本發明屬(shu)于電(dian)化學生物傳感器的技術(shu)領域，涉及一(yi)種(zhong)導電(dian)金剛石(shi)膜(mo)、金納米顆粒、適(shi)配體和(he)巰(qiu)基己醇的復(fu)合材(cai)料傳感器及其制備(bei)方法。

背景技術：

農藥、醫藥等有機污染物的存在嚴重影響著水生態系統和人類健康。過去幾十年，雙酚A等內分泌干擾物引起了全世界的廣泛關注。雙酚A廣泛應用到化工領域，主要用于塑料的制造，如食品包裝、飲料瓶、儲存設備、餐具、奶瓶、醫療器械等。然而，雙酚A的毒性會導致人類發育障礙、流產、冠心病和乳腺癌等等。因此許多國家已經禁止奶瓶以及其他包裝中含有雙酚A。歐洲食品安全局公布的目前每日攝取量不高于4μg/kg。即使在非常低的濃度(甚至低于4.4×10^–12mol/L)都可以引起異常的生理變化。雙酚A具有積累作用，在極低痕量的情況下，檢測和發現雙酚A，可以避免長期積累引起環境和人體危害。目前常見的雙酚A檢測手段包括液相色譜法、液相色譜-質譜聯用、氣相色譜-質譜聯用、酶聯免疫吸附法、毛細管電泳法、固相萃取法等。這些方法在檢測過程中會產生大量有害的有機溶劑，需要復雜的預處理過程，儀器設備昂貴，而且大部分的檢測水平都集中在10^–9～10^–12mol/L。因此(ci)設計和制(zhi)作一(yi)種更靈敏的雙(shuang)酚A檢測方法和傳感(gan)器很有(you)必(bi)要。

近幾年來，電化學方法由于其簡單、靈敏度高、試劑量小、動態范圍寬、檢測限低、儀器成本低等優勢，是電化學檢測的重要方法。合適的傳感器材料和結構的選擇非常重要。通常使用玻碳、金或石墨等材料并表面加以修飾制作傳感器。但雙酚A的電化學活性相對較弱，其氧化產物易于附著到這些傳感器表面，降低了傳感器的效率和重復性。因此為了進一步減少雙酚A的檢測限，合適的傳感器材料和結構是關鍵。硼摻雜金剛石具有獨特的化學惰性、寬電位窗口、極低的背景電流、高電流密度、極好的電化學穩定性、高抗垢能力等優點。利用硼摻雜金剛石表面終端改性可取得2.1×10^–7mol/L的雙酚A檢測水平，利用絡氨酸酶修飾可降低至1×10^–11mol/L濃度。但尚沒有達到低于10^-12mol/L的相關方法和報道(dao)。

和本發明接近的現有技術是公開號為CN 104267084A，名稱為“檢測雙酚的電化學傳感器及其制備方法和應用”的專利申請，制備方法是稱取石墨烯8～15mg,量取0.1～0.3ml 1-丁基-3-甲基咪哩六氟磷酸鹽分散于1～5ml的二甲基甲酞胺中超聲70～120min,取5～12ul懸濁液滴涂在玻碳電極表面,紅外燈烤15～25min,與電化學工作站連接。檢測線性范圍在2×10^-8～2×10^-6mol/L，檢測限8×10^-9mol/L，高于本申請發明中的檢測限(5～7×10^-15mol/L)。

技術實現要素：

本發明要(yao)解決的(de)(de)技(ji)術問(wen)題是(shi)，通過(guo)功能(neng)材料(liao)的(de)(de)選(xuan)擇和特殊結(jie)構的(de)(de)設(she)計，將金納米顆粒、適配(pei)體(ti)、巰基(ji)己醇和導電金剛石膜相結(jie)合，獲得(de)一(yi)種檢(jian)測限低、重復性好(hao)、靈敏度高、特異(yi)性強、成(cheng)本低的(de)(de)一(yi)種新的(de)(de)雙(shuang)酚A適配(pei)體(ti)傳感器。

