使用羧基修飾的金納米顆粒的超靈敏閉管式比色環介導等溫擴增法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及特定核酸序列的簡單檢測方法。具體而言，本發明涉及將功能化的顆 粒，如羧基修飾的金納米顆粒，用于能夠產生焦磷酸離子的核酸擴增體系中，如用于環介導 的等溫擴增方法中，以高靈敏度、低成本檢測特定核酸序列的方法。
【背景技術】
[0002] 用簡單方式對特定核酸序列進行檢測，可以賦予現場護理（point-of-care)診斷 和現場病原體檢測更大的價值。 [1]具有獨特的比色性質的金納米顆粒（AuNP)非常適合這 項任務。[2]AuNP在可見光區域表現出特有的表面等離子體共振（SPR)吸收帶并且確切的頻 譜依賴于顆粒間的距離。具體地，顆粒凝集引起SPR吸收帶紅移并伴隨紅色到紫色的顏色 變化。這一性質已用于特定核酸序列的液相比色檢測。 M然而，先前所報道的檢測平臺并 不具備實際應用所需要的所有基本屬性，包括高靈敏度、簡單溫度控制、低成本以及無攜帶 污染。這些平臺絕大多數都使用寡核苷酸修飾的AuNP， [^d'4a'b'ig'6]影響可見顏色變化的一 個關鍵方面是靶序列的濃度必須在納摩爾水平。 [3a_d]對于實際應用，需要更高的靈敏度。因 此一直努力致力于將基于AuNP的比色檢測與靶擴增相耦合。在擴增方面，涉及簡單溫度控 制的等溫技術 [5a_g]比熱循環技術更可取。[4a，b，6]另一個主要問題是，對于所有的等溫 [5]輔 助擴增平臺和大多數熱循環[4](存在3個例外[6])輔助擴增平臺而言，擴增后不可避免地會 開管添加 AuNP探針（寡核苷酸修飾的和未修飾的兩種），這存在高風險的攜帶污染。AuNP 探針與擴增反應的不相容性是由于熱[6b'7]和/或二硫蘇糖醇誘導的[8]寡核苷酸從AuNP上 解吸，之后酶非特異性地吸附到AuNP表面上（或只是后者作用于未修飾的AuNP [6b'9])。在3 個閉管平臺（全部是基于熱循環和寡核苷酸修飾的AuNP)中，具有實用靈敏度的2個需要 特別制備的寡核苷酸修飾的AuNP (二氧化娃包被的[6b]或三硫醇化（trithiolated)的寡核 苷酸[6e])。另外，寡核苷酸修飾的AuNP的另一個問題是巰基修飾的寡核苷酸成本高。
[0003] 環介導等溫擴增法，英文名稱為 loop-mediated isothermal amplification，是 一種新型的核酸擴增方法，其特點是針對靶基因的6個區域設計4種或者6種特定引物，在 鏈置換DNA聚合酶的作用下，60-65°C恒溫擴增，15-60分鐘左右即可實現10-9-10- 10倍的 核酸擴增，具有操作簡單、特異性強、產物易檢測等特點。然而，環介導等溫擴增方法也存在 缺點，由于其靈敏度高，一旦開蓋容易形成攜帶污染。
[0004] 因此，本領域仍然需要低成本、高靈敏度、無攜帶污染的檢測特定核酸序列的方 法。

【發明內容】

[0005] 本發明的第一方面涉及一種試劑盒，其包括：1)功能化的顆粒，其具有可用于能夠 產生焦磷酸離子的核酸擴增體系的比色和/或沉淀和/或熒光檢測的性質，2)用于通過能 夠產生焦磷酸離子的核酸擴增體系檢測樣品中特定核酸序列存在的擴增引物，3)用于能夠 產生焦磷酸離子的核酸擴增體系的其他組分和裝置。
