品中(zhong)各(ge)種(zhong)ad標志物的存(cun)在及含(han)量。

以上所述(shu)檢(jian)測(ce)方法，還包括步(bu)驟：將步(bu)驟(4)中(zhong)測(ce)定的(de)可檢(jian)測(ce)熒光信號(hao)與標準曲線進行比較，從而確定待檢(jian)測(ce)樣品中(zhong)各種ad標志(zhi)物(wu)的(de)含(han)量。

所述的微(wei)球是(shi)平(ping)均(jun)直徑為5.6μm，且(qie)結合(he)了不同熒光染(ran)料的聚苯乙烯磁性微(wei)球，即色彩編碼(ma)微(wei)球(color-codedbeads)。

所述步驟(1)中的微球活化是指微球在由1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(edc)溶液、n-羥基硫代琥珀酰亞胺(s-nhs)溶液和活化緩沖液組成的三者混合液中進行活化，其中，三者混合液的用量比是：當微球數量為2.5×10⁶個(ge)時，需要(yao)50mg/mledc溶(rong)液(ye)10μl∶50mg/mls-nhs溶(rong)液(ye)10μl∶100mmnah2po4、ph6.3的(de)活化緩沖液(ye)80μl，混合(he)液(ye)的(de)用量(liang)(liang)可以根據微球的(de)數量(liang)(liang)進行相應(ying)的(de)調整。

所述的捕獲(huo)(huo)抗體(ti)和檢(jian)測(ce)(ce)抗體(ti)是針對以下9種可以自(zi)由(you)組合的ad標志物(wu)的捕獲(huo)(huo)抗體(ti)和檢(jian)測(ce)(ce)抗體(ti)：complementc4，sap，bdnf，cathepsind，ncam，pai-1，agt，opn，ssod2。

檢測方(fang)法中所述的步驟(4)中用液相(xiang)芯片(pian)法(xmap)進行檢測，所述的可檢測熒(ying)光信號是紅色激(ji)光激(ji)發(fa)的微(wei)球(qiu)上(shang)的紅色分類熒(ying)光信號和綠色激(ji)光激(ji)發(fa)的藻(zao)紅蛋白所產生的報告熒(ying)光信號。

本(ben)發明的一種檢測(ce)阿爾茨海(hai)默(mo)病蛋(dan)白標志物的診(zhen)斷試劑(ji)盒(he)可用于檢測(ce)體外樣品中ad標志物的存在及含(han)量(liang)。

本(ben)發(fa)明的(de)(de)有(you)益效果：本(ben)發(fa)明制備的(de)(de)診斷試劑(ji)盒可用于檢測(ce)(ce)體(ti)外樣(yang)品中ad標志物(wu)的(de)(de)存(cun)在及含(han)量。由于本(ben)發(fa)明利(li)用了液相芯片技(ji)術，使檢測(ce)(ce)方法及試劑(ji)盒具有(you)高靈敏度、高特異性、高通量、穩定性好(hao)、檢測(ce)(ce)迅(xun)速、準確等突出優點，能夠對(dui)多(duo)種阿爾茨海默病相關蛋白標志物(wu)同時(shi)進(jin)行(xing)定性和定量檢測(ce)(ce)，能在臨床檢測(ce)(ce)上得到(dao)更好(hao)的(de)(de)應用。