本發明在硼摻雜金(jin)(jin)剛石膜(mo)上通過(guo)離子(zi)濺射沉(chen)積金(jin)(jin)膜(mo)，并在管(guan)式(shi)爐(lu)中退火(huo)得到金(jin)(jin)納米(mi)顆粒，以增加電極的(de)(de)電子(zi)傳輸能(neng)力。最后利(li)用適配(pei)體和(he)(he)巰基己醇自組裝，以提高傳感器的(de)(de)特異性(xing)識別能(neng)力和(he)(he)檢(jian)測水平。本發明雙(shuang)酚A適配(pei)體傳感器的(de)(de)具體技術(shu)方案(an)如下。

一種用于檢測(ce)雙酚A的(de)(de)適配(pei)(pei)體(ti)(ti)傳感器，以(yi)摻硼(peng)金剛(gang)石膜為基底(di)，摻硼(peng)金剛(gang)石膜1上(shang)沉(chen)積有(you)金納米(mi)顆粒(li)2，在金納米(mi)顆粒(li)2上(shang)自組裝適配(pei)(pei)體(ti)(ti)3，并(bing)有(you)巰基己醇4占據金納米(mi)顆粒(li)上(shang)的(de)(de)適配(pei)(pei)體(ti)(ti)遺留(liu)的(de)(de)空白位(wei)點；所(suo)述的(de)(de)適配(pei)(pei)體(ti)(ti)3，結構為

5'-SH-(CH2)6-CCG GTG GGT GGT CAG GTG GGA TAG CGT TCC GCG TAT GGC CCA GCG CAT CAC GGG TTC GCA CCA-3'。

巰基(ji)己醇具(ju)體(ti)的是6-巰基(ji)己-1-醇。

所述的金納米顆粒，平均尺寸5～10nm，金納米顆粒密度10¹¹～10¹²/cm²。

本發(fa)明的(de)(de)用于(yu)檢(jian)測雙(shuang)酚(fen)A的(de)(de)適配體(ti)傳感器具(ju)有(you)檢(jian)測限低(di)、重復性(xing)好、靈敏度高、特異性(xing)強、成本低(di)的(de)(de)特點。

本發(fa)明的(de)(de)(de)用于(yu)檢(jian)測雙(shuang)酚A的(de)(de)(de)適配體(ti)傳感器(qi)制(zhi)備方(fang)(fang)法的(de)(de)(de)具體(ti)技(ji)術方(fang)(fang)案如下(xia)。

一種(zhong)用(yong)于檢測雙酚(fen)(fen)A的(de)(de)適(shi)(shi)配體傳(chuan)感(gan)器的(de)(de)制備方法(fa)，通過微(wei)波等離子體化學氣相沉積或/和熱絲化學氣相沉積法(fa)在(zai)硅襯底上生長摻(chan)(chan)(chan)硼金(jin)剛(gang)石(shi)(shi)(shi)膜；然后在(zai)摻(chan)(chan)(chan)硼金(jin)剛(gang)石(shi)(shi)(shi)膜表(biao)面(mian)利用(yong)電子濺(jian)射(she)(she)或磁控(kong)濺(jian)射(she)(she)方法(fa)濺(jian)射(she)(she)金(jin)膜；將(jiang)所得的(de)(de)金(jin)膜/摻(chan)(chan)(chan)硼金(jin)剛(gang)石(shi)(shi)(shi)膜在(zai)高溫管式(shi)爐中，800～850℃退火0.5～2分鐘，去離子水清洗(xi)，得到金(jin)納米(mi)顆粒/摻(chan)(chan)(chan)硼金(jin)剛(gang)石(shi)(shi)(shi)膜結構；將(jiang)2～2.5μmol/L的(de)(de)適(shi)(shi)配體置(zhi)于干燥的(de)(de)金(jin)納米(mi)顆粒/摻(chan)(chan)(chan)硼金(jin)剛(gang)石(shi)(shi)(shi)膜表(biao)面(mian)，于37～39℃下密閉8～16小時；在(zai)去離子水浸(jin)泡清洗(xi)2～3小時，再浸(jin)入1mmol/L的(de)(de)巰基己(ji)醇溶液中修飾1～3小時，得到用(yong)于檢測雙酚(fen)(fen)A的(de)(de)適(shi)(shi)配體傳(chuan)感(gan)器。