[0006] 在一些實施方式中，顆粒是具有任何依賴于粒子間距離來控制比色性質類的材 料，如金納米顆粒或銀納米顆粒；或者
[0007] 顆粒是任何能通過與Mg2+螯合來控制顆粒分散和沉淀的材料，如金顆粒、銀顆粒、 磁性顆粒、碳納米管或氧化石墨烯；或者
[0008] 顆粒是具有任何依賴于粒子間距離來控制熒光性質類的材料，如量子點、熒光染 料參雜的二氧化硅納米顆粒。
[0009] 在一些實施方式中，用于功能化的顆粒的功能化分子同時具有可以固定到顆粒的 官能團如巰基、氨基，和可以與Mg 2+形成螯合復合物且螯合的Mg2+可被P2O廣提取出的官能 團如羧基、羥基、氨基、碳酸根、硫酸根、氟、磷酸根、硫代硫酸根。
[0010] 在另一些實施方式中，功能化的顆粒的功能化分子是簡單的碳鏈，如11-巰基 十一烷酸（MUA)，或者是多聚物如聚乙二醇。
[0011] 在某些實施方式中，功能化的顆粒是功能化的納米顆粒，如功能化的金納米顆粒 (AuNP)，其中納米顆粒粒徑范圍可以為，例如1-100納米，如1-80納米，如2-60納米，如 5-50納米，如10-30納米，如15-20納米，如1-5納米，如2-6納米，如60-80納米，只要所述 納米顆粒具有任何依賴于粒子間距離來控制比色和熒光的性質即可。
[0012] 在某些實施方式中，功能化的顆粒的功能化分子可以單一或者多種同時固定到 AuNP表面。
[0013] 在某些實施方式中，功能化的納米顆粒為量子點（QD)，QD具有熒光標記性質，其 具有至少一個化學基團以與Mg 2+形成螯合復合物，例如量子點表面經過MUA功能化后形成 MUA-QD，可與MUA功能化的金納米顆粒（MUA-AuNP) -起存在以控制熒光強度來實現特定核 酸序列的檢測，其中MUA-QD作為報告劑，而MUA-AuNP作為猝滅劑。除了 QD以外，其它熒光 材料也可以用于本發明的體系。
[0014] 在一些實施方式中，能夠產生焦磷酸離子的核酸擴增體系是環介導等溫擴增 (LAMP)。其它會產生焦磷酸離子的擴增系統也可以用于功能化顆粒結合。
[0015] 在一些實施方式中，用于能夠產生焦磷酸離子的核酸擴增體系的其他組分和裝置 是本領域已知的用于能夠產生焦磷酸離子的核酸擴增體系的其他組分和裝置，如用于LAMP 的其他組分和裝置。
[0016] 本發明的第二方面涉及如上所述的試劑盒在現場護理和現場核酸檢測中的用途。
[0017] 在某些實施方式中，所述用途包括臨床診斷、食品安全檢測、環境監測和生物武器 劑檢測。
[0018] 本發明的第三方面涉及如上述第一方面中所限定的功能化的顆粒用于能夠產生 焦磷酸離子的核酸擴增體系以閉管式檢測樣品中特定核酸序列的用途，其中能夠產生焦磷 酸離子的核酸擴增體系如環介導等溫擴增（LAMP)。
[0019] 本發明的第四方面涉及一種檢測樣品中特定核酸序列的方法，其包括步驟：
[0020] a)獲得待測的樣品或其核酸；
[0021] b)針對待檢測樣品中的特定核酸序列設計的用于能夠產生焦磷酸離子的核酸擴 增體系等溫擴增（LAMP)的引物，或者使用已知的用于該特定核酸序列的用于能夠產生焦磷 酸離子的核酸擴增體系的引物；