附圖說明

圖1是本(ben)發明中檢測ad患者(zhe)與正常對照組中complementc4的濃度。

圖2是本發明中檢測(ce)ad患(huan)者與正常對照組中sap的濃度分(fen)布(bu)圖。

圖(tu)3是本發明中(zhong)(zhong)檢測ad患(huan)者與正常對照組中(zhong)(zhong)bdnf的濃度分布(bu)圖(tu)。

圖4是本發(fa)明中檢測ad患者與(yu)正常對照組中cathepsind的(de)濃度分布圖。

圖5是本發明中(zhong)(zhong)檢測ad患者與(yu)正常對照(zhao)組中(zhong)(zhong)ncam的(de)濃度分布圖。

圖6是本(ben)發(fa)明中檢測ad患者與(yu)正常(chang)對照組中pai-1的濃度分布圖。

圖7是本發明中檢測(ce)ad患者與正(zheng)常(chang)對照(zhao)組中agt的濃度(du)分布圖。

圖8是(shi)本發(fa)明中(zhong)檢(jian)測ad患者與正常對照組中(zhong)opn的濃度分布圖。

圖9是本發(fa)明中檢(jian)測(ce)ad患者與正常對照(zhao)組中ssod2的濃度(du)分布(bu)圖。

圖10是本發明9種蛋白鑒別(bie)ad癡呆與(yu)正常老年(nian)人的roc曲線分析。

圖(tu)11是本發明中(zhong)ad患者與正常對照組9種(zhong)蛋白組合分的分布圖(tu)。

圖12是9種蛋(dan)白組(zu)合分(fen)鑒別ad癡呆(dai)和(he)正常老年人的敏感性和(he)特(te)異性。

具體實施方式

實驗材料：

本發明(ming)所用的(de)9種ad標志物(抗(kang)原(yuan))及相應抗(kang)體來源于rnd、cellsciences和abcam公司；

不同(tong)編號(hao)的磁性微(wei)球(表面羧基修飾)、鏈(lian)霉親和素-藻紅蛋白(bai)均購置于qiagen公(gong)司；

1-乙基(ji)(ji)-(3-二(er)甲基(ji)(ji)氨基(ji)(ji)丙基(ji)(ji))-3-乙基(ji)(ji)碳二(er)亞胺鹽酸(suan)鹽(edc)、n-羥基(ji)(ji)硫代(dai)琥珀酰亞胺(s-nhs)和n-羥基(ji)(ji)硫代(dai)琥珀酰亞胺生物(wu)素(su)(s-nhs-biotin)購置于pierce公司。

緩沖液配制：

活化緩沖(chong)液(ye)(activationbuffer)：100mmnah2po4，ph6.3；

偶聯緩沖液(ye)(couplingbuffer)：50mmhepes，ph7.4；

磷酸緩(huan)沖(chong)液(pbs)：10mmnah2po4，150mmnacl，ph7.4。

實施(shi)例1：9種阿爾茨海默病標志(zhi)物的(de)液相芯片聯合并行(xing)檢測方(fang)法(fa)，具體的(de)檢測方(fang)法(fa)包括如下步驟：

1.所需微球的活化

1.1全速(su)渦旋(xuan)微(wei)球儲(chu)存液(ye)至少3min，形成(cheng)均一的微(wei)球懸液(ye)；

1.2分別稱取10mg的edc和s-nhs到兩個(ge)離心管中；

1.3用去離子水(shui)溶解使其終濃度為50mg/ml；

1.4取1ml的微球懸(xuan)液(ye)10000g離心3min，小心移除上清；

1.5加入80μl的活化緩(huan)沖(chong)液將(jiang)微球(qiu)重懸；

1.6分別(bie)加入(ru)10μl的edc溶液(50mg/ml)和10μl的s-nhs溶液(50mg/ml)，混合均勻，室溫(wen)(15-25℃)，避(bi)光(guang)，振(zhen)蕩(dang)孵育20min。

2.相應(ying)的(de)捕獲抗體與活化的(de)微球偶聯

2.1用偶(ou)聯緩(huan)沖液(ye)(ye)將捕獲抗體稀釋成體積為500μl，濃度為0.1mg/ml的(de)溶液(ye)(ye)；(抗體溶液(ye)(ye)中不能含有外源(yuan)蛋(dan)白，疊氮化物(wu)，氨基乙酸，tris或(huo)其他(ta)任何含有氨基的(de)試(shi)(shi)劑。如(ru)果含有這些試(shi)(shi)劑，通過透析或(huo)凝膠過濾層析除(chu)去)。

2.2將(jiang)微球在10000g離心(xin)3min，小心(xin)移除上清；

2.3加入步驟(zou)2.1中已經稀釋好的抗(kang)體(ti)溶液(500μl)；

2.4將活化的微(wei)球與抗體(ti)溶(rong)液，在室溫(15-25℃)下，避光(guang)，振(zhen)蕩孵育2h(離心管必須用錫紙包裹避光(guang))；

2.5將微球(qiu)在(zai)10000g離心3min，小(xiao)心移除上清；

2.6加(jia)入500μlpbs將微球(qiu)重懸，10000g離(li)心(xin)3min，小心(xin)移除上清；

2.7加(jia)入1mlpbs/1％bsa(bsa：牛血(xue)清白蛋白)將微球重懸；

2.8通過(guo)血(xue)小板計數器對微球(qiu)計數；

3.生物素標記(ji)檢測抗體

3.1將生物素試劑(s-nhs-biotin)從冰箱的(de)冷藏(zang)室(shi)(shi)中取出，在室(shi)(shi)溫下平衡，使其恢復(fu)到室(shi)(shi)溫；