可以直接使用(yong)(yong)巰基修飾適配(pei)體(ti)(ti)制得用(yong)(yong)于(yu)檢(jian)測雙酚A的適配(pei)體(ti)(ti)傳(chuan)感(gan)器。具體(ti)(ti)的技術方(fang)案如下。

一種用(yong)于(yu)檢測(ce)雙(shuang)(shuang)酚(fen)A的適配體(ti)傳感器的制備方法(fa)，通過微波等離子(zi)體(ti)化(hua)學氣(qi)(qi)相(xiang)沉積或/和熱絲化(hua)學氣(qi)(qi)相(xiang)沉積法(fa)在硅襯(chen)底上生長摻(chan)硼(peng)金(jin)(jin)剛(gang)石(shi)膜(mo)(mo)；然后(hou)在摻(chan)硼(peng)金(jin)(jin)剛(gang)石(shi)膜(mo)(mo)表面利用(yong)電子(zi)濺射或磁控濺射方法(fa)濺射金(jin)(jin)膜(mo)(mo)；將所得(de)的金(jin)(jin)膜(mo)(mo)/摻(chan)硼(peng)金(jin)(jin)剛(gang)石(shi)膜(mo)(mo)在高溫(wen)管(guan)式爐中，800～850℃退(tui)火0.5～2分鐘，去離子(zi)水清洗，得(de)到(dao)金(jin)(jin)納(na)(na)米顆粒/摻(chan)硼(peng)金(jin)(jin)剛(gang)石(shi)膜(mo)(mo)結構；將2～2.5μmol/L的巰基修(xiu)飾適配體(ti)置于(yu)干燥的金(jin)(jin)納(na)(na)米顆粒/摻(chan)硼(peng)金(jin)(jin)剛(gang)石(shi)膜(mo)(mo)表面，于(yu)37～39℃下密閉(bi)8～16小(xiao)時，用(yong)去離子(zi)水沖洗干凈，得(de)到(dao)用(yong)于(yu)檢測(ce)雙(shuang)(shuang)酚(fen)A的適配體(ti)傳感器。

在上述的兩種制備過程中，所述的濺射金膜，厚度最好是10～30nm，濺射時間可以是5～8秒。所述的金納米顆粒，平均尺寸5～10nm，金納米顆粒密度10¹¹～10¹²/cm²。

在上述的兩(liang)種制備過程中(zhong)，所述的置于，可(ke)以(yi)是(shi)滴加，也可(ke)以(yi)是(shi)浸泡(pao)。

本申請制備的雙酚A適配體傳感器靈敏度高，特異性好。實驗測量結果表明，所得傳感器在1.0×10^-14～1.0×10^-9mol/L濃度范圍具有良好的線性關系，檢測限達到5～7×10^-15mol/L飛摩水平。現有的傳統檢測方法檢測最低極限在10^-12mol/L，檢測過程中會產生大量有機溶液，預處理復雜、價格昂貴。本發明可以得到10^-15mol/L檢(jian)測限(xian)，檢(jian)測能力(li)遠高于目前報道雙酚A傳感器(qi)，在應用(yong)于牛奶(nai)實際樣(yang)品中(zhong)獲得(de)良好(hao)的回收(shou)率。