[0022] c)將步驟a)的樣品或其核酸、步驟b)的引物、功能化的顆粒、用于能夠產生焦磷 酸離子的核酸擴增體系的其他組分以適當量混合并在其相應裝置中反應，功能化的顆粒具 有可用于能夠產生焦磷酸離子的核酸擴增體系的比色和/或沉淀和/或熒光檢測的性質， 其中步驟a)的樣品或其核酸、步驟b)的引物、功能化的顆粒、用于能夠產生焦磷酸離子的 核酸擴增體系的其他組分可以依次地、兩種或多種預混合地或同時地加入總反應體系中；
[0023] d)可選地，觀察反應結果，判斷樣品中是否有特定核酸序列的存在。
[0024] 在某些實施方式中，顆粒是具有任何依賴于粒子間距離來控制比色性質類的材 料，如金納米顆粒或銀納米顆粒；或者
[0025] 顆粒是任何能通過與Mg2+螯合來控制顆粒分散和沉淀的材料，如金顆粒、銀顆粒、 磁性顆粒、碳納米管或氧化石墨烯；或者
[0026] 顆粒是具有任何依賴于粒子間距離來控制熒光性質類的材料，如量子點、熒光染 料參雜的二氧化硅納米顆粒。
[0027] 在某些實施方式中，用于功能化的顆粒的功能化分子同時具有可以固定到顆粒的 官能團如巰基、氨基，和可以與Mg 2+形成螯合復合物且螯合的Mg2+可被P2O廣提取出的官能 團如羧基、羥基、氨基、碳酸根、硫酸根、氟、磷酸根、硫代硫酸根。
[0028] 在一個實施方式中，功能化的顆粒的功能化分子是簡單的碳鏈如11-巰基十一烷 酸（MUA)，或者是多聚物如聚乙二醇。
[0029] 在某些實施方式中，功能化的顆粒是功能化的納米顆粒，如功能化的金納米顆粒 (AuNP)，其中納米顆粒粒徑范圍為例如1-100納米，如1-80納米，如2-60納米，如5-50納 米，如10-30納米，如15-20納米，如1-5納米，如2-6納米，如60-80納米，只要所述納米顆 粒具有任何依賴于粒子間距離來控制比色和熒光的性質即可。
[0030] 在某些實施方式中，功能化的顆粒的功能化分子可以單一或者多種同時固定到 AuNP表面。
[0031] 在某些實施方式中，功能化的納米顆粒為量子點（QD)，QD具有熒光標記性質，其 具有至少一個化學基團以與Mg 2+形成螯合復合物，例如量子點表面經過MUA功能化后形成 MUA-QD，可與MUA功能化的金納米顆粒（MUA-AuNP) -起存在以控制熒光強度來實現特定核 酸序列的檢測，其中MUA-QD作為報告劑，而MUA-AuNP作為猝滅劑。除了 QD以外，其它熒光 材料也可以用于本發明的體系。
[0032] 在一個實施方式中，能夠產生焦磷酸離子的核酸擴增體系是環介導等溫擴增 (LAMP)。其它會產生焦磷酸離子的擴增系統也可以用于功能化顆粒結合。
[0033] 在某些實施方式中，用于能夠產生焦磷酸離子的核酸擴增體系的其他組分和裝置 是本領域已知的用于能夠產生焦磷酸離子的核酸擴增體系的其他組分和裝置，如用于LAMP 的其他組分和裝置。
[0034] 本發明的上述檢測方法很容易應用于現場護理和現場核酸檢測，其具有所有的理 想特征：
[0035] ?簡單溫度控制（一次性暖包即可滿足實驗條件）。
[0036] ?用肉眼即可對結果進行判斷和解釋。
[0037] ?易于試劑運輸和儲存（用于LAMP的凍干試劑）和高魯棒性（用于LAMP的部分 處理或未經處理的樣品）。
[0038] ?無攜帶污染的隱憂。
[0039] ?高靈敏度（在所有報道的基于AuNP的比色核酸檢測平臺中最靈敏）。
[0040] ?低成本（MUA相對于巰基修飾的寡核苷酸便宜）。
【附圖說明】
[0041] 圖1、通過鎂離子（Mg2+)