3.2依據檢測抗體的濃度，用pbs將抗體稀釋到1mg/ml；

3.3用超純(chun)水配置(zhi)10mm的生(sheng)物素溶液(ye)；

3.4按(an)摩(mo)爾(er)比1∶20(抗(kang)體(ti)∶生物素)，計算生物素所需要的(de)量，加入到濃度(du)為1mg/ml的(de)抗(kang)體(ti)溶液中；

計算公式：

3.5將反應液在(zai)冰上孵育(yu)(yu)2h，或是在(zai)室溫(wen)孵育(yu)(yu)30min；

3.6將反(fan)應液轉移到透析盒，除去其(qi)中未(wei)反(fan)應的s-nhs-biotin。

4.抗原(yuan)標(biao)準(zhun)品的(de)配置(zhi)：complementc4按(an)(an)1000，250，62.5，15.6，3.9，0.9，0.2ng/ml的(de)濃(nong)度(du)(du)進(jin)(jin)(jin)行(xing)(xing)配制(zhi)，sap按(an)(an)500，125，31.2，7.8，1.9，0.4，0.1ng/ml的(de)濃(nong)度(du)(du)進(jin)(jin)(jin)行(xing)(xing)配制(zhi)，bndf和pai-1按(an)(an)10000，2500，625，156，39，10，2pg/ml的(de)濃(nong)度(du)(du)進(jin)(jin)(jin)行(xing)(xing)配制(zhi)，cathepsind和ncam按(an)(an)100000，25000，6250，1563，391，98，24pg/ml的(de)濃(nong)度(du)(du)進(jin)(jin)(jin)行(xing)(xing)配制(zhi)，agt按(an)(an)1000，333，111，37，12，4，1ng/ml的(de)濃(nong)度(du)(du)進(jin)(jin)(jin)行(xing)(xing)配制(zhi)，opn按(an)(an)100，33.3，11.1，3.7，1.2，0.4,0.1ng/ml的(de)濃(nong)度(du)(du)進(jin)(jin)(jin)行(xing)(xing)配制(zhi)，ssod2按(an)(an)25，8.3，2.7，0.9，0.3，0.1,0.03ng/ml的(de)濃(nong)度(du)(du)進(jin)(jin)(jin)行(xing)(xing)配制(zhi)，標(biao)志物混合液(ye)分別標(biao)記為std7，std6，std5，std4，std3，std2，std1，std0。

5.偶(ou)(ou)(ou)(ou)聯(lian)(lian)捕(bu)(bu)獲(huo)(huo)(huo)抗(kang)體(ti)(ti)(ti)的(de)(de)微(wei)(wei)(wei)球(qiu)(qiu)(qiu)(qiu)混(hun)合(he)(he)液(i混(hun)合(he)(he)液)的(de)(de)配制：分別取偶(ou)(ou)(ou)(ou)聯(lian)(lian)了(le)(le)9種ad標志物(wu)的(de)(de)捕(bu)(bu)獲(huo)(huo)(huo)抗(kang)體(ti)(ti)(ti)的(de)(de)微(wei)(wei)(wei)球(qiu)(qiu)(qiu)(qiu)，如(ru)下列：complementc4捕(bu)(bu)獲(huo)(huo)(huo)抗(kang)體(ti)(ti)(ti)微(wei)(wei)(wei)球(qiu)(qiu)(qiu)(qiu)63，偶(ou)(ou)(ou)(ou)聯(lian)(lian)了(le)(le)sap捕(bu)(bu)獲(huo)(huo)(huo)抗(kang)體(ti)(ti)(ti)的(de)(de)微(wei)(wei)(wei)球(qiu)(qiu)(qiu)(qiu)44，偶(ou)(ou)(ou)(ou)聯(lian)(lian)了(le)(le)bdnf捕(bu)(bu)獲(huo)(huo)(huo)抗(kang)體(ti)(ti)(ti)的(de)(de)微(wei)(wei)(wei)球(qiu)(qiu)(qiu)(qiu)15，偶(ou)(ou)(ou)(ou)聯(lian)(lian)了(le)(le)cathepsind捕(bu)(bu)獲(huo)(huo)(huo)抗(kang)體(ti)(ti)(ti)的(de)(de)微(wei)(wei)(wei)球(qiu)(qiu)(qiu)(qiu)22，偶(ou)(ou)(ou)(ou)聯(lian)(lian)了(le)(le)ncam捕(bu)(bu)獲(huo)(huo)(huo)抗(kang)體(ti)(ti)(ti)的(de)(de)微(wei)(wei)(wei)球(qiu)(qiu)(qiu)(qiu)55，偶(ou)(ou)(ou)(ou)聯(lian)(lian)了(le)(le)pai-1捕(bu)(bu)獲(huo)(huo)(huo)抗(kang)體(ti)(ti)(ti)的(de)(de)微(wei)(wei)(wei)球(qiu)(qiu)(qiu)(qiu)76，偶(ou)(ou)(ou)(ou)聯(lian)(lian)了(le)(le)agt捕(bu)(bu)獲(huo)(huo)(huo)抗(kang)體(ti)(ti)(ti)的(de)(de)微(wei)(wei)(wei)球(qiu)(qiu)(qiu)(qiu)26，偶(ou)(ou)(ou)(ou)聯(lian)(lian)了(le)(le)opn捕(bu)(bu)獲(huo)(huo)(huo)抗(kang)體(ti)(ti)(ti)的(de)(de)微(wei)(wei)(wei)球(qiu)(qiu)(qiu)(qiu)64，偶(ou)(ou)(ou)(ou)聯(lian)(lian)了(le)(le)ssod2捕(bu)(bu)獲(huo)(huo)(huo)抗(kang)體(ti)(ti)(ti)的(de)(de)微(wei)(wei)(wei)球(qiu)(qiu)(qiu)(qiu)39，等比例混(hun)合(he)(he)，使每種微(wei)(wei)(wei)球(qiu)(qiu)(qiu)(qiu)的(de)(de)終濃度分別為200個/μl，4℃避光保存(cun)。