本發明中(zhong)設計的(de)(de)金剛石與適(shi)(shi)配(pei)體結(jie)合的(de)(de)結(jie)構，用于(yu)(yu)雙(shuang)酚A的(de)(de)檢(jian)(jian)測(ce)尚屬首次，摻硼金剛石的(de)(de)選擇以及合理的(de)(de)結(jie)構設計有利于(yu)(yu)提高雙(shuang)酚A檢(jian)(jian)測(ce)能力。這種新(xin)型雙(shuang)酚A適(shi)(shi)配(pei)體傳感器(qi)(巰(qiu)基(ji)己醇/適(shi)(shi)配(pei)體/金納米/金剛石復(fu)(fu)合材料(liao))作為雙(shuang)酚A檢(jian)(jian)測(ce)材料(liao)，靈(ling)敏度(du)高、特異性(xing)強、重(zhong)復(fu)(fu)性(xing)好，檢(jian)(jian)測(ce)限低，是(shi)本發明專利所(suo)涉及的(de)(de)主要內容和重(zhong)要創(chuang)新(xin)點。并且制(zhi)備方法工藝簡(jian)單(dan)，成本低廉。隨著對檢(jian)(jian)測(ce)便捷需(xu)求的(de)(de)日益增加，檢(jian)(jian)測(ce)快速，效率(lv)高，穩定性(xing)強的(de)(de)新(xin)一代雙(shuang)酚A傳感器(qi)變得意義重(zhong)大。

附圖說明

圖1為(wei)(wei)本發明用于(yu)檢測(ce)雙(shuang)酚(fen)A的適配體傳感(gan)器的結(jie)構示意圖。圖中，1為(wei)(wei)摻硼(peng)金(jin)剛石膜，2為(wei)(wei)金(jin)納米顆粒，3為(wei)(wei)適配體，4為(wei)(wei)巰基(ji)己醇(chun)。

圖(tu)(tu)2為實施例1制得的金(jin)膜(mo)/摻(chan)硼(peng)金(jin)剛石膜(mo)掃(sao)描(miao)電子顯微鏡形貌圖(tu)(tu)。

圖3為金納米顆粒/摻硼金剛石膜高(gao)倍數(shu)形貌(mao)圖。

圖4為實施例1的適配體傳感器(qi)的制備過程及檢(jian)測原理示意圖。

圖(tu)5為本(ben)發明的(de)(de)(de)適配體傳感器的(de)(de)(de)阻抗與雙(shuang)酚A的(de)(de)(de)濃度(du)對應(ying)關系(xi)的(de)(de)(de)測試(shi)圖(tu)。

圖(tu)6為本發(fa)明的(de)(de)適配體傳(chuan)感器(qi)的(de)(de)相對阻抗變化與雙(shuang)酚A的(de)(de)濃度(du)對應關系的(de)(de)曲線圖(tu)。

圖7為本發明的適配體傳感器與不(bu)同干擾物作用后的相對阻(zu)抗響應(ying)柱(zhu)狀圖。

具體實施方式

以下(xia)結合(he)附圖與(yu)實施例(li)(li)對(dui)本申請作進一(yi)步詳細描述，需要指出的(de)是，以下(xia)所(suo)述實施例(li)(li)旨(zhi)在便(bian)于對(dui)本申請的(de)理解，而對(dui)其不(bu)起(qi)任何(he)限定作用。

實施例1：用于檢測(ce)雙酚A的適配體傳(chuan)感(gan)器(qi)的制備(1)

導(dao)電金剛(gang)(gang)石(shi)(shi)膜(mo)(mo)(硼(peng)摻雜)通過(guo)微波等離子體(ti)化學氣相沉積(ji)設備沉積(ji)到(dao)硅襯底上。然后在金剛(gang)(gang)石(shi)(shi)表面(mian)離子濺射金靶6秒，得到(dao)金膜(mo)(mo)/摻硼(peng)金剛(gang)(gang)石(shi)(shi)膜(mo)(mo)結構(gou)(見圖2)，樣品轉移(yi)至高溫管式(shi)爐中，高溫退火(huo)1分鐘，并去離子水清洗，獲得金納米顆粒/金剛(gang)(gang)石(shi)(shi)膜(mo)(mo)結構(gou)(見圖3)。將2μmol/L的(de)適(shi)配體(ti)滴(di)加到(dao)金納米顆粒/摻硼(peng)金剛(gang)(gang)石(shi)(shi)膜(mo)(mo)表面(mian)，于37～39℃下密閉過(guo)夜(ye)，用(yong)緩沖液(ye)沖洗干(gan)凈(jing)；隨后將所(suo)得電極浸入1mmol/L的(de)巰(qiu)基己(ji)醇(6-巰(qiu)基己(ji)-1-醇(MCH))溶液(ye)中修飾2小時，得到(dao)用(yong)于檢測(ce)雙酚A的(de)適(shi)配體(ti)傳感器。

