一種高效擴增人類外周血nk細胞的簡易裝置的制造方法
【技術領域】
[0001]本實用新型屬于實驗用具領域，尤其是一種高效擴增人類外周血NK細胞的簡易
目.ο
【背景技術】
[0002]當前治療癌癥的主流臨床手段，如手術、放化療，盡管可對多種癌癥顯示不同的治療效果，但其適用范圍仍存在局限。如，手術方法對實體瘤較為有效，但對彌散性癌細胞導致的癌癥效果不佳且容易產生手術殘留；放化療可控制彌散性癌癥，但對病人身體產生的負擔也較大。ΝΚ細胞為非MHCI型分子限制型自然殺傷細胞，無需經歷抗原呈遞過程即可對多種腫瘤細胞顯示殺傷效果。ΝΚ細胞得益于其自然殺傷效果，可作為適用范圍很大的輔助治療手段，用于清除癌癥病人體內術后殘留或放化療后殘留的癌細胞，減少或避免癌癥復發或新的轉移灶產生，從而達到改善預后效果的目的。
[0003]傳統的ΝΚ細胞培養方法采用的是添加游離的細胞因子的液體培養基中，但由于ΝΚ細胞表面缺少IL — 15R α，其表面表達的IL — 15R β、IL — 15R γ對IL — 15親和力不強，故此方法無法實現ΝΚ細胞的大量體外擴增。另有ΝΚ細胞培養方法采用經慢病毒轉染的Κ562工程細胞系，該細胞系表面可表達⑶137L、IL 一 15、IL 一 15Ra、IL 一 21，通過接觸式細胞膜刺激激活NK細胞，達到高倍率擴增的目的，但經慢病毒轉染的K562工程細胞本身為癌細胞，需經過輻射滅活才可使用，有潛在的使用風險和技術要求較高、造價高昂等不利限制。為擺脫使用K562工程細胞系的限制而同時保證細胞培養過程中獲得足夠供給臨床使用的NK細胞總量，本發明提供了一種高效擴增人類外周血NK細胞的裝置。
【實用新型內容】
[0004]本實用新型的目的在于克服現有技術的不足之處，提供一種增殖效率高、結構簡單、實用方便的高效擴增人類外周血NK細胞的簡易裝置。
[0005]本實用新型實現目的的技術方案如下:
[0006]—種高效擴增人類外周血NK細胞的簡易裝置，包括一培養瓶，培養瓶一側制有瓶口，在培養瓶內兩相向側面固裝翅片，兩側的翅片交錯設置，在翅片上表面制有培養槽，在培養槽表面包裹一層助劑層。
[0007]而且，所述助劑層為細胞因子和激發單抗。
[0008]本實用新型的有益效果為:
[0009]1、本實用新型在原有細胞培養瓶的基礎上進了改進和加工，將培養瓶內對應的兩側壁制有翅板，兩側壁的翅板交叉設置，培養瓶內設置翅板能夠使NK細胞更多接觸到光滑的翅板表面，能夠激發NK細胞增殖，提高NK細胞的培養效率。
[0010]2、本申請通過固相結合細胞因子和特制的NK培養液對NK細胞進行共刺激，實現了 NK細胞表面的IL - 15和其它相關細胞因子受體的有效激活，從而獲得足夠供給臨床上NK細胞免疫療法需使用的細胞量，同時避免了使用K562工程細胞作為滋養細胞的潛在風險和高昂成本，使更多一般硬件水平和技術水平的實驗室也可進行NK細胞的高效體外擴增。
[0011]3、本申請提供的簡易裝置不同于常規培養瓶，該培養瓶內部固定有平行排列的凹心板狀結構，可有效增大培養瓶內表面積，同時在一定程度上防止培養懸浮細胞時常見的細胞沉降問題，保持培養瓶內細胞比較均勻的分布。
【附圖說明】
[0012]圖1為本實用新型的結構示意圖；
[0013]圖2為圖1的A-A向剖視圖；
[0014]圖3為圖1的B-B向剖視圖。
【具體實施方式】
[0015]下面結合附圖并通過具體實施例對本實用新型作進一步詳述，以下實施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本實用新型的保護范圍。
[0016]—種高效擴增人類外周血NK細胞的簡易裝置，包括一培養瓶1，培養瓶一側制有瓶口 2，在培養瓶內兩相向側面固裝翅片3，兩側的翅片交錯設置，在翅片上表面制有培養槽5，在培養槽表面包裹一層助劑層4，所述助劑層為細胞因子和激發單抗，所述細胞因子和激發單抗包括 CD137L、IL — 15、IL — 15Ra、IL — 21、MICA。
[0017]在培養瓶內壁及翅片本實用新型的操作過程如下:
[0018]成人外周血NK細胞分離培養。
[0019]采血體積60ml，III型抗凝劑抗凝，常規ficoll密度梯度力心分離PBMC，總PBMC計數1*108。流式細胞表型分析顯示⑶3-/⑶56+比例約為總PBMC的5%，即NK細胞數為5*106。
[0020]將分離后的PBMC以NKEM培養基洗滌一次后，重懸于100ml新鮮的NKEM，等量注入10個經CD137L、IL — 15、IL 一 15Ra、IL 一 21、MICA包被的低細胞粘附性75T培養瓶，包被濃度分別為 50ng/ml、300U/ml、50ng/ml、300U/ml、50ng/ml，并將其置于 37 °C 5 % C02培養箱中，每2天更換半量新鮮的NKEM。
[0021]培養第7天，有核細胞總數達到約1.1*108，FACS檢測結果⑶3_/⑶56+比例約為25%，此時更換新的經CD137L、IL 一 15、IL 一 15Ra、IL 一 21、MICA包被的低細胞粘附性75T培養瓶，并將其置于37°C 5% 0)2培養箱中，每2天更換半量新鮮的NKEM。
[0022]培養第14天，有核細胞總數達到約2.0*108，FACS檢測結果CD3-/CD56+比例約為50%。重新調整細胞密度為2.0*106/ml，并以每75T培養瓶10ml加入新的經CD137L、IL 一15、IL 一 15Ra、IL 一 21、MICA包被的低細胞粘附性75T培養瓶，每2天更換半量新鮮的NKEMo
[0023]培養第21天，有核細胞總數達到約1.1*109，FACS檢測結果⑶3_/⑶56+比例約為70%。此時已經可以收獲體外擴增的NK細胞用于臨床。
【主權項】
1.一種高效擴增人類外周血NK細胞的簡易裝置，包括一培養瓶，培養瓶一側制有瓶口，其特征在于:在培養瓶內兩相向側面固裝翅片，兩側的翅片交錯設置，在翅片上表面制有培養槽，在培養槽表面包裹一層助劑層。
【專利摘要】本實用新型涉及一種高效擴增人類外周血NK細胞的簡易裝置，包括一培養瓶，培養瓶一側制有瓶口，在培養瓶內兩相向側面固裝翅片，兩側的翅片交錯設置,在翅片上表面制有培養槽，在培養槽表面包裹一層助劑層。所述助劑層為細胞因子和激發單抗。本申請提供的簡易裝置不同于常規培養瓶，該培養瓶內部固定有平行排列的凹心板狀結構，可有效增大培養瓶內表面積，同時在一定程度上防止培養懸浮細胞時常見的細胞沉降問題，保持培養瓶內細胞比較均勻的分布。
【IPC分類】C12M1/24, C12M3/00
【公開號】CN204999921
【申請號】CN201520524723
【發明人】王之嬰, 朱江
【申請人】天津市康婷生物工程有限公司
【公開日】2016年1月27日
【申請日】2015年7月20日