6.含生物素標記(ji)的(de)檢(jian)測(ce)抗(kang)體(ti)混合液(ye)(ii混合液(ye))的(de)配(pei)制：分別取(qu)進行了生物素標記(ji)的(de)complementc4檢(jian)測(ce)抗(kang)體(ti)，sap檢(jian)測(ce)抗(kang)體(ti)，bdnf檢(jian)測(ce)抗(kang)體(ti)，cathepsind檢(jian)測(ce)抗(kang)體(ti)，ncam檢(jian)測(ce)抗(kang)體(ti)，pai-1檢(jian)測(ce)抗(kang)體(ti)，agt檢(jian)測(ce)抗(kang)體(ti)，opn檢(jian)測(ce)抗(kang)體(ti)，ssod2檢(jian)測(ce)抗(kang)體(ti)，加入(ru)ph7.4的(de)pbs，使每種(zhong)檢(jian)測(ce)抗(kang)體(ti)的(de)終濃度(du)分別為10μg/ml。

7.對(dui)(dui)照品(pin)：對(dui)(dui)照品(pin)包括陽性對(dui)(dui)照和(he)陰(yin)性對(dui)(dui)照。

8.血(xue)清樣品(pin)中9種ad蛋白標志物(wu)的(de)含量(liang)檢測

8.1血(xue)清(qing)(qing)樣品包(bao)括正常人血(xue)清(qing)(qing)樣本101份，ad患者(zhe)血(xue)清(qing)(qing)樣本98份。

8.2分別加(jia)入偶聯捕獲抗體的(de)微球混合液(ye)(ye)(i混合液(ye)(ye))于96孔(kong)酶(mei)標(biao)板(ban)，25μl/孔(kong)；

8.3加入標準品(std0、std1、std2、std3、std4、std5、std6)、質控品(陽性(xing)對(dui)照和(he)陰性(xing)對(dui)照)、病人血(xue)清(qing)樣本1-98號(hao)、正常人血(xue)清(qing)樣本1-101號(hao)，25μl/孔；

8.4用多(duo)孔板(ban)混勻儀混勻，蓋(gai)上(shang)蓋(gai)子，在4℃下避光孵(fu)育過夜；

8.5將多孔板放(fang)置在磁力架上30s，棄去每孔上清(qing)液；

8.6加入含生(sheng)物素標(biao)記的檢測抗體(ti)混合液(ye)(ye)(ii混合液(ye)(ye))，25μl/孔；蓋上蓋子，放置于多孔板(ban)振蕩器，在室溫(wen)下(xia)避(bi)光(guang)孵育60min；