所述(shu)的適配(pei)體，是從隨機單鏈寡聚(ju)核(he)(he)苷酸文庫中篩選得到的寡核(he)(he)苷酸序(xu)列或者(zhe)短的多肽(tai)，能特異性結合蛋白，長度(du)一般為25～60個(ge)核(he)(he)苷酸，可以是DNA或者(zhe)是RNA。本實(shi)施(shi)例選擇的雙(shuang)酚A適配(pei)體具體結構是5'-SH-(CH2)6-CCG GTG GGT GGT CAG GTG GGA TAG CGT TCC GCG TAT GGC CCA GCG CAT CAC GGG TTC GCA CCA-3'。

該適配體傳感器的檢測線可以達到5～7×10^-15mol/L。

實施例2：用于檢測雙酚A的適配體(ti)傳(chuan)感器的制(zhi)備(2)

硼摻雜導電(dian)金(jin)(jin)(jin)剛(gang)石(shi)(shi)膜通過(guo)微波等離(li)子(zi)體(ti)化學氣相沉(chen)(chen)積或/和熱絲化學氣相沉(chen)(chen)積法(fa)沉(chen)(chen)積到(dao)硅襯底上。然(ran)后在導電(dian)金(jin)(jin)(jin)剛(gang)石(shi)(shi)表面利用(yong)電(dian)子(zi)濺(jian)射或磁控濺(jian)射方法(fa)濺(jian)射一層金(jin)(jin)(jin)膜，時間(jian)5～8秒，厚度(du)10～30nm。將所得金(jin)(jin)(jin)膜/金(jin)(jin)(jin)剛(gang)石(shi)(shi)膜在高(gao)溫(wen)管式爐中，800～850℃退火1～2分鐘，并去(qu)離(li)子(zi)水(shui)(shui)清(qing)洗，獲得金(jin)(jin)(jin)納米顆(ke)(ke)粒/金(jin)(jin)(jin)剛(gang)石(shi)(shi)膜結構(gou)(參見(jian)圖3)。在密(mi)閉(bi)容器(qi)中，將2～2.5μmol/L的巰基修(xiu)飾適配體(ti)分散到(dao)干燥的金(jin)(jin)(jin)納米顆(ke)(ke)粒/金(jin)(jin)(jin)剛(gang)石(shi)(shi)表面，于37～39℃下(xia)過(guo)夜組裝，在去(qu)離(li)子(zi)水(shui)(shui)浸泡(pao)清(qing)洗2～3小時，得到(dao)雙酚(fen)A適配體(ti)傳感器(qi)。

本實施例的巰基修飾適配體可選擇上海生物工程股份有限公司合成的產品。本實施例與實施例1制得的雙酚A適配體傳感器性能基本相同，該適配體傳感器的檢測線可以達到10^-13mol/L。

實(shi)施(shi)例3：用于檢測(ce)雙酚A的(de)(de)適配體傳感器的(de)(de)制(zhi)備(3)

在實(shi)施例1的基礎上，管式爐燒結也高溫退火可以是10～30秒；6-巰基己-1-醇(MCH)溶液(ye)中修飾(shi)也可以是浸泡0.5～1小時時間。

實施例(li)4：用(yong)于檢測雙(shuang)酚A的適配體傳感器(qi)的性能測試

從圖2的掃描電子顯微鏡圖像中可以看到，制備的導電多晶金剛石膜平均尺寸在10μm，金納米顆粒均勻的沉積在其表面，密度約4×10¹¹/cm²(參(can)見圖3)，為適配體提供豐(feng)富的活性結(jie)合(he)位點。

雙酚(fen)(fen)A適(shi)(shi)(shi)配(pei)(pei)體傳感器的(de)制備過(guo)程和檢測(ce)(ce)原理(li)(li)如圖(tu)4所示。通過(guo)等離子濺射(she)方法(fa)在(zai)硼(peng)摻雜金(jin)(jin)剛(gang)石電極(ji)表面(mian)濺射(she)一(yi)層金(jin)(jin)膜(圖(tu)4中(zhong)(zhong)(zhong)a-b)；后在(zai)管式爐(lu)中(zhong)(zhong)(zhong)進行熱處(chu)理(li)(li)，形(xing)成金(jin)(jin)納米顆(ke)粒(圖(tu)4中(zhong)(zhong)(zhong)c)；將上述電極(ji)浸泡在(zai)適(shi)(shi)(shi)配(pei)(pei)體溶液(ye)中(zhong)(zhong)(zhong)，適(shi)(shi)(shi)配(pei)(pei)體會(hui)在(zai)Au-S共價(jia)鍵的(de)作用(yong)(yong)下，嫁接到金(jin)(jin)納米顆(ke)粒上(圖(tu)4中(zhong)(zhong)(zhong)d)；隨(sui)后用(yong)(yong)巰基己醇封閉占據空(kong)白(bai)位點，以(yi)減(jian)小非特(te)異性(xing)吸(xi)附(圖(tu)4中(zhong)(zhong)(zhong)e)，至此用(yong)(yong)于(yu)檢測(ce)(ce)雙酚(fen)(fen)A的(de)適(shi)(shi)(shi)配(pei)(pei)體傳感器制備完成。當不同濃度(du)雙酚(fen)(fen)A接觸檢測(ce)(ce)雙酚(fen)(fen)A的(de)適(shi)(shi)(shi)配(pei)(pei)體傳感器時，電極(ji)上的(de)適(shi)(shi)(shi)配(pei)(pei)體會(hui)與其特(te)異性(xing)結合，產(chan)生不同的(de)阻抗(kang)變化(圖(tu)4中(zhong)(zhong)(zhong)f)。

利用制備的用于檢測雙酚A的適配體傳感器對一系列濃度的雙酚A進行了阻抗測試，如圖5所示。傳感器的阻抗隨著雙酚A濃度的增加而增加，直到達到最大值。定義(R_ct-R_ct0)除以R_ct0作為相對阻抗(即(R_ct-R_ct0)/R_ct0，R_ct代表雙酚A適配體傳感器與一定濃度雙酚A結合后的阻抗值，R_ct0代表雙酚A適配體傳感器的初始阻抗)。由此可以得到相對阻抗(％)與雙酚A濃度的對數線性關系，如圖6所示。線性方程為相對阻抗(％)＝301.3+17.7logC,R²＝0.995，C為雙酚A的濃度，R為相關系數。通過三倍信噪比進行計算出傳感器的檢測限為7.2×10^-15M。相對阻抗變化率與雙酚A濃度的對數呈線性關系，范圍為1.0×10^-14～1.0×10^-9mol/L。

實施例5：用于檢測雙酚A的(de)適配體(ti)傳感器的(de)特異性(xing)測試

為了研究傳感器的特異性，選取了5種和雙酚A結構類似的干擾物(雌二醇、雌三醇、鄰苯二甲酸二乙酯、間苯二酚和壬基酚)，進行干擾性實驗。在0.5×10^-12mol/L雙(shuang)(shuang)酚A體(ti)系中，分別加入100倍于雙(shuang)(shuang)酚A濃度(du)的干(gan)(gan)擾物，進行阻(zu)抗測試。定(ding)義雙(shuang)(shuang)酚A阻(zu)抗值為100％，其余干(gan)(gan)擾物阻(zu)抗相(xiang)較于雙(shuang)(shuang)酚A阻(zu)抗折算為對應(ying)百分比，圖(tu)7中可以(yi)看到，5種(zhong)干(gan)(gan)擾物相(xiang)對相(xiang)應(ying)變(bian)化(hua)在(zai)-2％～4.5％之間，表(biao)明(ming)干(gan)(gan)擾物對傳感器(qi)檢測的影響很(hen)小，即使5種(zhong)干(gan)(gan)擾物全部混合在(zai)體(ti)系中，相(xiang)應(ying)變(bian)化(hua)依然小于13％，證明(ming)了傳感器(qi)在(zai)復雜環境下(xia)的應(ying)用前景。