8.7用pbs/1％bsa將(jiang)鏈霉親和素(su)-藻(zao)紅蛋白(bai)稀(xi)釋成濃(nong)度為200μg/ml的(de)(de)溶液，加(jia)稀(xi)釋好的(de)(de)鏈霉親和素(su)藻(zao)紅蛋白(bai)25μl到(dao)每個(ge)孔中，蓋上蓋子，放置于多孔板振(zhen)蕩器，在(zai)室溫下避光孵育30min；

8.8在液(ye)相芯(xin)片(pian)儀(yi)(flexmap3d，luminex公司)上，對(dui)反應的混合物(wu)進行分析，利(li)用(yong)milliplexanalyst5.0軟(ruan)件繪制(zhi)標(biao)準曲(qu)(qu)線，并根據標(biao)準曲(qu)(qu)線計算出(chu)檢(jian)測樣品中9種ad蛋白標(biao)志物(wu)的含量。

8.9檢(jian)測(ce)結果及(ji)分析，參見表1-3和圖1-11。

(1)表(biao)1為9種血清蛋(dan)白的檢測結(jie)果(guo)(中位數和范圍)，組(zu)(zu)間(jian)(jian)比較顯示(shi)(表(biao)1)：9種蛋(dan)白的組(zu)(zu)間(jian)(jian)差異均有統(tong)計學意義，其(qi)中ad癡呆組(zu)(zu)agt和sap含(han)量低于正(zheng)(zheng)常老年(nian)組(zu)(zu)，其(qi)余7種蛋(dan)白ad癡呆組(zu)(zu)高于正(zheng)(zheng)常老年(nian)組(zu)(zu)。

表(biao)19種蛋(dan)白的檢測結果和組間(jian)比較

(2)9種(zhong)蛋白(bai)鑒別ad癡(chi)呆(dai)與正(zheng)常老年人的(de)roc曲線分析結(jie)果顯示(表(biao)2，圖10)：9種(zhong)蛋白(bai)標志物對ad癡(chi)呆(dai)與正(zheng)常老年人具有一定鑒別能力，其(qi)中agt、bdnf和ncam的(de)敏(min)感(gan)性和歸類(lei)正(zheng)確率(lv)相對較高，達到70％以上。

表29種蛋白鑒別ad癡呆(dai)與正常老年人的(de)roc曲(qu)線分析

a.underthenonparametricassumption

b.nullhypothesis:truearea＝0.5

(3)通(tong)過(guo)判(pan)別(bie)分(fen)析建立如下判(pan)別(bie)函數(shu)(shu)，并計算判(pan)別(bie)函數(shu)(shu)分(fen)(即9種(zhong)蛋白組合分(fen))，正常對(dui)照與ad癡呆患者組合分(fen)的分(fen)布見圖(tu)11。

y＝0.513agt+0.356opn+0.543sap+0.398complementc4+0.435bdnf+0.307cathepsind+0.244ncam–0.338pai-1+0.038ssod2)

自身(shen)驗(yan)證(zheng)、交互驗(yan)證(zheng)和(he)roc曲線分(fen)析顯示判別函數分(fen)鑒(jian)別ad癡呆和(he)正(zheng)常老年人具有較好的敏感性、特異性和(he)歸類正(zheng)確率(表(biao)3，圖12)。

表(biao)39種蛋白組(zu)合(he)鑒別(bie)ad癡呆(dai)與正常老年人(ren)的(de)結果

以上結果表明，用本(ben)發(fa)明方法可(ke)以同(tong)時對9種血清(qing)ad標志(zhi)物(wu)進(jin)行(xing)聯(lian)合并行(xing)檢測。該9種血清(qing)ad標志(zhi)物(wu)對ad患者與正(zheng)常(chang)老年人的歸(gui)類正(zheng)確(que)率(lv)為(wei)87.4％，該方法的敏感性為(wei)86.7％，特異性為(wei)88.1％。可(ke)以作(zuo)為(wei)ad臨床診斷檢測的重要指(zhi)標。

在閱讀(du)了以(yi)上關于本發(fa)明的(de)陳述(shu)內(nei)容之后(hou)，本領域的(de)技術人員可以(yi)對本發(fa)明作各種修改(gai)或(huo)變化，這些等價(jia)形(xing)式同樣歸屬于本申請所附權利要(yao)求書(shu)中(zhong)所限定(ding)的(de)范圍(wei)。